СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РИСКА СУБАРАХНОИДАЛЬНОГО КРОВОИЗЛИЯНИЯ ВСЛЕДСТВИЕ РАЗРЫВА АНЕВРИЗМЫ СОСУДОВ ГОЛОВНОГО МОЗГА У ЛИЦ АЗИАТСКОЙ РАСЫ Российский патент 2017 года по МПК G01N33/49 C12Q1/68 

Изобретение относится к области медицины, а именно к молекулярной медицине, неврологии, и может быть использовано для прогнозирования повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга и персонифицированной профилактики данного заболевания.

Уровень техники

Аневризмы сосудов головного мозга представляют собой локальные выпячивания стенки сосудов головного мозга и являются наиболее распространенной причиной нетравматических аневризматических субарахноидальных кровоизлияний (аСАК). Несмотря на впечатляющие достижения в области диагностики и хирургического лечения разорвавшихся аневризм, произошедшие в последнее время, аСАК остается распространенным заболеванием с высоким уровнем летальности. По данным популяционных исследований, летальность достигает 66,7% (D.J. Nieuwkamp, L.E. Setz, A. Algra [et al.]. Changes in case fatality of aneurysmal subarachnoid haemorrhage over time, according to age, sex, and region: a meta-analysis // Lancet Neurol. - 2009. - №8. - P. 635-642). Распространенность аневризм сосудов головного мозга в популяции оценивается примерно в 5-10% (F. Caranci, F. Briganti, L. Cirillo [et al.]. Epidemiology and genetics of intracranial aneurysms // Eur J Radiol. - 2013. - V. 82 (10). - P. 1598-1605).

Ввиду высокой распространенности асимптомных аневризм сосудов головного мозга, с одной стороны, и неблагоприятных исходов аСАК, с другой, актуальной является проблема диагностики аневризм сосудов головного мозга, имеющих высокий риск разрыва и, соответственно, риск развития аСАК. При этом перспективной задачей является выявление аневризм на этапе до их разрыва и до развития тяжелых цереброваскулярных осложнений.

Скрининг для выявления асимптомных неразорванных аневризм в общей популяции с помощью инвазивных методов (например, церебральной ангиографии или магнитно-резонансной ангиографии) в настоящее время не поддерживается (Guidelines for the management of aneurysmal subarachnoid hemorrhage: a guideline for healthcare professionals from the American Heart Association/American Stroke Association / E.S. Connolly, A.A. Rabinstein, J.R. Carhuapoma [et al.] // Stroke. - 2012. - V. 43 (6). - P. 1711-1737).

До сих пор нет диагностических тестов для конкретных генетических факторов риска для выявления пациентов с высоким риском развития аСАК вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга. Поиск генетических маркеров развития и разрыва аневризм интенсивно проводится во многих популяциях, но прогресс в данном направлении остается умеренным. Знание генетических детерминант может быть полезным для того, чтобы познать механизм образования аневризмы, а также получить диагностические инструменты для выявления лиц с повышенным риском аСАК (Caranci F, Briganti F, Cirillo L, Leonardi M, Muto M. Epidemiology and genetics of intracranial aneurysms. Eur J Radiol., 2013, Oct; 82 (10): 1598-605. doi: 10.1016/j.ejrad.2012.12.026. Epub 2013 Feb 8).

Для идентификации генетических факторов, ответственных за комплексные заболевания (то есть те, в которые вовлечены многие генетические и внешние факторы), такие как интракраниальные аневризмы, могут быть использованы различные подходы.

Одним из них является подход, основанный на гипотезах о функциональных характеристиках генов (т.н. функциональные гены-кандидаты, например ген эластина). Эти исследования широко представлены, ассоциации между аневризмами и специфическими аллелями в функциональных генах-кандидатах анализируются между группами пациентов с аневризмами и контролем. Недостатком данного метода является то, что гены, вовлеченные в развитие аневризм через неизвестный патогенез, остаются неисследованными (Y.M. Ruigrok; G.J.E. Rinkel. Genetics of Intracranial Aneurysms. Stroke. 2008; 39: 1049-1055. doi: 10.1161/STROKEAHA.107.497305).

Другим методом, позволяющим избежать этого недостатка, является метод, свободный от гипотез, через полногеномный скрининг. Недостатком метода является то, что гены заболевания не обнаруживаются, если аневризмы вызваны редкими вариантами в генах (Y.M. Ruigrok, G.J.E. Rinkel. Genetics of Intracranial Aneurysms. Stroke. 2008; 39: 1049-1055. doi: 10.1161/STROKEAHA.107.497305).

