Изобретение относится к медицине, а именно к педиатрии и гепатологии, и может быть использовано для прогнозирования характера течения хронического гепатита В (ХГВ) у детей подросткового возраста.
Известен способ прогнозирования обострений вирусных гепатитов путем исследования билирубина в сыворотке крови и определения уровня сывороточного железа на пике билирубинемии и через 7-10 дней после него [3]. При нарастании уровня сывороточного железа по сравнению с первоначальным уровнем прогнозируют обострение вирусного гепатита. Недостатком способа является прогнозирование обострений только при затяжном течении острых гепатитов. К тому же способ требует неоднократного забора крови.
Задачей изобретения является создание информативного способа раннего прогнозирования обострений ХГВ у подростков.
Поставленную задачу осуществляют за счет того, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (НАДН-ЛДГ), вычисляют соотношение активностей, и при значении полученного показателя, равном или более 1,15, прогнозируют обострения, а при значении показателя менее 1,15 прогнозируют отсутствие обострений.
Значение 1,15 получено опытным путем на основании сопоставления рассчитываемого показателя и характером течения ХГВ у обследуемых подростков.
Значение показателя, определяемое по соотношению величин активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ, равное или более 1,15 свидетельствует о значительном оттоке субстратов с гликолиза на реакции пентозофосфатного цикла, что снижает уровень анаэробных энергетических процессов и, соответственно, понижает функциональную активность лимфоцитов.
Известно, что лимфоциты, реализующие основные функции специфического иммунного ответа, являются главными клетками в системе иммунологического надзора и принимают активное участие в системе противоинфекционной защиты, в том числе и при вирусном гепатите В (ВГВ) [4]. От уровня функциональной активности лимфоцитов зависит исход острой инфекционной болезни и характер течения хронического инфекционного процесса. В то же время установлено, что функциональная активность лимфоцитов в значительной степени определяется уровнем их метаболических процессов [6]. К числу показателей, наиболее объективно отражающих основные параметры внутриклеточного метаболизма, можно отнести дегидрогеназы.
Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.49) - осуществляет дегидрирование глюкозо-6-фосфата и кофермента НАДФ. Образовавшийся в ходе данной реакции 6-фосфоглюконо-δ-лактон является нестабильным и гидролизуется либо спонтанно, либо с помощью фермента 6-фосфоглюконолактоназы с образованием 6-фосфоглюконата [1]. Г6ФДГ катализирует инициализирующую и ключевую реакцию пентозофосфатного цикла, который является конкурентом гликолиза за субстрат (глюкоза-6-фосфат). В норме доля пентозофосфатного цикла в количественном превращении глюкозы обычно невелика и варьирует в зависимости от функционального состояния клеток.
Лактатдегидрогеназа (КФ 1.1.1.27) - фермент гликолиза, обратимо катализирующий окисление лактата в пировиноградную кислоту с участием в качестве кофермента НАД+. Лактатдегидрогеназа занимает ключевое положение в регуляции цитоплазматического уровня НАДН/НАД и характеризует уровень терминальных реакций гликолиза [1].
Способ выполняется следующим образом.
У детей подросткового возраста, больных ХГВ, забирают венозную кровь из локтевой вены свободным током в пробирки с гепарином. Выделяют лимфоциты. Центрифугируют на градиенте плотности фиколл-верографина по стандартной методике A.Boyum (1968) [5]. Подсчитывают концентрацию лимфоцитов, например, в камере Горяева. При контроле морфологического состава лейкоцитарных взвесей определяют чистоту выхода лимфоцитов, которая составляет не менее 97%. 1 млн выделенных клеток используют для определения активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ в лимфоцитах одним из известных способов, например, биолюминесцентным [2]. Для этого в 150 мкл инкубационной смеси, содержащей соответствующий субстрат и кофактор, вносят 50 мкл суспензии разрушенных лимфоцитов. Конкретные значения концентраций субстратов и кофакторов, а также рН среды для определяемых ферментов представлены в таблице 1.
