Способ диагностики ранних проявлений дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации бензолом Российский патент 2024 года по МПК G01N33/68 G01N33/58 C12Q1/6806 C12Q1/6827 C12Q1/686 C12Q1/6876 C12Q1/6883 

Изобретение относится к области профилактической медицины, экологии человека, педиатрии и может быть использовано для выявления у детей ранних проявлений дискинезии желчевыводящих путей, ассоциированной с воздействием бензола.

В последние годы в индустриально развитых странах отмечена тенденция к повышению частоты диагностики дисфункции желчных путей одновременно с увеличением распространенности других функциональных заболеваний органов пищеварения. Это можно объяснить особенностями стиля жизни современных жителей развитых стран (чрезмерное содержание углеводов в пище и недостаточная двигательная активность, в результате чего повышается риск образования литогенной желчи и нарушается моторика желчных путей), «эпидемией» ожирения, а также влиянием на организм загрязняющих веществ среды обитания, в частности, бензола.

Дискинезия жёлчных путей - это нарушение оттока жёлчи, вызванное недостаточным сокращением гладкой мускулатуры жёлчного пузыря, жёлчных протоков и сфинктеров. По международной квалификации болезней (МКБ-10) это заболевание классифицируется как К82.8.0 - Дискинезия желчного пузыря и желчных путей. Проявляется болями в правом подреберье, тошнотой, рвотой и ощущением распирания в животе.

Дискинезия желчевыводящих путей (далее - ДЖВП) относится к функциональным расстройствам. При таких расстройствах нарушается нормальная работа организма, в данном случае страдает пищеварение. 

В уровне техники известно применение в качестве диагностических критериев для различных заболеваний использование по отдельности наличие полиморфизма гена аддуцина ADD1, или гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1, или гена детоксикации N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2. Информация об указанных известных решениях приведена ниже.

1. Диагностический критерий – полиморфизм гена аддуцина ADD1:

- из патента РФ № 2766732 известен «Способ определения предрасположенности к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин, реализуемой избыточной контаминацией гексаном»: производят отбор пробы мочи, крови и буккального эпителия. Проводят генотипирование полиморфизмов генов ADRB2 Arg16Gly (rs1042713) и ADD1 Gly460Trp (rs4961). При одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа GG гена ADRB2 Argl6Gly (rs 1042713), наличие генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), превышения содержания гексана в моче в 10 и более раз по сравнению с фоновым уровнем, равным 0,01 мкг/см³, превышения по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgG к гексану в 2 и более раз и уровня содержания адреналина выше 10-100 пг/мл, диагностируют генетическую предрасположенность к развитию вегетососудистой дистонии по гипертоническому типу у мужчин в условиях избыточной контаминации гексаном.

- из патента РФ № известен Способ диагностики генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции при выполнении чрескожных коронарных вмешательств у пациентов с инфарктом миокарда с элевацией сегмента ST. Выполняют забор цельной периферической крови. Методом полимеразной цепной реакции определяют генотипы однонуклеотидных полиморфизмов 1378G>T гена ADD1 , -344C>T гена CYP11B2, 677C>T гена MTHFR. При выявлении сочетания: генотип GT или TT 1378G>T в гене ADD1 , генотип CC -344C>T в гене CYP11B2, генотип CC 677C>T в гене MTHFR констатируют наличие генетической предрасположенности к развитию феномена коронарной микрососудистой обструкции.

2. Диагностический критерий – полиморфизм гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1:

- из патента РФ № 2773830 известен Способ диагностики расстройства вегетативной нервной системы у девочек дошкольного возраста, ассоциированного с избыточной контаминацией биосред детей марганцем. У девочки дошкольного возраста производят отбор пробы крови и определяют в ней содержание марганца и содержание специфического к марганцу иммуноглобулина Ε (IgE). Выполняют генетические исследования, для этого отбирают пробу буккального эпителия, осуществляют выделение из указанной пробы дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК). Проводят генотипирование полиморфизма гена ММР-9 и гена AGTR1, используя в качестве праймера участок ДНК путем исследования генотипов гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипов гена AGTR1 А1166С (rs5186). И при одновременном выполнении следующих диагностических критериев: наличие генотипа АА гена ММР-9 Gln279Arg (rs17576) и генотипа АА гена AGTR1 А1166С (rs5186), при условии превышения содержания марганца в крови в 2,0 и более раз по сравнению с референтным уровнем, а также при превышении по сравнению с верхней границей физиологической нормы уровня IgE к марганцу не менее чем в 1,5 раза диагностируют у девочек расстройство вегетативной нервной системы, ассоциированное с избыточной контаминацией биосред марганцем.

- из патента РФ № 2627643 известен способ прогнозирования риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы. Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови обследуемого с последующим определением генотипа полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186). Прогноз повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы осуществляется с помощью геномного типирования полиморфизма A1166С гена AGTRl (rs 5186). При наличии носительства аллеля С и генотипа АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186) прогнозируют повышенный риск развития аСАК.

- из патента РФ № 2376372 известен способ генетической диагностики подверженности к сердечно-сосудистым заболеваниям. Способ основан на определении генотипов по полиморфным вариантам Al166C гена AGTR1 , А-240Т и A2350G гена АСЕ, С677Т гена MTHFR, T174M гена AGT, C825T гена GNB3, VNTR4a/b и G894T гена NOS3, G1691А гена F5, PLA1/A2 гена ITGB3, G20210A гена F2 и оценке риска путем суммирования количества баллов, присвоенных каждому генотипу. При этом генотипам «низкого» риска сердечно-сосудистой патологии присваивается 0 баллов, к ним относятся генотипы 1166АА гена AGTR1 , -240АА, 2350АА гена АСЕ, 677СС гена MTHFR, 174TT гена AGT, 825CC гена GNB3, VNTR4bb и 894GG гена NOS3, 1691GG гена F5, PLA1/A1 гена ITGB3, 20210GG гена F2. Генотипам «среднего» риска присваивается 0,5 баллов, к ним относятся генотипы 1166АС гена AGTR1 , -240АТ и 2350AG гена АСЕ, 677СТ гена MTHFR, 174TM гена AGT, 825CT гена GNB3, VNTR4ab и 894GT гена NOS3. Генотипам «высокого» риска присваивается 1 балл, к ним относятся генотипы 1166СС гена AGTR1 , -240ТТ и 2350GG гена АСЕ, 677ТТ гена MTHFR, 174MM гена AGT, 825TT гена GNB3, VNTR4aa и 894GT гена NOS3, 1691GA и 1691АА гена F5, PLA1/A2 и PLA2/A2 гена ITGB3, 20210GA и 20210АА гена F2. Риск сердечно-сосудистых болезней считается «низким» при сумме баллов от 0 до 3, средним - от 3,5 до 6, высоким - от 6,5 до 11 баллов.