Известен способ диагностики субарахноидального кровоизлияния с использованием генетических маркеров (патент №JP 2005151854 (А) С07К 14/47; С07К 16/18; C12N 15/09; С12Р 21/08; C12Q 1/68; G01N 33/53; G01N 37/00; (IPC1-7): С07К 14/47; С07К 16/18; C12N 15/09; С12Р 21/08; C12Q 1/68; G01N 33/53; G01N 37/00. MARKER FOR DIAGNOSING HUMAN SUBARACHNOID HEMORRHAGE AND USE OF THE MARKER). Способ обеспечивает диагностику субарахноидального кровоизлияния с применением полипептидного маркера и гена-маркера. Недостатком этого изобретения является то, что данный способ обеспечивает определение специфических повреждений субарахноидального кровоизлияния, но не позволяет выявить риск развития аневризмы сосудов головного мозга и ее разрыва, то есть не может быть использован для профилактики субарахноидального кровоизлияния.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является способ диагностики риска аневризм сосудов головного мозга с использованием генетических маркеров (патент № JP 2002238577 (А) С07К 14/78; C12N 15/09; C12Q 1/68; (IPC 1-7): C12N 15/09; C12Q 1/68 CEREBRAL ANEURYSM-SENSITIVE GENE). Способ обеспечивает диагностику риска возникновения церебральной аневризмы путем идентификации генетического полиморфизма гена эластина человека. Недостатком этого изобретения является то, что данный способ осуществляет диагностику риска развития аневризмы, но не разрыва ее. Большинство церебральных аневризм не разрывается, что подтверждается тем фактом, что частота аСАК в популяции значительно ниже распространенности неразорвавшихся аневризм (F. Caranci, F. Briganti, L. Cirillo [et al.]. Epidemiology and genetics of intracranial aneurysms // Eur J Radiol. - 2013. - V. 82 (10). - P. 1598-1605). Таким образом, данный способ не может быть применен для выявления аневризм сосудов головного мозга, приводящих к развитию субарахноидальных кровоизлияний.

Предлагаемый нами способ генотипирования полиморфного локуса А1166С гена AGTR1 (rs 5186) обеспечивает диагностику риска аневризмы сосудов головного мозга и субарахноидального кровоизлияния и, таким образом, позволяет проводить индивидуализированную профилактику заболевания до развития тяжелых цереброваскулярных осложнений.

Задача и технический результат

Задачей изобретения является разработка способа прогнозирования повышенного риска развития аневризмы сосудов головного мозга, приводящего к субарахноидальному кровоизлиянию у лиц азиатской расы.

Технический результат при использовании изобретения - повышение точности прогнозирования риска развития аневризмы сосудов головного мозга и ее разрыва у лиц азиатской расы, приводящего к субарахноидальному кровоизлиянию, благодаря получению эффективных критериев прогнозирования, и возможность проведения персонифицированной профилактики субарахноидального кровоизлияния у лиц азиатской расы.

Осуществление изобретения

Указанный технический результат достигается тем, что в способе прогнозирования риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы в качестве генетических маркеров заболевания используется генотипирование полиморфного локуса A1166C гена AGTR1 (rs 5186).

На основании наличия у лиц азиатской расы данных носительства генотипов полиморфизма А1166С гена AGTR1 определяется степень предрасположенности к риску субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга.

Предлагаемый способ прогнозирования риска аСАК вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга осуществляется следующим образом.

У пациента забирают периферическую венозную кровь из локтевой вены в количестве 5,0 мл.

Из крови больного выделяют ДНК модифицированным методом с использованием экстракции смесью фенол-хлороформ.

Проводится геномное типирование методами, основанными на полимеразной цепной реакции (ПЦР) (метод анализа полиморфизма длины рестрикционных фрагментов продуктов ПЦР (метод ПЦР-ПДРФ), где однонуклеотидная замена входит в состав сайта узнавания специфической рестриктазы и генотипы определяют по наличию или отсутствию фрагментов рестрикции; и метод ПЦР с использованием аллелеспецифических праймеров (метод ПЦР-SSP), где генотипы определяют по наличию или отсутствию продукта амплификации в случае праймера, специфического для определенного аллеля). Проводится геномное типирование полиморфизма A1166C гена AGTR1 (rs 5186).

