ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА Российский патент 2011 года по МПК A23K1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицине и ветеринарии для получения препаратов против бактериальных инфекций.

Известный в природе штамм не обладает противовирусной активностью, имеет недостаточную антагонистическую активность. В этой связи препараты, изготовленные на основе данного штамма, также будут обладать низкой антагонистической активностью.

Известен препарат, включающий смесь биомассы штаммов бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-7092, ВКПМ В-7048 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 в равных соотношениях в споровой форме с титром не менее 3·10¹⁰ спор/г, содержащий крахмал и сахар (патент РФ №2142287).

Недостатком известного решения является наличие в его составе генномодифицированных компонентов.

Задачей, на решение которой направлено заявляемое изобретение, является создание пробиотической кормовой добавки, не содержащей генномодифицированных компонентов, антибиотиков, обладающей ингибирующим действием по отношению к патогенным микроорганизмам, не подавляя при этом микрофлору кишечника, активизирующую работу кишечника.

Технический результат от использования изобретения:

1) создание пробиотического препарата, применяемого для лечения и профилактики болезней животных, птиц и рыб, вызванных энтеропатогенной кишечной палочкой, золотистым стафилококком, протеем, шигеллами, клебсиеллами, сальмонеллами;

2) создание пробиотического препарата, применяемого для нормализации микробиоценоза, восстановления нормальной микрофлоры кишечника после применения антибиотиков, антигельминтиков, кокцидиостатиков;

3) создание пробиотического препарата, применяемого для снижения отрицательного действия на организм микотоксинов;

4) создание пробиотического препарата с максимальной выживаемостью спор бактерий и максимальной скоростью перехода спор бактерий в вегетативную форму.

Указанный технический результат достигается тем, что пробиотическая кормовая добавка включает смесь биомассы бактерий штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 (Депозит 23.12.2008) и Bacillus licheniformis ВКМП 10135 (Депозит ВКПМ 20.10.2008) в равных соотношениях в споровой форме при их суммарном количестве не менее 2×10⁸ спор/г и протектор. В качестве протектора используют сахариды предпочтительно в смеси с крахмалом. Предпочтительно сахариды выбирают из сахарозы, глюкозы, фруктозы, лактозы, мальтозы или их смеси. Использование в составе протектора крахмала обеспечивает спорам бактерий дополнительную защиту, обеспечивает более равномерное их распределение в массе протектора, способствует более активному прорастанию спор бактерий. Содержание крахмала в препарате не превышает 10% мас., предпочтительно 2-6% мас. Сахариды являются не только сорбентом-наполнителем, но и оказывают на препарат, стабилизирующий и консервирующий эффект.

Бактерии штамма Bacillus subtilis ВКПМ 10172 (наименование штамма В-11) депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 23.12.2008. Способ получения штамма: найден в естественных условиях, изолят, Кировская область, Черная Холуница, август 2008, Кулаков Г.В. Культурно-морфологические особенности штамма: клетки прямые, палочковидные, длиной 2-3 мкм, подвижные. Образуют аэробно споры овальной фюрмы, которые располагаются в клетке центрально. Окраска по Граму - грамположительна. Штамм хорошо растет на мясопептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также в этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвета с неровными краями. На мясопептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть. Штамм синтезирует пробиотик. Активность (продуктивность) штамма: ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитиназной активностью не обладает. Обладает липазной активностью. Штамм не является зоопатогенным. Штамм не является фитопатогенным.

Штамм поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц. Хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл).

Оптимальные условия и состав среды для размножения: Оптимальная температура роста 37°С, рН 7,0. Состав среды - пептон 5 г/л; дрожжевой экстракт 3 г/л; NaCl 5 г/л; вода водопроводная до 1 л.

Оптимальные условия и состав среды для ферментации: Оптимальная температура 37°С, рН 7,0. Состав среды: K₂HPO₄×3H₂O - 18 г/л; KH₂PO₄-6,0 г/л; (NH₄)SO₄-2 г/л; Na₃C₆H₂O₇×5,5H₂O-1,2 г/л.