- из патента РФ № 2809700 известен Способ прогнозирования риска развития септического шока у пациентов отделения реанимации и интенсивной терапии. Осуществляют выделение ДНК из периферической венозной крови, определение вариантов гена рецептора ангиотензина II AGTR1 . При выявлении у пациента варианта ТТ гена AGTR1 (rs275651) определяют количественное содержание пептидного гормона ангиотензина II в плазме крови. При содержании пептидного гормона ангиотензина II менее 200 пг/мл прогнозируют риск развития септического шока. Способ обеспечивает заблаговременное определение принадлежности конкретного пациента к группе риска развития септического шока и целесообразность использования препаратов ангиотензина II только для тех пациентов, предрасположенность которых к развитию шока обусловлена недостаточностью содержания вазопрессорного гормона ангиотензина II и наличием генетического варианта ТТ rs275651 его рецептора - AGTR1 .

 - из патента РФ № 2620566 известен Способ прогнозирования развития коморбидной формы артериальной гипертензии и хронической обструктивной болезни легких. У больного АГ или ХОБЛ определяют генотипы полиморфного локуса М235Т гена ангиотензиногена (AGT) и полиморфного локуса A1166C гена рецептора I типа агиотензина II (AGTR1). При наличии у больного генотипа Т/Т полиморфного локуса М235Т гена AGT и генотипа А/С полиморфного локуса А1166С гена AGTR1 прогнозируют высокую вероятность развития коморбидной АГ и ХОБЛ в течение 10 лет после дебюта первого из заболеваний. Изобретение позволяет с высокой долей вероятности прогнозировать развитие коморбидной формы АГ и ХОБЛ. 

3. Диагностический критерий – полиморфизм гена детоксикации N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2:

- из патента РФ № 2750715 известен способ определения генетической предрасположенности к развитию туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью mycobacterium tuberculosis при ВИЧ-инфекции. У пациентов группы риска проводят забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, аллель-специфическую полимеразную цепную реакцию с целью генотипирования по полиморфным локусам rs1208, rs1799930 и rs1799929 гена ариламин-ацетилтрансферазы 2 NAT2. У носителей сочетания генотипов NAT2^{Lys268Lys А803А} × NAT2^{Arg197Arg G590G} × NAT2^{Leu161Leu С481С} прогнозируют развитие туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью Mycobacterium tuberculosis с 10,775-кратным риском.

- из патента РФ № 2618459 известен способ определения генетической предрасположенности к заболеванию инфекционным эндокардитом (ИЭ). У русских пациентов группы риска осуществляют забор образцов венозной крови, выделение геномной ДНК, проведение аллель-специфической полимеразной цепной реакции и определение полиморфных локусов Lys268Arg гена NAT2 и Ile105Val гена GSTP1. У носителей сочетания генотипов NAT2 Arg268Arg × GSTP1 Ile105Val выявляют генетическую предрасположенность и 11,3-кратный риск развития ИЭ.

Однако все указанные известные изобретения не направлены на выявления ранних проявлений дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации крови ребенка ароматическими углеводородами, в частности, бензолом.

Также из уровня техники известен ряд технических решений, направленных на диагностику дискинезии  желчевыводящих  путей путем инструментального и функционального обследования.

Из патента РФ № 2269292 известен способ  диагностики  дискинезии  желчевыводящих  путей. Проводят измерение показателей электрокожного сопротивления и кожной температуры на меридианах Р в точке Р9 (1.9), С в точке С5 (5.7), IG в точке IG4 (6.4), TR в точке TR4 (10.4), RP в точке RP3 (4.3), V в точке V64 (7.64). Гипомоторную дискинезию устанавливают по подъему кривой электрокожного сопротивления на 30% и более от средней на меридианах RP и V, снижению кривой электрокожного сопротивления на 30% и более от средней на меридианах TR и IG, общей симпатикотонии и подъему температурной кривой на 10% и выше от средней на меридианах С и TR. А гипермоторную дискинезию устанавливают по подъему кривой электрокожного сопротивления на 30% и более от средней на меридианах RP и V, снижению кривой электрокожного сопротивления на 30% и более от средней на меридианах TR и IG, общей парасимпатикотонии и подъему кривой электрокожного сопротивления на 20% и более на меридиане Р. Недостатком этого способа является то, что отсутствие генетических критериев не позволяет проводить диагностику ДЖВП на ранних стадиях ее формирования, также не учитывается возможный вклад в развитие дискинезии желчевыводящих путей экспозиции ароматическими углеводородами.

Из патента РФ № 2150887 известен способ диагностики вертеброгенно обусловленных дискинезий желчевыводящих путей у детей и подростков, включающий выявление факторов риска натальной травмы, последствий травмы шейного отдела позвоночного столба, проведение рентгенографии шейного отдела позвоночного столба с центрацией на среднешейный отдел и, при обнаружении рентгенологических симптомов дегенеративно-дистрофических изменений, диагностируют вертеброгенно зависимые нарушения кинетики желчного пузыря и желчевыводящих путей. Однако диагностика дискинезий желчевыводящих путей у детей и подростков данным способом ограничивается исключительно вертеброгенно обусловленными причинами, в то время как другие условия формирования ДЖВП, такие как генетическая обусловленность и влияние экзогенных химических факторов не учитываются.

