СПОСОБ ПРОГНОЗИРОВАНИЯ ИСХОДОВ ОСТРОГО ВИРУСНОГО ГЕПАТИТА В Российский патент 2008 года по МПК G01N33/68 G01N33/53 

Изобретение относится к области медицины, более конкретно к инфекционным болезням, и может быть использовано для прогноза исходов острого вирусного гепатита В (ОВГВ).

Проблема вирусного гепатита является в настоящее время чрезвычайно актуальной в связи с широкой распространенностью этого заболевания. По данным ВОЗ каждый год более 50 млн человек заражаются вирусным гепатитом, что в 100 раз превосходит уровень заболеваемости ВИЧ-инфекцией (1). В настоящее время в мире насчитывается около 350 млн носителей вируса гепатита В. Течение HBV-инфекции варьирует от самоизлечивающегося заболевания до персистирующей инфекции, приводящей у части больных к тяжелым поражениям печени. До сих пор неясно, чем определяется исход заболевания: массивностью вирусной инвазии, характером специфического иммунного ответа, генотипом вируса, генетическим дрейфом поверхностных иммуннодоминантных эпитопов вируса, позволяющих ему отчасти избегать иммунного надзора хозяина, наконец, набором экспрессируемых HLA-антигенов или другими, еще неизвестными причинами. Несомненно, течение и исходы заболевания зависят в значительной степени от состояния иммунной системы пациента, направленности и выраженности иммунного ответа (2, 3, 4). В настоящее время изучены различные аспекты противовирусной реактивности организма, в том числе и при HBV-инфекции. Показано, в частности, что Т-хелперы играют ключевую роль в индукции эффективного гуморального и клеточного антиНВУ-иммунитета. Однако, несмотря на то, что ответы HBV-специфических эффекторных В- и Т-клеток обусловливают элиминацию вируса, у части индивидуумов они не способны воспрепятствовать переходу HBV-инфекции в хроническую форму (5, 6). Показано также, что специфика иммунного ответа при вирусном гепатите играет основополагающую роль в патогенезе повреждения печени. В связи с этим не вызывает сомнения необходимость точного и раннего прогноза характера течения и ожидаемых исходов ОВГВ.

Известны способы прогнозирования исходов ОВГВ, заключающиеся в том, что после выписки из стационара больные находятся под наблюдением в течение 12 месяцев и через 6 месяцев после выписки из стационара проводится обследование на HBsAg и некоторые другие серологические маркеры в ряде случаев на ДНК к вирусу гепатита В. Это является обязательным обследованием в условиях диспансерного наблюдения за реконвалесцентами. Эти данные помимо приказов по диагностике, клинике и лечению вирусных гепатитов (приказ №470, 1989; приказ №220, 1993) приводятся в работе С.Н.Соринсона «Вирусные гепатиты» (7). Автор на основании длительности клинических проявлений, выявления специфических серологических и вирусологических маркеров вирусного гепатита В (ВГВ) прогнозирует развитие хронического течения болезни. Однако недостатком данного способа является ее неточность, есть данные, что через 6 месяцев после перенесенного острого гепатита исчезновение HBsAg, не всегда свидетельствует в пользу полной элиминации вируса из организма, т.к. через год в ряде случаев могут обнаруживаться (это может зависеть от качества тест-систем, использующихся для определения HbsAg методом ИФА, кроме того, чувствительность метода составляет около 85% и подпороговые значения HbsAg могут не улавливаться). ДНК HBV может быть отрицательной, да и не всегда делается. В данной ситуации мы полагаем, что обследование больных на предмет выявления признаков персиситенции вируса при ОВГВ (в частности определение предложенных в работе цитокинов и субпопуляций лимфоцитов) позволить проводить своевременную профилактику перехода инфекции в хроническую форму и адекватную терапию заболевания.

Известен способ Бондаренко А.Л. (8), заключающийся в определении длительности клинических проявлений, выявления специфических маркеров гепатитов В и С, но и некоторых иммунологических параметров (изучение субпопуляционного состава лимфоцитов (CD3, CD4, CD8, CD16, CD21, РБТЛ с ФГА), автор предлагает ряд критериев, прогнозирующих течение и исход вирусных гепатитов В и С. Способ является недостаточно точным, потому что не учитывает изменения такого важного звена иммунитета, как система цитокинов, отражающая соотношение клонов Тh1 и Th2 типов. Кроме этого, этот вид прогнозирования был предложен в группе подростков.

