КОМПОЗИЦИЯ АЛЬФА-ФЕТОПРОТЕИНА И ИНДУКТОРОВ АПОПТОЗА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ РАКА Российский патент 2012 года по МПК A61K38/17 A61P35/00 

Настоящая заявка претендует на приоритет патентной заявки США (серийный номер 11/274906), содержание которой включено в этот документ в качестве ссылки во всей полноте.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Настоящее изобретение относится к области медицины, в особенности онкологии. Изобретение предлагает новые композиции и способы для лечения, предупреждения и подавления пролиферации злокачественных клеток у млекопитающих, включающие применение альфа-фетопротеина (AFP), связанного с индуктором апоптоза. Изобретение также предусматривает способ экстракции бутанолом свиного альфа-фетопротеина, полученного из крови и амниотической жидкости на ранних стадиях эмбриогенеза.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Альфа-фетопротеин (AFP) является основным транспортным белком плода, действующим как челнок и имеющим период полувыведения 3-5 дней (Mizejewski, G.J., в книге "AFP and Congenital Disorders", pp.5-34, Academic Press, Orlando, 1985; Abelev, GI, Alpha-fetoprotein: 25 years of study, Tumor Biology, 10:63-74; 1989). Экспрессия AFP в период развития (плода) строго регламентирована, и выявляемый уровень экспрессии в значительной степени зависит от стадии развития. Было установлено, что AFP действует в качестве регулятора роста как в онтогенезе, так и при прогрессии опухолей. В связи с экспрессией в период развития и при туморогенезе AFP рассматривается как онкофетальный антиген.

AFP является гликопротеином, относящимся к суперсемейству альбуминоидных генов, членом которого также является альбумин. Молекулярный вес AFP может варьироваться от 64000 до 72000 дальтон в зависимости от источника происхождения, стадии развития и способа очистки. Процентное содержание связанных углеводов варьируется от 3% до 5%, опять-таки, в зависимости от источника происхождения и стадии развития.

AFP существует в двух основных молекулярных формах: 1) свободная форма и 2) связанная форма, в которой AFP соединен с различными лигандами (например, с жирными кислотами, эстрогенами, фитостероидами). Однако были идентифицированы вариантные формы AFP. Существуют различные конформации (голоформы) связанного AFP, которые зависят от природы и концентрации присоединенного лиганда (лигандов). Были идентифицированы молекулярные варианты AFP человека (HAFP), в которых вариации связаны с микрогетерогенностью углеводов (то есть с различиями углеводных компонентов в сайте гликозилирования HAFP), а также с различиями изоэлектрических точек (Keel, B.A., et al, CRC Press; vol 2, 24-31,1989; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377-408, 2001; Morinaga, T. et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80(15):4604-8, 1983; Parker, M.H. et al, Purification and characterization of a recombinant version of human AFP expressed in the milk of transgenic goats, Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004). Были выявлены генетические варианты HAFP, происхождение которых приписывается специфической для фаз развития экспрессии мРНК HAFP.

Группой авторов Mizejewski G. J. et al. (Tumour Biol. 7(1): 19-36, 1986) была описана циклическая физиология AFP по типу "часов развития". Авторы отмечают, что структура и функция AFP изменяются в ходе развития организма, причем во время развития плода белок экспрессируется на флюктуирующем уровне, а в постнатальном периоде его экспрессия снижается до пренебрежимо малого уровня, поскольку в норме концентрация AFP в сыворотке взрослого человека составляет менее 50 нг/мл (Ruoslahti and Seppala, Int. J. Cancer 8:374-378, 1971). Однако у больных разными формами рака уровень AFP в плазме может повышаться в тысячу раз (Ruoslahti and Seppala, Adv. Cancer Res. 29:275-310, 1979). В дополнение к этому, при многих раковых заболеваниях на поверхности опухолевых клеток экспрессируется высокий уровень рецепторов AFP (Uriel, J. et al, in "Biological Activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol.2, pp.104-117; Moro, R., в книге "Biological Activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol.2, pp.120-127). Таким образом, у человека AFP функционирует не только как маркер пороков развития плода в период эмбриогенеза, но и как постнатальный опухолевый маркер.

Для лечения рака используют разные химические препараты, например, алкалоидные средства, антиметаболиты, алкалоиды, антибиотики, гормоны и иммуномодуляторы, ранее известные в данной области знаний. Однако эти препараты не имеют специфического нацеливания на опухолевые клетки, и их эффект принято называть "фоновым", то есть таким эффектом, когда чувствительностью к противораковому средству обладают также нормальные, неопухолевые клетки. Избыточная экспрессия рецепторов HAFP (HAFPR) на поверхности злокачественных клеток по сравнению с пренебрежимо малой экспрессией рецепторов на нормальных клетках послужила стимулом для исследований по применению HAFP в качестве носителя/транспортировщика противораковых лекарств (Severin, S. E. et al, Biochem. Mol. Biol. Int. 37(2):385-92,1995; Severin, S.E. et al, Dokl. Akad. Nauk 366(4): 561-4, 1999), специфически нацеливающего их на раковые клетки. Было продемонстрировано, что HAFP может нацеливать конъюгаты противораковых лекарств на опухолевые клетки (Moskaleva et ah, Cell Biol Int. 21(12):793-799, 1997; Sotnichenko et al., FEBS Letters 450:49-51, 1999; U.S. Patent No. 6,630,445 to Murgita). Повышение эффективности лекарств, связанное с их специфическим нацеливанием на опухолевые клетки, обусловлено высокой специфичностью HAFP по отношению к раковым клеткам, несущим рецепторы для AFP. В дополнение к этому, такой способ доставки активного агента безопаснее для больного, поскольку нормальные окружающие клетки сохраняются в неприкосновенности.