 Из патента РФ 2369333 известен способ определения дискинезии желчного пузыря и сфинктера Одди. При реализации способа проводят дуоденальное зондирование. При продолжительности этапа пузырной желчи 30 мин и менее, напряжении желчевыделения 2,3 мл/мин и более и при биохимических показателях желчи: билирубин 2,5-3,3 ммоль/л, фосфолипидно-холестериновый коэффициент 0,41-0,51, холато-холестериновый коэффициент 4,2-5,1, дискинезию желчного пузыря и сфинктера Одди оценивают как гиперкинетическую. При длительности этапа желчного пузыря 40 мин и более, напряжении желчевыделения 1,9 мл/мин и менее и при биохимических показателях желчи: билирубин 4,2-4,9 ммоль/л, фосфолипидно-холестериновый коэффициент 0,14-0,27, холато-холестериновый коэффициент 2,1-2,7, дискинезию желчного пузыря и сфинктера Одди оценивают как гипокинетическую. Однако способ отражает исключительно состояние желчного пузыря и сфинктера Одди, не характеризуя состояние всей системы желчевыводящих путей и не исследуя влияние наследственных (генетических) и внешних химических факторов.

Также из уровня техники известен способ прогнозирования риска развития хронического калькулезного холецистита у женщин (патент РФ №2592206) Способ предлагает использовать данные о генетических полиморфизмах интерлейкинов и их сочетаний IL-1A -889Т>С, IL-1 В -511С>Т, IL-4 -584С>Т, IL-5 -703C>Т, IL-8 -251А>Т, IL-9 T113M, IL-10 -592С>А. Однако данный способ предполагает генетическую оценку участия исключительно иммунного механизма, в основе которого лежит развитие воспалительного процесса, а кинетические аспекты патологии связанные с формированием гипер- и гипотонуса гладкой мускулатуры желчевыводящих путей данным способом не анализируются.

При этом из уровня техники не были выявлены известные способы диагностики раннего проявления дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации ароматическими углеводородами, поэтому сделать выбор ближайшего аналога к заявляемому объекту не представляется возможным.

Технический результат, достигаемый предлагаемым изобретением, заключается в создании информативного и доказательного способа ранней диагностики развития дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации ароматическими углеводородами.

Поставленный технический результат достигается предлагаемым способом диагностики ранних проявлений дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации бензолом, согласно которому определяют токсикологические, лабораторные и генетические показатели, при этом в качестве токсикологических показателей определяют в крови ребенка содержание бензола, в качестве лабораторных показателей определяют в крови уровень специфического иммуноглобулина G (IgG) к бензолу и уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), а в качестве генетических показателей определяют полиморфизм гена аддуцина ADD1, гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 и гена детоксикации N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 при помощи метода полимеразной цепной реакции путем исследования генотипов гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), генотипов гена AGTR1 A1166C (rs5186) и генотипов гена NAT2 T341C (rs1801280), и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании бензола в крови ребенка 0,00064 мг/дм³ и более, при превышении не менее, чем в 1,3 раза уровня IgG к бензолу по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., при превышении не менее, чем в 1,4 раза уровня цГМФ по сравнению с верхней границей нормы, равной 39 пкмоль/л, а также при наличии гомозиготы GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), гомозиготы СС генотипа гена AGTR1 A1166C (rs5186) и гетерозиготы TС генотипа гена NAT2 T341C (rs1801280), диагностируют у ребенка развитие дискинезии желчевыводящих путей в условиях контаминации бензолом.

В качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.

Поставленный технический результат достигается за счет следующего.

Работы по оценке токсического эффекта таких ароматических углеводородов, как бензол, показали, что контакт с данным продуктом является источником окислительного стресса, а также играет определенную роль в бензольно-опосредованном канцерогенном эффекте (пролиферативные процессы печени).

Чрезвычайно актуальна на сегодня задача изучения влияния антропогенных химических факторов на формирование заболеваемости урбанизированного населения в условиях его детерминированной генетики. Для их реализации недостаточно только соответствующей генетической конституции индивида - нужен еще фактор или комплекс факторов среды, запускающих формирование мутантного фенотипа. Таким образом, при участии средового фактора может реализоваться наследственная предрасположенность.

Проведение исследований полиморфности кандидатных генов при соматических заболеваниях, в том числе желудочно-кишечного тракта, в частности, печени, позволяет установить не только ключевой генетический фактор, но и провести анализ возможного механизма формирования болезни в условиях антропогенно измененной среды, что важно как для ранней диагностики развития дискинезии желчевыводящих путей, так и для своевременной коррекции таких состояний.

Многие болезни с наследственной предрасположенностью проявляются в виде синдромов или комплекса патологических признаков, казалось бы, не связанных между собой, что определяется мультифакториальностью кодирующих данные признаки генов.

К таким полифункциональным генам относятся:

- ген ангиотензиногенового рецептора AGTR1 A1166C (rs5186) С-аллель (мультипликативная модель: OR (отношение шансов)=2,01; 95%CI (доверительный интервал) =1,04-3,88, p (вероятность)=0,0347), эффекты которого в случае транзиции (SNP), как констриктора гладкомышечного тонуса, непосредственно сокращающего гладкую мускулатуру отменяются, как и его синергия с другими миоконстрикторами (аддуцин);

- гена аддуцина ADD1 Gly460Trp (rs4961) (типичный аллель G: OR=4,73; 95%CI (2,46-9,08), p = 0,0025, и генотип GG), который опосредует через торможение активности натриевого-калиевого насоса (образование комплекса "(Na+, K+)-АТФаза) атонию гладкой мускулатуры желчевыводящих путей с формированием дискинезии желчевыводящих путей (ДЖВП);

- а также гена детоксикации N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 T341C (rs1801280), особенности экспрессии, преимущественно, медленных (средних) генотипов которого создают условия несовершенного метаболизма и избыточной дополнительной контаминации ароматическими углеводородами (бензол), которые обладая опиатным эффектом посредством воздействия на гипоталамические структуры головного и спинного мозга, снижают регуляторный физиологический тонус гладкой мускулатуры.