Наиболее близким к предлагаемому является способ прогнозирования исходов острых вирусных гепатитов В и С, приведенный в работе Л.Г.Горячевой (9). Автор предлагает способ прогнозирования течения и исходов ОВГВ и ОВГС путем клинико-иммунологического обследования и определения сывороточных концентраций иммуноглобулинов А, М, Е и цитокинов интерлейкина 1 бета (IL-1β), интерлейкина 8 (IL-8), фактора некроза опухоли альфа (TNF-α) и гамма-интерферона (IFN-γ) и при снижении IL-1β ниже 300 пг/мл, TNF-α ниже 140 пг/мл, IFN-γ ниже 21 пг/мл прогнозируют развитие затяжного течения ОВГВ. Однако при этом, он не является недостаточно точным и информативным, а, также, критерии были определены для пациентов подросткового возраста.

Новая техническая задача - расширение области применения и повышение точности способа.

Для решения поставленной задачи в способе прогнозирования исходов ОВГВ путем иммунологического исследования сыворотки крови в острый период с определением уровня интерферона гамма, интерлейкина 1 бета и фактора некроза опухоли альфа, дополнительно в период поздней реконвалесценции проводят определение содержания субпопуляций CD3+-, CD4+-, CD8+-, СD22+-лимфоцитов, уровень интерлейкина 4, и при увеличении содержания CD3+-, 4+-, 8+-лимфоцитов и нормализации количества СD22+- лимфоцитов прогнозируют благоприятный исход, а при снижении содержания интерферона гамма, уменьшении до «нулевых» значений концентрации 1 бета интерлейкина и интерлейкина 4 в сочетании с продолжающимся снижением численности CD3+-, CD8+- и CD22+-лимфоцитов прогнозируют неблагоприятный исход ОВГВ.

Способ осуществляют следующим образом: исследуют сыворотку больных ОВГВ в острый период (первые 2 недели болезни) и в период поздней реконвалесценции (через 6 месяцев после выписки из стационара) определяют CD-популяционный состав лимфоцитов иммуноцитохимическим методом с помощью реактивов фирмы «Dako» (Дания). Уровень цитокинов в сыворотке крови при помощи наборов для ИФА в соответствии с рекомендациями фирмы-изготовителя. Используют следующие наборы: для определения IL-4 («Протеиновый контур», Санкт-Петербург, Россия); для определения γ-IFN, IL-1β («Вектор-Бест», Новосибирск, Россия). И при увеличении содержания в период поздней реконвалесценции CD3+-, 4+-, 8+- лимфоцитов и нормализации количества CD22+-лимфоцитов прогнозируют благоприятный исход, а при снижении содержания гамма-интерферона, уменьшении до «нулевых» значений концентрации интерлейкина 1 бета и интерлейкина 4 в сочетании с продолжающимся снижением численности CD3+-, CD8+- и CD22+- лимфоцитов прогнозируют неблагоприятный исход ОВГВ.

Способ можно проиллюстрировать на конкретных примерах:

Пример 1.