Определяют носительство генотипов полиморфизма А1166С гена AGTR1. При наличии носительства аллеля С и аллельного сочетания АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 прогнозируют повышенный риск развития субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы.

Описание эксперимента

Краткое описание эксперимента:

1 этап. Проведено исследование частот аллелей и генотипов полиморфных локусов генов: полиморфизм Gln12Ter гена AMPD1 (rs 146422068), полиморфизм Thr715Pro гена SELP, полиморфизм А1166С гена AGTR1 (rs 5186), полиморфизм I/D гена АСЕ (rs 4646994), полиморфизм Thr174Met гена AGT (rs 4762), полиморфизм Met235Thr гена AGT (rs 699) в группе больных аСАК и в контрольной группе, сопоставимых по полу, возрасту и этнической принадлежности.

2 этап. Сравнительный анализ частот носительства аллелей и генотипов полиморфных локусов исследуемых генов в группе больных аСАК и в контрольной группе.

3 этап. Исследование прогностической ценности выявленных генетических маркеров для определения риска аневризмы сосудов головного мозга и ее разрыва, приводящее к аСАК.

Описание эксперимента:

Проведено исследование методом «случай-контроль» в группах больных аСАК (n=77) и контрольной группе, состоящей из здоровых лиц, без клинических и анамнестических данных наличия острых нарушений мозгового кровообращения в анамнезе (n=200).

Характеристика 1-й группы (больные аСАК): 77 пациентов Регионального сосудистого центра (Республиканская больница №2-ЦЭМП, Якутск), госпитализированные в острой стадии заболевания в период 2012-2013 гг. Средний возраст - 49,2 года. Мужчины - 36 человек (46,8%), женщины - 41 (53,2%). Этническая принадлежность: коренной этнос азиатской расы - 77 человек (100%).

Характеристика 2-й группы (контрольная группа): 200 человек без клинических и анамнестических данных за острое нарушение мозгового кровообращения. Средний возраст: 46,9 лет. Мужчины - 66 (33%), женщины - 134 (67%). Этническая принадлежность: коренной этнос азиатской расы - 200 человек (100%).

Клиническое обследование пациентов с аСАК включало: неврологический осмотр со сбором анамнеза (100%), общеклинические анализы (100%), КТ (МРТ) головного мозга (100%), коагулограмма (100%), ультразвуковое исследование (допплеровское и дуплексное) брахиоцефальных сосудов (100%), субтракционная церебральная ангиография (100%).

Молекулярно-генетическое исследование проводилось в учебно-научной лаборатории «Геномная медицина» Клиники медицинского института СВФУ им. М.К. Аммосова.

Забор крови проводился из локтевой вены в пробирку с ЭДТА. Геномную ДНК выделяли из лейкоцитов периферической крови методом фенол-хлороформной экстракции [Maniatisetal. 1982].

Генотипирование полиморфного маркера Thrl74Met и Met235Thr гена AGT, I/D гена АСЕ, А1166С гена AGTR1 и Gln12Ter гена AMPD1 проводили с помощью наборов (ООО Тестген), в соответствии с инструкцией фирмы-производителя на амплификаторе с возможностью проведению анализа флуоресценции по конечной точке "iQ5 iCycler" ("BioRad", США).

Генотипирование полиморфного маркера Thr715Pro гена SELP проводили методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР) с помощью наборов (ООО НПФ «Литех», Москва), в соответствии с инструкцией фирмы-производителя. ПЦР проводили в амплификаторе S1000 ThermalCycler («Bio-Rad», США). Продукты аллель-специфичной ПЦР анализировали с помощью электрофореза в 3% агарозном геле (ООО «Компания Хеликон», Москва).

Результаты исследования

1 этап. Проведено молекулярно-генетическое исследование риска развития субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга в популяции коренного этноса азиатской расы Якутии между группой больных (n=77) и группой здорового контроля (n=200) без анамнестических и клинических признаков острых нарушений мозгового кровообращения. Проведено исследование возможной ассоциации полиморфизма Gln22Ter гена AMPD1, полиморфизма Thr715Pro гена SELP, полиморфизма А1166С гена AGTR1, полиморфизма I/D гена АСЕ, полиморфизма Thrl74Met гена AGT, полиморфизма Met235Thr гена AGT с риском заболевания с применением статистических методов на основе точного критерия Фишера. Проведен сравнительный анализ частоты встречаемости аллелей в гомозиготной или гетерозиготной формах и частоты носительства генотипов исследуемых полиморфизмов в группах больных и контроля.