На Римском консенсусе III в 2006 году международными экспертами по изучению функциональных заболеваний желудочно–кишечного тракта (ЖКТ) дисфункция желчевыводящих путей (ДЖВП) определена, как первичная дискинезия, развившаяся в результате моторно–тонических нарушений желчного пузыря (ЖП), желчных протоков и их сфинктеров, обусловливающих нарушение оттока желчи и/или панкреатического секрета в двенадцатиперстную кишку (ДПК) при отсутствии органических препятствий.

При этом через базолатеральную мембрану гепатоцитов обеспечивается поступление из плазмы крови (из пространств Диссе) в цитоплазму гепатоцитов желчных кислот (ЖК), аминокислот, неконъюгированного билирубина, глюкозы и ряда эндогенных и экзогенных ксенобиотиков, в том числе лекарственных средств, растительных стеролов и ксенобиотиков. Эти процессы осуществляются благодаря наличию в составе базолатеральных мембран Na⁺-K⁺-АТФазы, а также специфических и неспецифических белков-переносчиков для органических анионов, обладающих перекрестной реактивностью. Функционирование Na'-K'-АТФазы обеспечивает энергетический потенциал и ионное равновесие клетки, а также нормальную текучесть (проницаемость) клеточных мембран. К основным белкам-переносчикам относятся: транспортирующий органические анионы белок, транспортирующий Na⁺/ЖК белок, Na⁺-H⁺- и Na⁺-HСO₃-ионообменники, осуществляющие перенос ионов через мембрану и поддерживающие в гепатоцитах нормальный уровень рН.

Циклический гуанозинмонофосфат (далее - цГМФ) представляет собой циклический нуклеотид. Его наиболее вероятным механизмом действия является активация внутриклеточной протеинкиназы в ответ на связывание мембранонепроницаемых пептидных гормонов с внешней поверхности клетки. Благодаря активации протеинкиназ цГМФ может расслаблять гладкие мышцы. В кровеносных сосудах расслабление гладкой мускулатуры сосудов приводит к расширению сосудов и увеличению кровотока. Увеличение концентрации этого вещества напрямую связано с релаксацией мускулатуры.

Многочисленные исследования показали, что сочетание неблагоприятных факторов окружающей среды с наследованием неблагоприятных полиморфных вариантов генов, определяет индивидуальную чувствительность к различным токсинам. Такая чувствительность может способствовать развитию социально значимых заболеваний как у взрослых, так и у детей.

Для наиболее эффективной нейтрализации многих чужеродных веществ необходимо совместное действие ферментов I и II фаз. Выявлено, что десинхронизация фаз биотрансформации приводит к накоплению в организме продуктов перекисного окисления, канцерогенов и мутагенов, приводящих к его быстрому отравлению. Особенно неблагоприятным является сочетание высокой активности ферментов фазы I и низкой активности ферментов фазы II. Среди ферментов фазы II семейства глутатион-S-трансфераз (GSTs) и N-ацетилтрансфераз (NATs) проявляют наиболее широкую и разнообразную активность.

В семействе NAT есть два функциональных изофермента, которые метаболизируют широкий спектр ксенобиотиков. NAT2 считается основным ферментом ацетилирования ксенобиотиков. В этом гене имеется 16 полиморфных участков. Различные комбинации этих полиморфизмов продуцируют 36 вариантов гена NAT2; каждая из этих комбинаций кодирует фермент с разной скоростью ацетилирования. Вариант NAT2 (rs1801280, T341C) приводит к замене изолейцина треонином в положении 114 молекулы белка и вызывает снижение максимальной скорости ацетилирования N-ацетилтрансферазы 2.

Изучение полиморфизмов в гене NAT2 имеет клиническое значение в связи с выявленной ассоциацией между полиморфизмами этого гена и развитием различных социально значимых заболеваний, а также чувствительностью людей к лекарственным препаратам. Многочисленные исследования показали надежную связь между полиморфными вариантами генов NAT и риском развития рака, включая рак головы и шеи, легких, молочных желез, гортани, мочевого пузыря, пищеварительного тракта

Ген ADD1, который рекомендуется использовать в качестве другого диагностического критерия в предлагаемом способе, кодирует альфа-субъединицу белка аддуцина (adducin). Аддуцин – гетеродимерный белок цитоскелета клетки, состоящий из a- и b-субъединиц. Он способствует прикреплению белка спектрина к актину, связывается с кальмодулином, является субстратом для протеинкиназ С и А, а также регулирует активность (Na+, K+)-АТФазы (натрий-калиевой аденозинтрифосфатазы), участвующей в переносе ионов натрия и калия через мембрану. Na⁺/K+-АТФ-аза переносит ионы К⁺ внутрь клетки, в то время как ионы Na⁺ выбрасываются во внешнюю среду. Фермент не является настоящим антипортером, так как оба катиона транспортируются против электрохимического градиента. Основная функция — поддержание потенциала покоя и регулирование клеточного объёма.