Больная Л., 21 год (история болезни №78-2003 г.). Диагноз: острый вирусный гепатит В желтушной формы средней степени тяжести. Поступила в инфекционное отделение городской больницы №3 на 7-й день болезни. Ранее вирусным гепатитом не болела. Из эпидемиологического анамнеза удалось выяснить, что половой партнер 3 месяца назад болел ОВГВ и лечился в стационаре. Из перенесенных заболеваний отмечала детские инфекции, ОРВИ. Заболела остро, когда появилось общая слабость, головные боли, тошнота, снизился аппетит. На 4-й-день болезни потемнела моча, была однократная рвота, на 6-й день болезни окружающие заметили иктеричность склер. При осмотре в стационаре состояние больной расценивалось как среднетяжелое - наблюдали иктеричность склер и кожных покровов, внепеченочных знаков и геморрагического синдрома не было. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушивались, тоны сердца ясные, ритм правильный, ЧСС - 60 в одну минуту, АД - 110/70 мм рт.ст. Живот правильной формы, умеренно вздут, при пальпации болезненный в правом подреберье. Печень выступала на 2 см из-под края реберной дуги по правой средне-ключичной линии, край печени закруглен, эластичной консистенции, болезненный при пальпации, размеры печени по Курлову 14:12:11, пальпировался нижний полюс селезенки. Содержание билирубина превышало норму в 8 раз, активость АЛТ в 15 раз, ACT - 11,3 раз, показатель тимоловой пробы в 2 раза, протромбиновый индекс был снижен до 75%. В общем анализе крови палочкоядерные нейтрофилы были повышены в 2 раза, лимфоциты в 1,5 раза, а сегментоядерные нейтрофилы наоборот снижены в 2 раза. Остальные показатели были в пределах нормы. Серологическое исследование на HbsAg, антиHbcoreIgM, HbeAg, антиHbcore суммарные, ДНК HBV-положительные; антиHAV, антиHCV, антиHDV - отрицательные. Показатели иммунного статуса: CD3+ - 46,4%, CD4+ - 19,7%, CD8+ - 17,02%, CD16+ - 8,1%, CD22+ - 9,26%, цитокиновый профиль α-IFN - 13,9 пг/л, γ-IFN - 69,9 пг/л, IL4 - 69,2 пг/мл, IL-1β - 137,2 пг/л, TNF-α - 37,81 пг/мл.

Период реконвалесценции протекал гладко, самочувствие не страдало. При обследовании через семь месяцев после выписки из стационара жалобы на самочувствие отсутствовали. Нарушения пигментного обмена не было, печень и селезенка нормального размера, безболезненны. В биохимическом анализе все показатели в пределах нормы серологическое исследование антиHbs; антиHbcoreIgG - положительные; антиHbsAg - HbcoreIgM, HbeAg, антиHAV, антиHCV, антиHDV, ПЦР на HBV - отрицательные. Проведены исследования согласно предложенному способу: CD3+ - 46,4%, CD4+ - 19,7%, CD8+ - 12,08, CD22+ - 7,5%, цитокиновый профиль γ-IFN - 87,7 пг/л, IL4 - 14,1 пг/мл, IL-1β - 22,1 пг/л, TNF-α - 5,42 пг/мл. По сравнению с острым периодом имелись различия в период поздней реконвалесценции у пациентки повысились показатели CD3+ -, CD4+ -, CD8+ - и нормализовались CD22+-субпопуляционного состава лимфоцитов. Таким образом, у пациентки прогноз был оценен как благоприятный. Отмечена элиминация вируса.

Пример 2.

Больной Д., 23 года (история болезни №19 - 2003 г.). Диагноз: острый вирусный гепатит В желтушной формы средней степени тяжести. Поступил в инфекционное отделение городской больницы №3 на 9-й день болезни. Из эпидемиологического анамнеза удалось выяснить, что 2 месяца назад сделал татуировку. Заболел остро, когда появилось - общая слабость, снизился аппетит, беспокоили тошнота, боли в правом подреберье и эпигастральной области, боли в суставах. На 6-й день болезни потемнела моча, была несколько раз рвота после приема пищи, на 8-й день болезни окружающие заметили иктеричность склер. При осмотре в стационаре состояние больного расценивалось как среднетяжелое - наблюдали иктеричность склер и кожных покровов, внепеченочных знаков и геморрагического синдрома не было. В легких дыхание везикулярное, хрипы не выслушивались, тоны сердца ясные, ритм правильный, ЧСС - 60 в одну минуту, АД - 110/70 мм рт.ст. Живот правильной формы, при пальпации болезненный в правом подреберье. Печень выступала на 2,5 см из-под края реберной дуги по правой средне-ключичной линии, край печени закруглен, эластичной консистенции, болезненный при пальпации, размеры печени по Курлову 14,5:12:11, пальпировался нижний полюс селезенки. Содержание билирубина превышало норму в 7,5 раз, активость АЛТ в 11,7 раз, ACT - 10,5 раз, показатель тимоловой пробы в 2,5 раза, протромбиновый индекс был снижен до 77%. В общем анализе крови палочкоядерные нейтрофилы были повышены в 2,3 раза, лимфоциты в 1,4 раз, а эритроциты наоборот снижены в 1,3 раза, сегментоядерные нейтрофилы - в 2,5 раза. Остальные показатели были в пределах нормы. Серологическое исследование на HbsAg, антиHbcoreIgM, HbeAg, антиHbcore суммарные, ДНК HBV - положительные; антиHAV, антиHCV, антиHDV - отрицательные. Показатели иммунного статуса: CD3+ - 45,4%, CD4+ - 20,7%, CD8+ - 17,58%, CD16+ - 8,8%, CD22+ - 7,3%, цитокиновый профиль α-IFN - 9,9 пг/л, γ-IFN - 133,9 пг/л, IL-4 - 0, IL-1β - 75,5 пг/л, TNF-α - 5,42 пг/мл.