Бактерии штамма Bacillus subtilis ВКПМ 10172 могут быть получены любым известным способом, но предпочтительно путем засева и взращивания исходного посевного материала в питательной среде, включающей пептон, глюкозу, кукурузный экстракт, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфаты магния, марганца и железа при рН среды 7,4-7,5.

Бактерии штамма Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 (наименование штамма В-12) депонирован во Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов 20.10.2008. Способ получения штамма: найден в естественных условиях, изолят, Кировская область. Черная Холуница, август 2008, Кулаков Г.В. Культурно-морфологические особенности штамма: клетки прямые, палочковидные, длиной 3 мкм, подвижные. Образуют аэробно споры овальной формы, которые располагаются в клетке центрально. Окраска по Грамму - грамположительны. Штамм хорошо растет на мясопептонном агаре (МПА), сусло-агаре, среде Громыко, картофельном агаре, а также в этих средах с добавлением 10 мг/мл канамицина, образуя блестящие складчатые колонии кремоватого цвета с неровными краями. На мясопептонном бульоне (МПБ) культура образует равномерную муть. Штамм синтезирует пробиотик. Активность (продуктивность) штамма: ферментирует лактозу, глюкозу, арабинозу, ксилозу с образованием кислоты без газа. Редуцирует нитраты, обеспечивает метиленовую синь. Коагулазной, гиалуронидазной, лецитиназной активностью не обладает. Обладает липазной активностью. Штамм не является зоопатогенным. Штамм не является фитопатогенным.

Штамм поддерживают на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл) с пересевом не реже 1 раза в месяц. Хранят на МПА и картофельном агаре с добавлением канамицина (50 мкг/мл).

Оптимальные условия и состав среды для размножения: Оптимальная температура роста 37°С, рН 7,0. Состав среды - пептон 5 г/л; дрожжевой экстракт 3 г/л; NaCl 5 г/л; вода водопроводная до 1 л.

Оптимальные условия и состав среды для ферментации: Оптимальная температура 37°С, рН 7,0. Состав среды: K₂HPO₄×3H₂O - 18 г/л; KH₂PO₄-6,0 г/л; (NH₄)SO₄-2 г/л; Na₃C₆H₂O₇×5,5H₂O-1,2 г/л.

Бактерии штамма Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 могут быть получены любым известным способом, но предпочтительно путем засева и взращивания исходного посевного материала в питательной среде, включающей пептон, глюкозу, кукурузный экстракт, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфаты магния, марганца и железа при рН среды 7,4-7,5.

ПРИМЕРЫ

Получение препарата

Бактерии штамма Bacillus subtilis ВКПМ 10172 получены путем засева и взращивания исходного посевного материала в питательной среде, включающей пептон, глюкозу, кукурузный экстракт, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфаты магния, марганца и железа при рН среды 7,4-7,5. Далее биомасса бактерий отделялась от питательной среды центрифугированием и лиофильно высушивалась.

Бактерии штамма Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 получены путем засева и взращивания исходного посевного материала в питательной среде, включающей пептон, глюкозу, кукурузный экстракт, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфаты магния, марганца и железа, при рН среды 7,4-7,5. Далее биомасса бактерий отделялась от питательной среды центрифугированием и лиофильно высушивалась.

Далее биомассу каждого вида бактерий смешивали отдельно с углеводным протектором в соотношении 1 часть биомассы спор бактерий на 5 частей углеводного протектора и перемешивали. При этом происходила иммобилизация спор бактерий на частицах протектора. Далее углеводный протектор с иммобилизованными на нем спорами Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и углеводный протектор с иммобилизованными на нем спорами Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 перемешивали в соотношении 1:1. Полученный иммобилизат с культурами бактерий перемешивали с углеводным протектором. При производстве добавки никаких генномодифицированных компонентов не использовалось.

Пример 1.