После инкубации исследуемых проб при 37°C в течение 30 минут для Г6ФДГ или 5 минут для НАДН-ЛДГ к 200 мкл инкубационной смеси добавляют 50 мкл флавинмононуклеотида (ФМН) в концентрации 1,5×10-5 M, 50 мкл 0,0005% миристинового альдегида и 10 мкл ферментативной системы НАДН: ФМНоксидоредуктаза-люцифераза (все реактивы биолюминесцентной системы разводят в 0,1 M К+, Ка+-фосфатном буфере с рН 7,0). После смешивания биолюминесцентных реактивов и инкубационной пробы с помощью биохемилюминометра, например, марки "БЛМ-8803", измеряют свечение. Учитывая, что в клетках имеется определенное количество субстратов для течения различных метаболических реакций, в том числе и катализируемых исследуемыми ферментами, определяют показатели, условно названные "субстратный фон ферментов". Определение производят в тех же условиях, что и для вышеперечисленных дегидрогеназ, но в инкубационную смесь вместо соответствующего субстрата вносят буфер. В результате измерения свечения на биолюминометре получают относительные значения активности исследуемых ферментов. Чтобы получить абсолютные значения активности строят графики зависимости интенсивности биолюминесценции от концентрации НАДФН и НАДН (калибровочный график). Для этого 200 мкл стандартного раствора НАДФН или НАДН в диапазоне 10-9-10-4 M вносят в кюветы биолюминометра, содержащие ФМН, миристиновый альдегид и НАДФН: ФМНоксидоредуктазу-люциферазу в концентрациях, указанных выше, после чего производят измерение интенсивности биолюминесценции. В связи с широким диапазоном рН буферов, используемых для определения дегидрогеназной активности, а также рН-зависимостью биолюминесценции ферментативной системы из светящихся бактерий, калибровочные графики строят на основе соответствующего буфера. Активность ферментов рассчитывают по формуле А=Δ[C]×V/T,
где A - активность дегидрогеназы, E на 1×104 лимфоцитов (1E=1 мкмоль/мин [1]);
Δ[C] - разница концентраций НАД(Ф)Н в пробах "фермент" и "фон фермента", мкмоль;
V - объем пробы, мл;
T - время инкубации, мин.
Затем рассчитывают соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ (Г6ФДГ/НАДН-ЛДГ). Значение полученного показателя, равное или более 1,15, свидетельствует о развитии обострения, а значение показателя менее 1,15 - об отсутствии обострения.
Данный способ апробирован на 34 подростках, больных ХГВ. Все больные подростки при поступлении в стационар и в динамике через 6 месяцев были обследованы с помощью общепринятых лабораторных методов обследования. Проведены: анализ периферической крови, биохимический анализ крови с определением концентрации общего билирубина и его фракций, тимоловой пробы, аланиновой трансаминазы (АЛТ), аспарагиновой трансаминазы (ACT) и щелочной фосфатазы. При помощи иммуноферментного анализа в сыворотке крови определяли специфические серологические маркеры HBsAg и анти-HBcIgG. С помощью метода полимеразно-цепной реакции у больных определяли ДНК вируса гепатита В. Активность Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ в лимфоцитах крови подростков с ХГВ определяли с помощью биолюминесцентного метода.
По результатам биохимического анализа крови установлено, что у 22 детей и подростков в течение 6 месяцев не было обострения ХГВ (активность АЛТ и ACT были в пределах нормы), у 12 - в диапазоне от 3 недель до 6 месяцев развилось обострение ХГВ (при повторном обследовании обнаружено повышение активности трансаминаз в сыворотке крови).
У всех больных обнаружено совпадение прогноза, сделанного по предложенному способу (табл.2).
Клинический пример 1. Больная Б., 9 лет (№ истории болезни 128), находилась на плановом обследовании в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ №20 им. И.С.Берзона г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В, неактивный. Ребенок состоял на диспансерном учете в течение 3 лет в диспансерном кабинете гепатоцентра МУЗ ГКБ №20 г.Красноярска. Из анамнеза известно, что мать девочки также больна хроническим вирусным гепатитом В. При поступлении в детское инфекционное отделение девочка жалоб не предъявляла.
Результаты биохимического исследования: билирубин общий 14,6 мкмоль/л, АЛТ 0,5 ммольхч/л (в пределах нормы), ACT 0,24 ммоль×ч/л (в пределах нормы).
При исследовании лимфоцитов периферической крови биолюминесцентным методом по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 0,14 (пример №15 из табл.2), что указывает на отсутствие обострения.
При амбулаторном обследовании больной в диспансерном кабинете гепатологического центра через 6 месяцев активность АЛТ и ACT была в пределах нормы.