Период реконвалесценции протекал гладко, самочувствие не страдало. При обследовании через семь месяцев после выписки из стационара отмечалась тошнота при нарушение диеты, слабость. Нарушения пигментного обмена не было, печень и селезенка нормального размера, безболезнены. В биохимическом анализе все показатели в пределах нормы серологическое исследование HbsAg, HbeAg, антиHbcoreIgG, ПЦР на HBV - положительные; антиHbcoreIgM, антиHAV, антиHCV, антиHDV - отрицательные. Проведены исследования согласно предложенному способу: CD3+ - 46,4%, CD4+ - 19,7%, CD8+ - 12,08%, CD22+ - 7,5%, цитокиновый профиль (пг/л), γ-IFN - 44,9 пг/л, IL4 - 0, IL-1β - 0, TNF-α - 0,42 пг/мл. По сравнению с острым периодом имелись различия в период поздней реконвалесценции у пациента остались сниженными показатели субпопуляционного состава лимфоцитов, и снижался уровень γ-IFN, а содержание IL-1β и TNF-α было равно нулю. Таким образом, у данного пациента прогноз неблагоприятным, что привело к хронизации HBV-инфекции.

Предлагаемые критерии подобраны на основании анализа клинических наблюдений.

Обследовано 65 мужчин и женщин в возрасте от 18 до 50 лет с острым вирусным гепатитом В (ОВГВ), средний возраст которых составлял 32,3±13,5 лет. Пациенты находились на стационарном лечении в инфекционном отделении городской больницы №3. Больные с ОВГВ наблюдались с момента поступления в стационар (1 неделя желтухи) и до периода поздней реконвалесценции (6-8 месяцев после выписки). Все больные были разделены на две группы: 1-я - 40 человек, больных ОВГВ с последующей элиминацией вируса (при обследовании через 6-8 месяцев после выписки из стационара) и 2 - группа - 25 человек, больных ОВГВ с последующим сохранением вируса. Во 2-й группе через 6-8 месяцев после острого периода сохранялись признаки репликации вируса, о чем свидетельствовало обнаружение HbeAg (ИФА), ДНК HBV методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Диагноз ОВГВ устанавливали при определении у больного следующих критериев: а) наличие по данным эпиданамнеза сроков и обстоятельств заражения, т.е. «точки отсчета» и первичного клинико-биохимического симптомокомплекса острого паренхиматозного гепатита; б) отсутствие в анамнезе указаний на перенесенный в прошлом вирусный гепатит; в) обнаружение в крови больных HBsAg, HBeAg, antiHBe, antiHBcore IgM; г) отсутствие в крови маркеров вирусных гепатитов А, С, D, Е. Диагностика и оценка тяжести заболевания производились в соответствии с общепринятыми требованиями на основании комплекса эпидемиологических и клинико-лабораторных данных. Все больные ОВГВ были средней степени тяжести.