2 этап. Результаты сравнительного анализа распределения частот аллелей и генотипов Gln12Ter гена AMPD1 в группах больных аСАК и контрольной группы представлены в таблице 1. В результате исследования биаллельного кандидатного локуса гена AMPD1 не выявлено значимых различий в частоте носительства аллелей и генотипов данного полиморфизма между обследуемыми группами.

Генотипирование полиморфизма Thr715Pro гена SELP не выявило различий в частоте носительства аллелей и генотипов данного полиморфизма между обследуемыми группами (таблица 2).

Результаты сравнительного анализа распределения частот аллелей и генотипов полиморфизма А1166С гена AGTR1 приведены в таблице 3. Выявлены значимые различия в частоте носительства как аллелей, так и генотипов данного полиморфизма между группами больных с аСАК и группой здорового контроля. Так, частота аллеля С значимо выше в группе больных (р=0,015; OR=1,63; 95% CI: 1,08-2,44). Соответственно, число носителей данного аллеля значимо выше в группе больных в сравнении с группой контроля (79,2% против 57,5%) (р=0,001, OR=2,81; 95% CI: 1,46-5,49). Частота аллеля А была значимо меньше в группе больных в сравнении с контролем (59,7% против 70,7%) (р=0,015; OR=0,61; 95% CI: 0,41-0,92). Но количество носителей аллеля А между обеими группами не имело различий и составило 98,7% и 99% соответственно. Между обеими сравниваемыми группами были получены значимые различия в частоте носительства генотипа АА (20,8% против 42,5%) (р=0,01; OR=0,35; 95% CI 0,18-0,68). Частота носительства генотипа АС была значимо выше в группе больных (77,9% против 56,5%) (р=0,01; OR=2,71; 95% CI: 1,43-5,22). Относительно носительства генотипа СС не получено достоверных результатов ввиду малого количества носителей в группах больных и контроля (1 и 2 человека, соответственно) (таблица 3).

В результате исследования биаллельного кандидатного локуса гена АСЕ не выявлено значимых различий в частоте носительства аллелей и генотипов полиморфизма I/D между обследуемыми группами (таблица 4).

Проведено генотипирование двух полиморфизмов гена AGT (Thr174Met и Met235Thr). Частоты распределения аллелей и генотипов не имели значимых различий между группами больных и контроля как для полиморфизма AGT Thr174Met (таблица 5), так и для полиморфизма AGT Met235Thr (таблица 6).

Таким образом, значимые различия в частоте распределения аллелей и генотипов исследованных 6 полиморфизмов выявлены только для полиморфизма А1166С гена AGTR1. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что носительство аллеля С и генотипа АС полиморфизма Al166C гена AGTR1 повышает риск развития аСАК.

3 этап. На третьем этапе исследования провели оценку прогностической ценности идентифицированного генетического маркера А1166С AGTR1: рассчитали чувствительность и специфичность, прогностическую ценность отрицательного результата и прогностическую ценность положительного результата для теста. Значимыми считали маркеры со специфичностью и/или чувствительностью более 70,0.

Как видно из таблицы 7, носительство аллеля С полиморфизма А1166С гена AGTR1 характеризуется высокой чувствительностью в отношении риска заболевания (79,2). Носительство данного аллеля характеризуется низкой специфичностью (42,5).

Для аллельного сочетания АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 установлена чувствительность, равная 77,9, специфичность - 43,5.

Таким образом, тесты на носительство аллеля С и аллельного сочетания АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 являются высокочувствительными в отношении риска аСАК вследствие разрыва аневризмы и обеспечивают высокую вероятность заболевания при положительном результате диагностического исследования (теста).

При положительном результате теста прогнозируется высокий риск субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы, и проводятся специальные мероприятия по профилактике заболевания (инвазивные и/или неинвазивные методы выявления аневризм сосудов головного мозга (магнитно-резонансная ангиография, компьютерная томографическая ангиография, церебральная субтракционная ангиография)).

Предлагаемый способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1.