На основании проведенных исследований установлено, что наличие типичного аллеля G (OR=4,73; 95%CI (2,46-9,08) и генотипа GG гена аддуцина ADD1 Gly460Trp rs4961 опосредует через торможение активности натриевого-калиевого насоса (образование комплекса "(Na+, K+)-АТФаза) атонию гладкой мускулатуры желчевыводящих путей с формированием гипотонической ДЖВП, одновременно повышается экспрессия цГМФ. Механизмом действия является активация внутриклеточные протеинкиназы в ответ на связывание мембранонепроницаемых пептидных гормонов с внешней поверхности клетки, благодаря активации протеинкиназ цГМФ может расслаблять гладкие мышцы, сопровождая атонию и дискинезию ЖВП, а также связанная со сниженной экспрессией гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 A1166C rs5186 С-аллель (мультипликативная модель: OR=2,01; 95%CI=1,04-3,88, p=0,0347), эффекты которого как констриктора гладкомышечного тонуса, непосредственно сокращающего гладкую мускулатуру, отменяются в условиях его полиморфности; одновременно условия дополнительной контаминации ароматическими углеводородами (бензол) обладая как опиатным эффектом воздействуя на гипоталамические структуры головного и спинного мозга, так и местным миорелаксирующим, снижают регуляторный физиологический тонус гладкой мускулатуры, а особенности экспрессии преимущественно медленных (средних) генотипов кандидатного гена детоксикации N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 T341C rs1801280 гетерозиготный ТС генотип гена (p=0,0495; OR=3,22; 95%CI=1,01-10,88; RR=1,58; 95%CI=1,36-1,82) приводят к нарушению метаболизма ароматических углеводородов, формируя интоксикацию.

Сочетание генотипов кандидатных генов, высокие значения уровня IgG к бензолу в крови и избыточное содержание в крови цГМФ, чрезмерный уровень которого сопровождает нарушения функционала натрий-калиевого насоса, и одновременно дисбаланс вегетативной регуляции тонуса желчевыводящих путей, представляют собой маркеры ранних проявлений у детей дискинезии желчевыводящих путей в условиях экзогенной стимуляции ароматическими углеводородами (бензолом).

Физиологическое значение цГМФ заключается в том, что он является вторичным мессенджером, который взаимодействует с тремя типами внутриклеточных белков: цГМФ-зависимыми протеинкиназами (ПК), цГМФ-регулируемыми ионными каналами и фосфодиэстеразами (ФДЭ). Дальнейшие реакции с участием этих молекул опосредуют различные тканевые защитные физиологические эффекты, включая расслабление гладких мышц и подавление их пролиферации, противовоспалительное действие, контроль миграции лейкоцитов и функции тромбоцитов. Повышенный уровень цГМФ надежный показатель крови для выявления клинически значимой портальной гипертензии (КСПГ) у пациентов с циррозом, является коррелятом системной и спланхнической вазодилатации. Штурм Л., Беттингер Д., Рот Л., Золдан К., Штольц Л., Гам С, Хубер Дж.П., Рейнке М., Кезер Р., Беттлер Т., Крайзель В., Тимме Р. и Шультхайсс М. (2022) цГМФ плазмы является многообещающим биомаркером клинически значимой портальной гипертензии у пациентов с циррозом печени.

Таким образом в качестве критерия возникновения нарушений функции печени с развитием дискинезии желчевыводящих путей в условиях избыточной контаминации бензолом рекомендуется использовать измененный генотип (гетерозигота Т/С) гена N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 T341C rs1801280, отвечающей за метаболизм гетероциклических и ароматических углеводородов. При нарушении процесса экспрессии наблюдается развитие эффектов расслабляющих мускариночувствительные холинорецепторы гладкой мускулатуры желчных протоков, ускоряемые дополнительной гаптенной экспозицией ароматическими углеводородами. Одновременно гомозиготный генотип GG гена аддуцина ADD1 G/T rs4961, а также гомозиготный генотип СС гена ангитензиногенового рецептора 1 типа формируют AGTR1 A1166C rs5186 отвечающего за АТФ-опосредованные энергетически детерминированные процессы переноса ионов через клеточную мембрану, что приводит к сценарию релаксации гладкомышечного тонуса желчевыводящих путей.

Подтверждающим фактором иммунной гиперэнергии служит нарастание показателя, характеризующего сам феномен специфической сенсибилизации по критерию содержания IgG к бензолу, а также нарастание уровня цГМФ, как связанного с реализацией индивидуальной генетической программы, ассоциированной с аддуцин и АТФ (цГМФ)-регулируемыми ионными каналами, а также с генетически опосредованным дефектом ангиотензиногенового рецептора, что опосредует различные тканевые защитные физиологические эффекты, включая расслабление гладких мышц в условиях контаминации бензолом, уровень которой сопряжен с низкой экспрессией NAT2.

Благодаря использованию в качестве исследуемого материала проб буккального эпителия (при определении наличия генов) и крови, а также стандартных методик изучения иммунологических и генетических параметров, обеспечивается простота, надежность и доступность исследований, а также получение результатов нужной информативности.

Установление содержания химического контаминанта – бензола, именно в крови, обусловлено тем, что кровь является средой преимущественной элиминации из организма данного элемента, имеющего реферируемые уровни в данной биологической среде.

Именно благодаря расширению информационных показателей и будет обеспечена точность оценки модифицирующего влияния бензола на риск развития дискинезии желчевыводящих путей у детей у детей, ассоциированной с контаминацией биосред бензолом.

Клиническая значимость предлагаемых диагностических показателей доказана методом корреляционно-регрессионного анализа, а также доказана дополнительная информационная связь изменений указанных совокупных критериев с превышением в крови над нормой содержания бензола, что делает предлагаемый способ точным и достоверным.

Исходя из вышеизложенного, можно сделать вывод, что поставленный технический результат обеспечивается за счет совокупности всех операций предлагаемого способа, их последовательности и режимов его реализации.

При реализации предлагаемого способа осуществляют следующие операции в нижеуказанной последовательности:

1. Проводят отбор группы детей-школьников 7-9 лет одной этнической популяции, проживающих на неблагополучной по условиям проживания территории с повышенным содержанием в атмосфере бензола. Затем проводят отбор пробы крови для определения содержания бензола, а также уровня IgG к бензолу и уровня циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ). Указанные показатели определяют:

- содержание бензола - газохроматографическим методом количественного определения ароматических (бензол, толуол, этилбензол, о-,м-,п-ксилол) углеводородов в биосредах (кровь) на газовом хроматографе «Кристалл-5000» в соответствии c методическими указаниями МУК 4.1.765 –99;

- уровень IgG к бензолу - методом иммуноферментного анализа. В качестве физиологического диапазона содержания IgG к бензолу был принят диапазон, равный менее 0-0,1 у.е. (Н.Тиц,2003);

- уровень циклического гуанозинмонофосфата цГМФ в крови – турбодиметрическим методом, «Konelab 20» (ThermoFisher, Финляндия).