Исследование эффективности лечения поражения кур митоксином фузарохроманон.

Опыт проводился на 600 зараженных фузарохроманоном курах-несушках, разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 200 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Заражение кормовое грибками F.moniliforme. Давность заражения 2 недели. Контрольная группа лечению не подвергалась. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на голову в сутки. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 2×10 спор/г на голову в сутки, в качестве протектора использовалась смесь из 6% мас. крахмала и смеси сахарозы, глюкозы и фруктозы, взятых в соотношении 3:1:1. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки.

Контроль осуществляли по проценту смертности куриных эмбрионов с момента начала лечения.

Таблица 1.   1 день 5 день 10 день 20 день 25 день Контр, группа 67% 66% 68% 67% 69% 1 группа 58% 41% 19% 16% 14% 2 группа 27% 16% 11% 11% 10%

Такое резкое падение смертности эмбрионов во 2-й опытной группе связано по нашему мнению с максимальной выживаемостью спор бактерий и максимальной скоростью перехода спор бактерий в вегетативную форму.

При проведении опыта с образцом препарата на основе Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 с понижением концентрации спор бактерий до 10⁸ спор/г на голову в сутки эффект значительно снижался и на 25 день лечения смертность эмбрионов не опускалась ниже 17%.

При проведении опытов с образцами препарата на основе Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении, отличном от равного, эффект также понижался. При проведении опытов, в которых подкормка несушек осуществлялась только Bacillus subtilis ВКПМ 10172 или только Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 значительного эффекта не наблюдалось. При проведении опытов, в которых подкормка несушек осуществлялась Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 эффект снижался и на 25 день лечения смертность эмбрионов не опускалась ниже 19%. При проведении опытов, в которых подкормка несушек осуществлялась Bacillus subtilis ВКПМ В-7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ 1035, эффект снижался и на 25 день лечения смертность эмбрионов не опускалась ниже 17%.

Пример 2.

Исследование эффективности профилактики поражения телят микотоксином патулином.

Опыт проводился на 90 телят, разбитых на три раздельно содержащиеся партии: контрольную - 10 телят, 1-ю опытную и 2-ю опытную по 40 телят. Заражение кормовое грибком Aspergillus, вырабатывающим патулин. Контрольная группа профилактике не подвергалась. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на 1 кг корма. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 4×10⁸ спор/г на 1 кг корма, в качестве протектора использовалась смесь сахарозы, глюкозы и фруктозы, взятых в соотношении 3:1:1. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки. Начало введения препарата за 10 дней до кормового заражения.

Контроль осуществляли по проценту падежа с момента приема зараженного корма. Опыт по лечению не проводился.

Таблица 2.   1 день 2 день 3 день 4 день 5 день Контр. группа 0% 20% 70% - - 1 группа 0% 10% 12,5% Прекращение падежа Прекращение падежа 2 группа 0% 0% 0% 0% 0%

Отсутствие падежа телят во 2-й опытной группе связано по нашему мнению с максимальной выживаемостью спор бактерий и максимальной скоростью перехода спор бактерий в вегетативную форму.

Пример 3.

Исследование эффективности профилактики и лечения поражения поросят кишечной палолчкой Е.Coli.

Опыт проводился на 300 поросят, разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 100 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Заражение кишечной палолчкой Е.Coli кормовое. Контрольная группа профилактике не подвергалась, лечение тетрациклином в течение 15 дней с момента появления симптоматики отравления. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на 1 кг корма. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 4×10⁸ спор/г на 1 кг корма, в качестве протектора использовалась смесь сахарозы, глюкозы и фруктозы, взятых в соотношении 3:1:1 и 2% мас. крахмала. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки. Начало введения препарата за 10 дней до кормового заражения.

Контроль осуществляли по проценту падежа. В опытных группах 1 и 2 падежа не наблюдалось. В контрольной группе падеж составил 42%.