Статическая обработка проводилась с помощью статистических пакетов SAS 9, STATISTICA 7 и SPSS-13. Были использованы следующие методы статистического анализа: расчет описательных статистик (среднее - М, стандартная ошибка среднего - m), оценка интенсивности связи анализируемых признаков (коэффициент ϕ, коэффициент контингенции и V - коэффициент Крамера), сравнение средних значений количественных показателей по критерию Стьюдента для зависимых и независимых выборок. Проверка нормальности распределения вероятности количественных признаков с помощью критерия Колмогорова и критерия Шапиро-Уилки. Сравнения значений показателей, распределение которых не соответствовало нормальному закону, проводились по непараметрическим критериям: дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса с ранговыми метками Вилкоксона и критерий Ван дер Вардена. Для анализа многомерных данных были использованы однофакторный дисперсионный анализ и дискриминанатный анализ. Взаимосвязь количественных признаков оценивалась по значению коэффициента параметрической корреляции Пирсона.

При сравнении субпопуляционного состава Т-лимфоцитов у больных ОВГВ с элиминацией вируса в разгар заболевания и период поздней реконвалесценции было выявлено, что абсолютное и относительное содержание СD3+ - лимфоцитов (р<0,01 и р<0,05 соответственно), относительное количество CD4+ - (р<0,01) и CD8 - экспрессирующих лимфоцитов (р<0,05) и абсолютное и относительное число CD22+ - клеток (р<0,05) в их крови в период разгара были достоверно ниже, чем в фазу выздоровления (см. таблицу). У больных ОВГВ с сохранением вируса показатели субпопуляционного состава лимфоцитов в острый период и на этапе поздней реконвалесценции достоверно не различались (р>0,05) (см. таблицу).

Обращало на себя внимание выраженное изменение концентрации цитокинов в сыворотке крови у пациентов с ОВГВ в разные периоды заболевания в зависимости от элиминации вируса с возможным последующим выздоровлением больного и от сохранения вируса гепатита В с возможной хронизацией инфекционного процесса (см. таблицу).

Оказалось, что у пациентов 1-й группы показатели всех исследуемых цитокинов при сравнении в разгаре болезни и поздней реконвалесценции существенно различались. У пациентов 2-й группы различия в содержании IL-4 в период разгара инфекции и фазу реконвалесценции выявлены не были (р>0,05). Однако уровень γ-INF, IL-1β, TNF-α достоверно уменьшался, причем концентрация в крови IL-1β и IL-4 была в пределах «нулевых значений» (см. таблицу).

Наряду с этим, содержание γ-INF у больных с последующей элиминацией вируса в период разгара оказалось почти в 2 раза ниже, а в период поздней реконвалесценции - напротив, примерно в 2 раза выше, чем у больных с последующим сохранением вируса (см. таблицу).

Эффективность предлагаемого способа прогнозирования подтверждается следующим: до внедрения в работу кафедры инфекционных болезней ФПК и ППС СибГМУ и инфекционного отделения ГБ №3, г.Томска предлагаемого способа прогнозирования исходов ОВГВ проводилась методом изучения только клинико-биохимических, серологических показателей, точность которых не превышала 70%. Предлагаемый способ прогнозирования был применен у 65 пациентов с ОВГВ, при этом точность способа составила 92%.

Таким образом, предлагаемый способ прогнозирования исходов ОВГВ позволяет с наибольшей точностью прогнозировать исходы ОВГВ может быть рекомендован для использоватния в работе инфекционных отделений больниц и гепатологических центров.

Таблица
Иммунологические показатели у больных с острым вирусным гепатитом В в разные периоды заболеванияПоказателиБольные острым гепатитом В с элиминацией вирусаБольные острым гепатитом В с сохранением вирусаПериод разгараПериод реконвалесценцииПериод разгараПериод реконвалесценцииCD3+, %48,00±2,65**59,37±2,0745,33±4,4545,40±3,73СD3+, × 10⁹/л1,05±0,10*1,30±0,070,98±0,200,98±0,30CD4+, %19,16±1,40**27,11±1,8120,83+3,3719,02±0,89CD4+, × 10⁹/л0,42±0,050,59±0,020,42±0,060,38±0,07CD+8, %16,58±1,80*20,63±1,7517,50±3,4312,06±0,89CD8+, × 10⁹/л0,41±0,050,51±0,060,34±0,04*0,23±0,02CD22+, %9,26±0,88**13,32±0,547,50±0,617,64±0,66CD22+, × 10⁹/л0,25±0,04**0,36±0,020,15±0,030,15±0,05γ-INF, пг/мл69,08±10,51*87,71±8,84132,50±15,50*** 44,52±15,39IL-1β137,46±14,59**22,07±2,9380,09±14,24***0IL-469,85±10,85*14,24±1,1200Примечание: * - р<0,05, ** - р<0,01, *** - р<0,001 - между периодом разгара и поздней реконвалесценции