2. Также отбирают у ребенка пробу буккального эпителия (в виде мазка со слизистой оболочки щеки). После забора материала тампон (рабочую часть зонда с ватным тампоном) помещают в стерильную пробирку типа «Эппендорф» с 500 мкл транспортной среды (стерильный 0,9%-ный раствор NaCl). Пробирку с раствором и рабочей частью зонда закрывают.

Далее производят выделение ДНК из пробы. Для этого пробы в количестве 100 мкл лизируют 300 мкл лизирующего раствора, представляющего собой 0,5%-ный раствор саркозила и протеиназы К (20 мг/мл) в ацетатном буфере (рН 7,5). Затем добавляют сорбент (каолин) и последовательными процедурами промывки отмывают фосфатно-солевым буфером (рН 7,2) пробы от белков и смесью изопропиловый спирт : ацетон от липидов. Нуклеиновые кислоты остаются при этом на сорбенте. Далее адсорбированные на сорбенте ДНК из пробы экстрагируют ТЕ-буфером, представляющим собой смесь 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА (рН 8,0). Экстракт подвергают центрифугированию. После центрифугирования пробирки надосадочная жидкость содержит очищенную ДНК.

Полученный материал готов к постановке полимеразной цепной реакции (ПЦР). ПЦР проводят на детектирующем амплификаторе с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме «реального времени» с использованием готовых наборов праймеров и зондов производства ЗАО «Синтол», Россия, в котором в качестве праймеров использовались участки ДНК генов ADD1 Gly460Trp (rs4961), AGTR1 A1166C (rs5186) и NAT2 T341C (rs1801280). Проводят реакцию амплификации, это достигается тем, что для исследования аллельного состояния каждого гена у отдельного ребенка готовят свою реакционную смесь. В каждую пробирку вносят 0,1 мкл готовой смеси праймеров (принятый в генетике термин, обозначающий конечные нуклеотиды с меткой, ограничивающие (отрезающие) амплифицируемую цепочку нуклеотидов гена) и зондов для выбранных генов ADD1 Gly460Trp (rs4961), AGTR1 A1166C (rs5186) и NAT2 T341C (rs1801280) (использованы наборы реагентов для определения полиморфизма генов ADD1 Gly460Trp (rs4961), AGTR1 A1166C (rs5186) и NAT2 T341C (rs1801280) (ЗАО «Синтол», Россия). В каждую пробирку добавляют остальные компоненты необходимые для осуществления ПЦР: нуклеотиды (дезоксинуклеозидтрифосфаты: по 10 мМ дАТФ, дТТФ, дГТФ, дЦТФ), буфера (100 мМ трис-HCl-буфера, 500 мМ KCl, 40 мМ MgCl₂) и Tag F-полимеразы. Вносят пробу в количестве 10 мкл. Таким образом, общий объем реакционной смеси составляет 25 мкл. Каждая пробирка плотно закрывается пробкой и устанавливается в амплификатор.

При проведении ПЦР амплификацию и детекцию проводят на детектирующем амплификаторе CFX96 фирмы Bio-Rad.

Используется универсальная программа амплификации, подобранная производителем реактивов. Она включает в себя несколько этапов: 1 этап – активация TaqF-полимеразы (режим «горячего старта») продолжается 15 мин при 95 °C; 2 этап – установочные циклы амплификации без измерения флуоресценции (5 циклов); 3 этап – рабочие циклы амплификации с измерением флюоресценции (40 циклов).

Каждый цикл амплификации включает в себя денатурацию ДНК (5 с при 95 °С), отжиг праймеров (20 с при 60 °С) и саму реакцию полимеризации ДНК (15 с при 72 °С).

Регистрация сигнала флюоресценции, возникающего при накоплении продуктов амплификации участков ДНК проводится в режиме «реального времени» после стадии отжига праймеров для выбранных генов по каналу VIC – для детекции одного из аллельных вариантов генов, и по каналу FAM – для альтернативного варианта.

Результаты интерпретируются на основании наличия (или отсутствия) пересечения кривой флюоресценции с установленной на заданном уровне пороговой линией, что соответствует наличию (или отсутствию) значения порогового цикла (N) в соответствующей графе в таблице результатов, отображаемой в программном обеспечении для амплификатора CFX96.

По соотношению пороговых циклов, полученных по двум каналам детекции, определяют состояние генов ADD1, AGTR1 и NAT2 в исследуемом участке ДНК гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), в исследуемом участке ДНК гена AGTR1 A1166C (rs5186) и в исследуемом участке ДНК гена NAT2 T341C (rs1801280) (метод аллельной дискриминации). Возможных вариантов состояния гена было два: гомозиготное – в случае, когда одно из значений порогового цикла не определяется (ниже пороговой линии) и гетерозиготное – в случае, когда получено два значения пороговых циклов и по этим каналам получены параболические кривые флюоресценции. В зависимости от того, накопление какого продукта амплификации происходит в реакции, устанавливаются следующие генотипы:

- для гена ADD1 Gly460Trp (rs4961): G/G –дикий гомозиготный генотип; G/Т – гетерозиготный; T/T - вариантный гомозиготный генотип

- для гена AGTR1 A1166C (rs5186): A/A – дикий гомозиготный генотип; A/С – гетерозиготный; C/С - вариантный гомозиготный генотип

- для гена NAT2 T341C (rs1801280): Т/Т – дикий гомозиготный генотип; Т/С – гетерозиготный; C/С - вариантный гомозиготный.