Опыт по лечению зараженных кишечной палочкой Е.Coli поросят показал большую активность заявляемого препарата над препаратом по патенту РФ №2142287, падеж при лечении опытных групп составил 16% и 23% соответственно.

Пример 4.

Исследование эффективности лечения поражения кур Salmonella bongori.

Опыт проводился на зараженных Salmonella bongori 300 бройлерах кросса «Hubbard», разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 100 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Контрольная группа профилактике не подвергалась, лечение тетрациклином в течение 15 дней с момента появления симптоматики. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на голову в сутки. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 1×10⁹ спор/г на голову в сутки, в качестве протектора использовалась смесь сахарозы, глюкозы и фруктозы, взятых в соотношении 3:1:1 и 7% мас. крахмала. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки.

Контроль осуществляли по проценту падежа. В контрольной группе падеж составил 72%. В опытной группе 1 падеж составил 19%. В опытной группе 1 падеж составил 8%.

При проведении опытов с образцом препарата по патенту РФ №2142287 с понижением концентрации спор бактерий до 1×10⁹ спор/г на голову в сутки падеж составил 27%.

При проведении опытов с образцами препарата на основе Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 1: 2 падеж составил 20%. При проведении опытов с образцами препарата на основе Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в соотношении 2: 1 падеж составил 22%.

При проведении опытов, в которых лечение осуществлялась только Bacillus subtilis ВКПМ 10172 или только Bacillus licheniformis ВКПМ 10135, значительного эффекта не наблюдалось, падеж составил порядка 60%.

При проведении опытов, в которых подкормка несушек осуществлялась Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ В-7038 1:1, падеж составил 31%.

При проведении опытов, в которых подкормка несушек осуществлялась Bacillus subtilis ВКПМ В-7092 и Bacillus licheniformis ВКПМ 1035 1:1, падеж составил 37%.

Пример 5.

Исследование эффективности профилактики и лечения поражения поросят Shigella dysenteriae.

Опыт проводился на 300 поросят, разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 100 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Заражение Shigella dysenteriae кормовое. Контрольная группа профилактике не подвергалась, лечение тетрациклином в течение 15 дней с момента появления симптоматики отравления. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на 1 кг корма. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 4×10⁸ спор/г на 1 кг корма, в качестве протектора использовалась смесь мальтозы, глюкозы и лактозы, взятых в соотношении 1:4:1. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки. Начало введения препарата за 10 дней до кормового заражения.

Контроль осуществляли по проценту падежа. В опытных группах 1 и 2 падежа не наблюдалось. В контрольной группе падеж составил 67%. Опыт по лечению зараженных Shigella dysenteriae поросят показал примерно равную активность заявляемого препарата над препаратом по патенту РФ №2142287, падеж при лечении опытных групп составил 13% и 14% соответственно.

Пример 6.

Исследование эффективности профилактики и лечения поражения поросят Klebsiella planticola.

Опыт проводился на 300 поросят, разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 100 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Заражение Klebsiella planticola кормовое. Контрольная группа профилактике не подвергалась, лечение тетрациклином в течение 15 дней с момента появления симптоматики отравления. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на 1 кг корма. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 4×10⁸ спор/г на 1 кг корма, в качестве протектора использовалась смесь сахарозы и 3% мас. крахмала. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки. Начало введения препарата за 10 дней до кормового заражения.

Контроль осуществляли по проценту падежа. В опытных группах 1 и 2 падежа не наблюдалось. В контрольной группе падеж составил 56%. Опыт по лечению зараженных Klebsiella planticola поросят показал более высокую активность заявляемого препарата над препаратом по патенту РФ №2142287, падеж при лечении опытных групп составил 7% и 18% соответственно.

Пример 7.

Исследование эффективности лечения диспепсии у поросят.