Больная Л., 42 г., якутка. В анамнезе: заболеваний сердечно-сосудистой системы нет, вредных привычек нет. Заболела остро 05.01.2013, внезапно развилась сильная головная боль, многократная рвота. При обследовании на КТ головного мозга диагностировано массивное субарахноидальное кровоизлияние, с прорывом в желудочки мозга. На церебральной ангиографии от 06.01.2013. выявлена мешотчатая аневризма правой внутренней сонной артерии. В объективном статусе: менингеальный синдром. Результаты генотипирования: генотип АС полиморфизма А1166С гена AGTR1. Проведена операция клипирования аневризмы правой внутренней сонной артерии. Рекомендуется: 1 этап - обследование родственников первой линии родства на носительство полиморфизма А1166С гена AGTR1; 2 этап - при положительном результате генотипирования - обследование с использованием малоинвазивных методов выявления аневризм сосудов головного мозга (КТ-ангиография, МРТ-ангиография); 3 этап - при выявлении аневризмы - инвазивные методы диагностики (церебральная ангиография) и удаление аневризмы (до ее разрыва).

Пример 2.

Больной С., 35 лет, якут. В анамнезе: страдает артериальной гипертензией. Вредных привычек нет. Заболел остро 28.10.2012., внезапно потерял сознание, многократная рвота, развился правосторонний гемипарез, речевые расстройства. При обследовании на КТ головного мозга диагностировано субарахноидальное кровоизлияние, внутримозговая гематома в височно-теменных отделах левого полушария, объемом до 20,0 см³, на фоне разрыва аневризмы левой средней мозговой артерии, со смещением срединных структур вправо до 1 мм. На церебральной ангиографии выявлена крупная мешотчатая аневризма развилки правой средней мозговой артерии, многокамерная аневризма средней мозговой артерии слева. В объективном статусе: правосторонняя гемиплегия, моторная афазия. Результаты генотипирования: генотип АС полиморфизма А1166С гена AGTR1. Проведено оперативное лечение разорвавшейся аневризмы левой средней мозговой артерии. Рекомендуется: 1 этап - плановое оперативное лечение неразорвавшейся аневризмы правой средней мозговой артерии; 2 этап - обследование родственников первой линии родства на носительство полиморфизма А1166С гена AGTR1; 3 этап - при положительном результате генотипирования - обследование с использованием малоинвазивных методов выявления аневризм сосудов головного мозга (КТ-ангиография, МРТ-ангиография); 4 этап - при выявлении аневризмы - инвазивные методы диагностики (церебральная ангиография) и удаление аневризмы (до ее разрыва).

Пример 3.

Т., 35 лет, якутка. В анамнезе: артериальная гипертензия. Родная сестра перенесла субарахноидальное кровоизлияние вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга. Результаты генотипирования: генотип АС полиморфизма А1166С гена AGTR1. Учитывая наследственную отягощенность и носительство генетического фактора риска аСАК-генотипа АС полиморфизма А1166С гена AGTR1, рекомендуется: 1 этап - обследование с использованием малоинвазивных методов выявления аневризм сосудов головного мозга (КТ-ангиография, МРТ-ангиография); 2 этап - при выявлении аневризмы - инвазивные методы диагностики (церебральная ангиография) и удаление аневризмы (до ее разрыва); 3 этап - обследование родственников первой степени родства (генотипирование А1166С гена AGTR1, при положительном результате - неинвазивные методы диагностики аневризмы сосудов головного мозга).

Использование заявляемого способа позволит повысить точность прогнозирования повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы, что позволит, в свою очередь, провести персонифицированную профилактику заболевания путем отбора лиц, подлежащих инвазивным и неинвазивным методам диагностики церебральных аневризмов в период до разрыва аневризмы с развитием субарахноидального кровоизлияния.

Изобретение относится к области медицины и касается способа прогнозирования повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы. Сущность способа заключается в том, что выделяют ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови обследуемого с последующим определением генотипа полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186). Прогноз повышенного риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы осуществляется с помощью геномного типирования полиморфизма A1166С гена AGTRl (rs 5186). При наличии носительства аллеля С и генотипа АС полиморфизма А1166С гена AGTR1 (rs 5186) прогнозируют повышенный риск развития аСАК. Использование способа повышает точность прогнозирования риска развития аневризмы сосудов головного мозга и ее разрыва, приводящего к субарахноидальному кровоизлиянию у лиц азиатской расы. 7 табл., 3 пр.

Способ прогнозирования риска субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга у лиц азиатской расы, включающий выделение ДНК из лимфоцитов периферической венозной крови обследуемого, проведение молекулярно-генетического исследования и при выявлении полиморфизма А1166С гена AGTR1 прогнозируют риск субарахноидального кровоизлияния вследствие разрыва аневризмы сосудов головного мозга.