3. И при одновременном выполнении следующих условий:

 - при содержания бензола в крови ребенка 0,00064 мг/дм³ и более,

- при превышении не менее, чем в 1,3 раза уровня IgG к бензолу по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е.,

- при превышении не менее, чем в 1,4 раза уровня цГМФ по сравнению с верхней границей нормы, равной 39 пкмоль/л,

- а также при наличии гомозиготы GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), гомозиготы СС генотипа гена AGTR1 A1166C (rs5186) и гетерозиготы T/С генотипа гена NAT2 T341C (rs1801280) диагностируют у ребенка на ранней стадии проявление дискинезии желчевыводящих путей в условиях контаминации бензолом.

При проведении испытаний по реализации предлагаемого способа были сформированы две группы детей:

- группа наблюдения – 45 детей 7-9 лет, с проявлениями нарушений функции желчевыводящих протоков с подтвержденным диагнозом дискинезия желчевыводящих путей;

- группа сравнения – 39 детей 7-9 лет, без проявлений нарушений функции желчевыводящих протоков.

Заболевание «дискинезия желчевыводящих путей» у детей группы наблюдения определяли по результатам УЗИ органов брюшной полости и клинического обследования у гастроэнтеролога.

Группы исследования были сопоставимы по возрасту, полу, этническому составу, сопутствующей патологии, социально-экономическому уровню семьи, качеству и составу питания.

У детей отбирали пробу крови для химико-аналитического анализа на содержание бензола в крови, IgG к бензолу и на содержание цГМФ; а также отбирали буккальный эпителий для генотипирования полиморфизма указанных генов на амплификаторе CFX96 методом полимеразной цепной реакцией в режиме реального времени.

В результате указанных исследований были получены следующие сравнительные данные, изложенные в таблицах 1 и 2.

В таблице 1 приведены данные по содержанию бензола в крови детей в различных группах.

Таблица 1

Группы Группа наблюдения (n=45) Группа сравнения
(n=39) р Содержание бензола в крови, мг/ дм³ 0,00073± 0,00009 0,00041± 0,00019 0,0035

n – количество детей; p – достоверность.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что детей группы наблюдения значимо повышено содержание бензола в крови более, чем в 1,7 раза относительно группы сравнения (р=0,0035).

В таблице 2 приведены данные по установлению критериев диагностики дискинезия желчевыводящих путей у детей-школьников 7-9 лет в условиях влияния бензола предлагаемым способом у обследованных групп детей.

Таблица 2

№ пациента Содержа-
ние бензола в крови, мг/дм³
(референт-
ный уровень
0,0 мг/дм³) Генотип гена NAT2 T341C rs1801280, определенного в пробе буккального эпителия Генотип гена AGTR1 A1166C rs5186 , определенного в пробе буккального эпителия Генотип гена аддуцина ADD1 G/T rs4961, определенного в пробе буккального эпителия Уровень IgG к бензолу,
у.е
(норма 0-0,1 у.е.) Содержание цГМФ, пкмоль/л
(норма 33,0-39,0 пкмоль/л) Дети с диагнозом дискинезия желчевыводящих путей
(группа наблюдения) 1. (9лет) 0,00075 TС CC GG 0,226 55,6 2. (7 лет) 0,00064 TС CC GG 0,180 53,7 3. (8 лет) 0,00085 TС CC GG 0,135 58,5 Дети без диагноза дискинезия желчевыводящих путей
(группа сравнения) 4. (9лет) 0,00060 ТС АС GG 0,100 50,14 5. (8лет) 0,0 ТТ СС GG 0,080 46,11 6 (9лет) 0,00031 ТС АС GТ 0,099 39,0 7. (8лет) 0,0 ТТ AA TT 0,085 36,94 8. (7 лет) 0,0 ТТ AA TT 0,077 39,0 9.(7лет) 0,0 ТТ AA TT 0,090 38,15

Примечание: 1. ТТ – дикий гомозиготный генотип гена NAT2 T341C rs1801280; T/С - гетерозиготный генотип гена NAT2 T341C rs1801280; CС - вариантный гомозиготный генотип гена NAT2 T341C rs1801280;

2. АА - дикий гомозиготный генотип гена AGTR1 A1166C rs5186; АС – гетерозиготный генотип гена AGTR1 A1166C rs5186 ; СС – гомозиготный вариантный генотип гена AGTR1 A1166C rs5186;

3. G/G – дикий гомозиготный генотип гена аддуцина ADD1 rs4961 ; G/T -гетерозиготный генотип гена аддуцина ADD1 rs4961 ; Т/Т - гомозиготный вариантный генотип гена аддуцина ADD1 rs4961.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что у пациентов, которым поставлен диагноз «дискинезия желчевыводящих путей» (примеры 1-3), выявлены одновременно следующие обстоятельства:  содержание бензола в крови ребенка 0,00064 мг/ дм³ и выше; превышение в 1,3-2,3 раза уровня IgG к бензолу по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е.; превышение в 1,4-1,5 раза уровня цГМФ по сравнению с верхней границей нормы, равной 39 пкмоль/л, а также наличие комбинации генотипа гомозиготы GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), гомозиготы СС генотипа гена AGTR1 A1166C (rs5186) и гетерозиготы T/С генотипа гена NAT2 T341C (rs1801280).

У пациентов, у которых отсутствует совокупность указанных диагностических критериев (примеры 4 - 9), не выявлено заболевание «дискинезия желчевыводящих путей».

Для иллюстрации реализации предлагаемого способа приведены два примера по конкретным пациентам.