Опыт проводился на больных 200 поросят, разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 100 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Контрольная группа профилактике не подвергалась, лечение тетрациклином в течение 15 дней с момента появления симптоматики. 1-ю опытную группу лечили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на 1 кг корма. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 2×10⁸ спор/г на 1 кг корма, в качестве протектора использовалась смесь глюкозы и 3% мас. крахмала. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки. Контроль осуществляли по проценту падежа. В опытных группах 1 и 2 падежа не наблюдалось. В контрольной группе падеж составил 28%.

Пример 8.

Исследование эффективности применения для нормализации микробиоценоза и восстановления нормальной микрофлоры кишечника после применения антибиотиков.

Опыт проводился на 150 поросятах, разбитых на три раздельно содержащиеся партии по 50 голов: контрольную, 1-ю опытную и 2-ю опытную. Контрольная группа профилактике не подвергалась. Все группы подверглись лечению тетрациклином в течение 15 дней. 1-ю опытную группу поили препаратом по патенту РФ №2142287 с титром спор бактерий 10¹⁰ спор/г на голову в сутки. 2-ю опытную лечили препаратом по заявленному изобретению с титром спор бактерий 6×10⁸ спор/г на голову в сутки, в качестве протектора использовалась глюкоза. Введение препарата осуществлялось во всех случаях путем выпаивания с водой через ниппельные поилки. Контроль осуществляли по внешнему виду поросят после 5 дней подкормки. Контрольная группа: цвет поросят серый с взъерошенным волосяным покровом, поведение пассивное. Опытные группы: цвет розово-белый, блеск волосяного покрова, поведение активное.

Как видно из представленных примеров, именно при использовании Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 именно в равных соотношениях в споровой форме и именно при их суммарном количестве не менее 2×10⁸ спор/г имеет более высокую активность по сравнению с прототипом при профилактике и лечении заболеваний, вызванных кишечной палочкой, шигеллами, клебсиеллами, сальмонеллами, при нормализациии и стимулировании работы кишечника, поскольку показывает лучшие или идентичные показатели при гораздо меньших дозировках.

Из представленных примеров видно, что суммарная активность указанных штаммов бактерий, взятых именно в указанном соотношении и при указанной концентрации и даже при отсутствии генномодифицированных компонентов, значительно выше активности штаммов бактерий, взятых по отдельности, или в других соотношениях, или с вместе с бактериями Bacillus subtilis и Bacillus licheniformis других штаммов.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генетической инженерии, и может быть использовано в медицине и ветеринарии для получения препаратов против вирусных и бактериальных инфекций. Пробиотическая кормовая добавка включает смесь биомассы бактерий штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в равных соотношениях в споровой форме при их суммарном количестве не менее 2×10⁸ спор/г и углеводный протектор. Изобретение позволяет восстановить микрофлору кишечника. 4 з.п. ф-лы, 2 табл.

1. Пробиотическая кормовая добавка, включающая смесь биомассы бактерий штаммов Bacillus subtilis ВКПМ 10172 и Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 в равных соотношениях в споровой форме при их суммарном количестве не менее 2·10⁸ спор/г и углеводный протектор.

2. Пробиотическая кормовая добавка по п.1, отличающаяся тем, что в состав протектора входит крахмал.

3. Пробиотическая кормовая добавка по одному из пп.1 или 2, отличающаяся тем, что в качестве углевода в составе протектора применяют сахарозу, глюкозу, фруктозу, лактозу, мальтозу или их смесь.

4. Пробиотическая кормовая добавка по п.1, отличающаяся тем, что бактерии штамма Bacillus subtilis ВКПМ 10172 получены засевом и взращиванием исходного посевного материала в питательной среде, включающей пептон, глюкозу, кукурузный экстракт, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфаты магния, марганца и железа, при рН среды 7,4-7,5.

5. Пробиотическая кормовая добавка по п.1, отличающаяся тем, что бактерии штамма Bacillus licheniformis ВКПМ 10135 получены засевом и взращиванием исходного посевного материала в питательной среде, включающей пептон, глюкозу, кукурузный экстракт, хлористый натрий, хлористый кальций, сульфаты магния, марганца и железа, при рН среды 7,4-7,5.