Список литературы

1. Шахгильдян И.В. Парентеральные вирусные гепатиты (эпидемиология, диагностика, профилактика). /И.В. Шахгильдян, М.И. Михайлов, Г.Г. Онищенко. - Москва: ГОУ ВУНЦМ МЗ РФ, 2003. - 383 с.).

2. Ивашкин В.Т. Механизмы иммунного ускользания при вирусных гепатитах. /В.Т.Ивашкин, С.Н.Мамаев, А.О.Буеверов. //Российский журнал гастроэнтерологии, гепатологии, колопроктологии. - 2000. - №5. - С.45-47.

3. Ferrari С., Immunopathognesis of hepatitis В. /С.Ferrari, G. Missale., C. Boni // International EASL consensus conference on hepatitis B: manuscripts. - Geneva, 2002. - P.19-30.

4. Львов Д.К. Новые и вновь возникающие вирусные инфекции. /Д.К.Львов. // Вопросы вирусологии. - 2000. - №4. - С.4-7.

5. Апросина З.Г. Патогенез хронического гепатита В. // З.Г.Апросина, В.В.Серов // Архив патологии. - 2001. - Т. 63, №2. - С.58-61.

6. Хаитов P.M. Оценка иммунного статуса человека в норме и при патологии. /P.M.Хаитов, Б.В.Пинегин //Иммунология. - 2001. - №4. - С.4-6.

7. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты/ С.Н.Соринсон. - 2-е изд., перераб. и доп. - СПб.: Теза, 1998. - 324 с.

8. Бондаренко А.П. Прогнозирование хронического вирусного гепатита. //Российский медицинский журнал. - 1998. - №1. - С.15-17.

9. Горячева Л.Г. Современные подходы в лечении хронических гепатитов у детей. Учебное пособие. - СПб. - 2001. - С.115.

Изобретение относится к области медицины, а именно к инфекционным болезням. Для прогнозирования исходов острого вирусного гепатита В (ОВГВ) проводят иммунологическое исследование сыворотки крови в острый период и определяют уровни интерферона гамма, интерлейкина 1 бета, интерлейкина 4 и содержание субпопуляций CD3+-, CD4+-, CD8+-, С022+- лимфоцитов. При увеличении содержания CD3+-, 4+-, 8+-лимфоцитов и нормализации количества CD22+-лимфоцитов прогнозируют благоприятный исход. При снижении содержания гамма-интерферона, уменьшении до «нулевых» значений концентрации интерлейкина 1 бета и интерлейкина 4 в сочетании с продолжающимся снижением численности CD3+-, CD8+- и CD22+-лимфоцитов прогнозируют неблагоприятный исход острого вирусного гепатита. Использование способа позволяет повысить точность прогноза исходов ОВГВ. 1 табл.

Способ прогнозирования у больных исходов острого вирусного гепатита В путем иммунологического исследования сыворотки крови в острый период и определения уровня интерферона гамма, интерлейкина 1 бета и фактора некроза опухоли альфа, отличающийся тем, что дополнительно в период поздней реконвалесценции определяют содержание субпопуляций CD3+-, CD4+-, CD8+-, CD22+- лимфоцитов, уровень интерлейкина 4 у пациентов взрослой возрастной группы и при увеличении содержания CD3+-, 4+-, 8+- лимфоцитов и нормализации содержания CD22+ лимфоцитов прогнозируют благоприятный исход, а при снижении содержания гамма-интерферона, уменьшении до «нулевых» значений концентрации интерлейкина 1 бета и интерлейкина 4 в сочетании с продолжающимся снижением численности CD3+-, CD8+- и CD22+- лимфоцитов прогнозируют неблагоприятный исход острого вирусного гепатита.