Пример 1. Пациент, 9 лет, русский, диагноз: К82.8.0 — Дискинезия желчного пузыря и желчных путей. Жалобы на периодические боли в области правого подреберья после приема пищи последние полгода. УЗИ органов брюшной полости показало расширение общего желчного протока до 7 мм. Определяется высокий уровень бензола в крови - 0,00075 мг/дм³ (референтный уровень – 0,0 мг/дм³). Определяется наличие GG гомозиготы гена аддуцина ADD1 Gly460Trp (rs4961), СС гомозиготы гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 A1166C (rs5186) и TС гетерозиготы гена NAT2 T341C (rs1801280). Значение содержания IgG к бензолу: 0,226 у.е., т.е. в 2,26 раза выше верхней границы нормы. Содержание цГМФ – 55,6 пкмоль/дм³, т.е. выше верхней границы диапазона нормы (33,0-39,0 пкмоль/дм³) в 1,42 раза. Таким образом, установлены высокие значения уровня IgG к бензолу, уровня циклического гуанозинмонофосфата цГМФ на фоне повышенного по отношению к референтному уровню, содержания бензола в крови, а также наличие дикой гомозиготы GG гена аддуцина ADD1 Gly460Trp (rs4961), вариантной гомозиготы СС гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 A1166C (rs5186) и гетерозиготы TС гена N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 T341C (rs1801280), кодирующих белки ответственные за тонус гладкой мускулатуры желчевыводящих путей и детоксикацию и метаболизм органических поллютантов, что указывает на реализацию геноопосредованных нарушений кинетики транспорта желчи у данного пациента, формируя ассоциированное с действием бензола состояние дискинезии желчевыводящих путей (К82.8.0).

Пример 2. Пациент, 8 лет, русский, здоров. Уровень бензола в крови 0,0 мг/дм³соответствует референтному уровню – 0,0 мг/дм³. Определяется наличие ТТ гомозиготы гена аддуцина ADD1 Gly460Trp (rs4961), АА гомозиготы гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 A1166C (rs5186) и TТ гомозиготы гена NAT2 T341C (rs1801280). Значение содержания IgG к бензолу: 0,085 у.е., т.е. ниже верхней границы нормы (отсутствие сенсибилизации к бензолу). Содержание цГМФ – 36,94 пкмоль/дм³, соответствует диапазону нормы (33,0-39,0 пкмоль/дм³). Таким образом, отсутствие дикой гомозиготы GG гена аддуцина ADD1 Gly460Trp (rs4961) (наличие его полиморфного ТТ генотипа), отсутствие мутантной гомозиготы СС гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 A1166C (rs5186) (наличие нормальной гомозиготы АА), что позволяет поддерживать наследственно детерминированный физиологический тонус гладкой мускулатуры желчевыводящих путей (отсутствие атонии), а также отсутствие гетерозиготы TС гена N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 T341C (rs1801280) (наличие физиологической гомозиготы ТТ, позволяющей реализовывать функцию метаболизма органических контаминантов), не приводит к высоким значениям уровня циклического гуанозинмонофосфата цГМФ, а также уровня IgG к бензолу, что на фоне отсутствия содержания бензола в крови, не приводит к развитию процессов атонии гладкой мускулатуры и застою желчи и не формирует у данного пациента, ассоциированное с действием бензола, состояние дискинезии желчевыводящих путей (К82.8.0).

Таким образом, приведенные данные показывают, что при реализации предлагаемого способа с использованием заявляемых диагностических критериев по содержанию бензола в крови, превышения в 1,3 и более раза уровня IgG к бензолу по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е.; превышения в 1,4 и более раза уровня цГМФ по сравнению с верхней границей нормы, равной 39 пкмоль/л, а также наличия комбинации генотипа гомозиготы GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), гомозиготы СС генотипа гена AGTR1 A1166C (rs5186) и гетерозиготы T/С генотипа гена NAT2 T341C (rs1801280, обеспечивается его назначение.

Предлагаемый способ позволит установить наличие ранних проявлений заболевания «дискинезия желчевыводящих путей» у детей возраста 7-9 лет, ассоциированной с контаминацией биосред бензолом, что в свою очередь позволит оптимизировать мероприятия по коррекции данного состояния у детей.

Изобретение относится к медицине, а именно к профилактической медицине, экологии человека и педиатрии, и может быть использовано для диагностики ранних проявлений дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации бензолом. При содержании бензола в крови ребенка 0,00064 мг/дм³ и более, при превышении не менее чем в 1,3 раза уровня IgG к бензолу по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., при превышении не менее чем в 1,4 раза уровня цГМФ по сравнению с верхней границей нормы, равной 39 пкмоль/л, при наличии генотипа GG гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), генотипа СС гена AGTR1 A1166C (rs5186) и генотипа TС гена NAT2 T341C (rs1801280), у ребенка диагностируют развитие дискинезии желчевыводящих путей в условиях контаминации бензолом. Способ обеспечивает информативную диагностику дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации бензолом за счет одновременного определения токсикологических, лабораторных и генетических маркеров. 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 2 пр.

1. Способ диагностики ранних проявлений дискинезии желчевыводящих путей у детей в условиях контаминации бензолом, характеризующийся тем, что определяют токсикологические, лабораторные и генетические показатели, при этом в качестве токсикологических показателей определяют в крови ребенка содержание бензола, в качестве лабораторных показателей определяют в крови уровень специфического иммуноглобулина G (IgG) к бензолу и уровень циклического гуанозинмонофосфата (цГМФ), а в качестве генетических показателей определяют полиморфизм гена аддуцина ADD1, гена ангиотензиногенового рецептора AGTR1 и гена детоксикации N-ацетил-трансферазы 2 типа NAT2 при помощи метода полимеразной цепной реакции путем исследования генотипов гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), генотипов гена AGTR1 A1166C (rs5186) и генотипов гена NAT2 T341C (rs1801280), и при одновременном выполнении следующих условий: при содержании бензола в крови ребенка 0,00064 мг/дм³ и более, при превышении не менее чем в 1,3 раза уровня IgG к бензолу по сравнению с нормой, равной 0,0-0,1 у.е., при превышении не менее чем в 1,4 раза уровня цГМФ по сравнению с верхней границей нормы, равной 39 пкмоль/л, а также при наличии гомозиготы GG генотипа гена ADD1 Gly460Trp (rs4961), гомозиготы СС генотипа гена AGTR1 A1166C (rs5186) и гетерозиготы TС генотипа гена NAT2 T341C (rs1801280), диагностируют у ребенка развитие дискинезии желчевыводящих путей в условиях контаминации бензолом.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что в качестве метода полимеразной цепной реакции используют метод полимеразной цепной реакции в режиме реального времени.