Клинический пример 2. Больной Р., 16 лет (№ истории болезни 539), находился на лечении в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ №20 им. И.С.Берзона г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В с умеренной степенью активности. Из анамнеза известно, что ребенок получал переливание препаратов крови в возрасте 5 лет в связи с оперативным вмешательством. Ребенок состоит на диспансерном учете в течение 5 лет в диспансерном кабинете МУЗ ГКБ №20 г.Красноярска. При плановом обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра выявлена гиперферментемия, и ребенок был направлен в стационар для уточнения характера поражения печени и решения вопроса о тактике лечения. При поступлении в стационар больной предъявлял жалобы на периодические боли в животе. Во время осмотра выявлено умеренное увеличение печени (1/3-2 см-2 см).
Результаты биохимического исследования: билирубин общий 11 мкмоль/л (норма до 20 мкмоль/л), АЛТ 1,6 ммольхч/л (выше нормы в 2,3 раза), ACT 0,99 ммоль×ч/л (немного выше нормы).
При исследовании лимфоцитов периферической крови по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 1,13 (пример №14 из табл.2), что указывает на отсутствие обострения.
В контрольном биохимическом анализе крови отмечалось снижение концентрации билирубина и нормализация показателей АЛТ и ACT. На 23 день пребывания в стационаре больной выписан.
При амбулаторном обследовании больного в диспансерном кабинете гепатоцентра через 6 месяцев активность АЛТ и ACT сохранялась на уровне нормальных показателей.
Клинический пример 3. Больной Д., 11 лет (№ истории болезни 438), находился на плановом обследовании в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ №20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В, с минимальной степенью активности. Больной наблюдается в течение 2 лет в диспансерном кабинете гепатоцентра МУЗ ГКБ №20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В. При плановом обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра выявлена гиперферментемия, и ребенок был направлен в стационар для уточнения характера поражения печени и решения вопроса о тактике лечения.
Результаты биохимического исследования: билирубин общий 13,4 мкмоль/л, АЛТ 0,76 ммоль×ч/л (выше нормы), ACT 0,39 ммоль×ч/л (в пределах нормы).
При исследовании лимфоцитов периферической крови по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 18,47 (пример №2 из табл.2), что указывает на развитие обострения.
На 16 день пребывания в стационаре больной выписан. Однако при амбулаторном обследовании в диспансерном кабинете гепатоцентра через 6 месяцев вновь отмечено увеличение активности АЛТ и ACT в 1,3 раза.
Клинический пример 4. Больной Б., 15 лет (№ истории болезни 108), находился на обследовании и лечении в детском инфекционном отделении МУЗ ГКБ №20 г. Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит В с высокой степенью активности. Из анамнеза известно, что ребенок наблюдается с 2008 г. в диспансерном кабинете МУЗ ГКБ №20 г.Красноярска с диагнозом: хронический вирусный гепатит B. При плановом обследовании у ребенка регистрировалось повышение активности АЛТ, и мальчик направлен в стационар.
Результаты биохимического исследования: билирубин общий 19,6 мкмоль/л, АЛТ 5,2 ммоль×ч/л (выше нормы в 7,7 раз), ACT 1,2 ммоль×ч/л (выше нормы в 2 раза).
При исследовании лимфоцитов периферической крови по предложенному способу обнаружено, что соотношение активностей Г6ФДГ и НАДН-ЛДГ составило 44,15 (пример №6 из табл.2), что указывает на развитие обострения.
На 28 день пребывания в стационаре больной выписан. Однако при амбулаторном наблюдении больного в диспансерном кабинете через 6 месяцев вновь отмечено увеличение активности АЛТ и ACT в 1,6 раз.
Технический результат предлагаемого способа:
- возможность прогноза обострений ХГВ у подростков с клинико-биохимической ремиссией;
- однократный забор венозной крови;
- высокий уровень совпадения прогноза.
Предложенный способ позволяет корректировать план и тактику лечения больного на этапах динамического наблюдения и может быть рекомендован для применения в клинической практике.
Источники информации
1. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704 с.
2. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. Высокочувствительное определение активности дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови человека биолюминесцентным методом // Лабораторное дело. - 1989. - №11. - С.23-25.
3. Томилка Г.С., Медяников О.Ю. Способ прогнозирования обострений вирусных гепатитов // Патент РФ №2188429 C2, G01N 33/68, G01N 33/84, БИПМ №6, 27.02.2002.
4. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология. - М.: Медицина, 2000. - 432 с.
5. Boyum A. Isolation of lymphocytes from blood and bone marroow // Scand. J. Clin. Lab. Invest - 1968. - Vol.21 (Suppl. 97). - P.77-80.
6. Jacobs S.R., Rathmell J.C. Lymphocyte selection by starvation: glucose metabolism and cell death // Trends Immunol. - 2006. - Vol.27, №1. - P.4-7.
название | год | авторы | номер документа |
---|---|---|---|
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ОБОСТРЕНИЯ ХРОНИЧЕСКОГО ГЕПАТИТА С У ДЕТЕЙ ПОДРОСТКОВОГО ВОЗРАСТА | 2009 |
|
RU2412444C1 |
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ХРОНИЗАЦИИ ХРОНИЧЕСКОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В У ПОДРОСТКОВ | 2009 |
|
RU2407016C1 |
СПОСОБ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ ДИАГНОСТИКИ СТАДИЙ ХРОНИЗАЦИИ ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА С У ПОДРОСТКОВ | 2013 |
|
RU2528911C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА ПОСЛЕ АОРТОКОРОНАРНОГО ШУНТИРОВАНИЯ | 2011 |
|
RU2466395C1 |
Способ прогнозирования формирования развернутой астматической триады у больных полипозным риносинуситом после полипотомии | 2018 |
|
RU2679414C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПОВТОРНЫХ ЦЕРЕБРОВАСКУЛЯРНЫХ ОСЛОЖНЕНИЙ У БОЛЬНЫХ ГИПЕРТОНИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ В СОЧЕТАНИИ С ИШЕМИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНЬЮ СЕРДЦА В ОСТРОМ ПЕРИОДЕ ИШЕМИЧЕСКОГО ИНСУЛЬТА | 2010 |
|
RU2425640C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗА РАЗВИТИЯ ВОЛНООБРАЗНОГО ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В | 2002 |
|
RU2217760C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ОСЛОЖНЕНИЙ ПРИ ЛЕЧЕНИИ ВНЕБОЛЬНИЧНОЙ ПНЕВМОНИИ | 2016 |
|
RU2629837C1 |
СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ХРОНИЧЕСКОМ АДЕНОИДИТЕ У ДЕТЕЙ | 2012 |
|
RU2495423C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ РАЗВИТИЯ ОСТРОГО ЭНДОМЕТРИТА ПОСЛЕ МЕДИЦИНСКОГО АБОРТА | 2010 |
|
RU2452377C1 |
Изобретение относится к области медицины, а именно к гепатологии и педиатрии. Для прогнозирования обострений хронического вирусного гепатита В у подростков проводят исследование крови. С помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (НАДН-ЛДГ), вычисляют соотношение активностей. При значении полученного показателя, равном или более 1,15, прогнозируют обострения, а при значении показателя менее 1,15 прогнозируют отсутствие обострений. Способ позволяет с высокой точностью прогнозировать обострения хронического вирусного гепатита В у подростков с клинико-биохимической ремиссией. 2 табл.
Способ прогнозирования обострений хронического вирусного гепатита В у подростков путем исследования крови, отличающийся тем, что с помощью биолюминесцентного метода определяют активности ферментов лимфоцитов периферической крови больных: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ) и лактатдегидрогеназы (НАДН-ЛДГ), вычисляют соотношение активностей и при значении полученного показателя, равном или более 1,15, прогнозируют обострения, а при значении показателя менее 1,15 прогнозируют отсутствие обострений.
БЕЛОБОРОДОВА Э.И | |||
и др | |||
Метаболические аспекты прогнозирования исходов хронического вирусного гепатита | |||
- Клиническая медицина, 2005, т.83, №2, с.53-56 | |||
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В | 2007 |
|
RU2325656C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ФОРМЫ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА | 1991 |
|
RU2018845C1 |
СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ПРОЛОНГИРОВАННОГО ТЕЧЕНИЯ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА | 1991 |
|
RU2012881C1 |
Способ прогнозирования развития острой печеночной недостаточности при вирусном гепатите В | 1990 |
|
SU1793376A1 |
РОСЛЫЙ И.М | |||
и др | |||
Креатинфосфокиназа как показатель неблагоприятного течения |
Авторы
Даты
2011-12-27—Публикация
2010-03-09—Подача