HAFP образует связи со многими противораковыми лекарствами, включая доксорубицин, дауномицин, калихеамицин, карбоксифосфамид, блеомицетин, хлорбутин, цисплатинум, метотрексат и карминомицин, которые описаны в литературе (Moskaleva et al., Cell Biol. Int. 2l(12):793-799, 1997; Lutsenko et al, Tumor Biology 21(6):367-374, 2000). В этих случаях активные агенты были связаны с HAFP при помощи методов химической конъюгации, которые дают образование ковалентных связей между HAFP и противораковым агентом. Оптимальное молярное соотношение AFP:лекарство в конъюгатах AFP-лекарство, позволяющее ингредиентам соединяться без потери их биологической активности и обеспечивающее целенаправленную доставку лекарства по данным научных исследований, составляет 1:2 (Feldman, N.B. et al, Biochemistry 65:1140-1145, 2000). Такого же молярного соотношения 1:2 можно добиться при нековалентном связывании AFP и диоксина (Sotnichenko et al, FEBS Letters 450:49-51, 1999).

Группа авторов Herve et al. (в книге "Biological activities of alpha-fetoprotein", Florida Congresses, ed. Mizejewski, G.J., CRC Press, Inc., Boca Raton, Vol. 1, 1987) продемонстрировали сайты связывания варфарина и фенилбутазона на крысином AFP, сходные с таковыми для альбумина. В дополнение к этому, они продемонстрировали, что эти агенты связываются с AFP в одном и том же большом гидрофобном кармане, наряду с эстрогенами, жирными кислотами, пиразольными соединениями и пропионовыми лекарствами. В обзоре, представленном Mizejewski (Mizejewski, G.J., в книге "AFP and congenital disorders", ed. G.J. Mizejewski, Academic Press, Inc., 1985), приводятся данные о том, что жирные кислоты способны связываться с AFP человека и AFP грызунов, тогда как фитоэстрогены способны связываться только с AFP грызунов, а это свидетельствует о межвидовых различиях в особенностях связывания AFP.

Основным источником AFP, использованным в экспериментах по нацеленной доставке AFP/лекарств, был AFP человека, либо выделенный из женской ретроплацентарной сыворотки (Moskaleva et al., Cell Biol Int. 21(12):793-799, 1997), либо материал плодного происхождения (www.alfetin.ru). Плодный материал человека трудно получать из-за скудости источников (экстрагирование из абортного материала в сроке беременности до 12 недель), что делает его излишне дорогостоящим. В России плодный (фетальный) AFP человека зарегистрирован как иммуномодулирующий инъекционный лекарственный препарат под названием "Альфетин" (1 ампула содержит 0,075 мг AFP 95% чистоты). Таким образом, весьма полезны и выгодны были бы альтернативные источники AFP, способного доставлять цитотоксические агенты в раковые клетки.

По опубликованным данным противораковые агенты с разными способами действия запускают апоптоз в клетках, чувствительных к химиотерапевтическим препаратам (Fisher, Cell 78:539-542, 1994). Ведущую роль в апоптотической гибели клеток, включая клеточную смерть, индуцированную противораковыми агентами, играют изменения в митохондриальной функции, в частности проницаемость митохондриальной мембраны и/или альтерации в поровом комплексе переходной проницаемости (Kroemer et al, Immunol Today 18:44-51, 1997; Susin et al, J Exp. Med. 186:5-37, 1997; Marchetti et al., J. Exp Med. 184:1155-1160, 1996; Zamzani et al., J. Exp. Med. 183:1533-1544, 1996; Decaudin et al, Can Res 57:62-67, 1997). Многие традиционные химиотерапевтические агенты вызывают митохондриальную проницаемость непрямым образом через индукцию эндогенных эффекторов, вовлеченных в физиологический контроль апоптоза, например p53. Однако частые мутации гена p53 при многих разнообразных раковых заболеваниях человека делают эти раки резистентными к воздействию традиционных химиотерапевтических агентов. Открытие цитотоксических агентов, воздействующих непосредственно на митохондрии, таких как лонидамин, арсенит, бетулиновая кислота и CD437, легло в основу альтернативной терапевтической стратегии, применимой в тех ситуациях, когда традиционные лекарства неэффективны из-за разрушения эндогенных путей индукции апоптоза, например, с вовлечением p53 (см. обзор по этой проблеме в ссылке Costantini et al, J. Natl. Cancer Institute 92:1042-1053, 2000). В литературе описаны цитотоксические агенты, нацеленные на митохондрии и индуцирующие клеточный апоптоз, например бетулиновая кислота (Fulda, S. et al, J. Biol. Chem. 18; 273 (51): 33942-8, 1998; Pezzuto et al. Публикация патентной заявки США № 20030186945). Costantini et al. в своем обзоре рассматривают механизм индукции апоптоза через разрушение митохондрий посредством альтераций проницаемости митохондриальной мембраны и/или изменений в поровом комплексе переходной проницаемости (PTPC) и перечисляют цитотоксические агенты, которые нацелены на митохондрии для индукции апоптоза (J. Natl. Cancer Inst. 92(13): 1042-53, 2000).

Применение единого конъюгата HAFP/противораковый агент (например, конъюгата HAFP-эстрон-доксорубицин) рассматривается как лимитирующий фактор при лечении злокачественных новообразований в связи с тем обстоятельством, многие и самые разные типы рака не поддаются химиотерапии и, как принято говорить, проявляют мультилекарственную резистентность (MDR) (Lehnert M., Eur. J. Cancer, 32A:912-920, 1996; Germann U.A., Eur. J. Cancer, 32A:927-944, 1996). Кроме того, многие противораковые агенты относятся к алкилирующим соединениям и антибиотикам, то есть индуцируют гибель опухолевых клеток за счет нацеливания на ДНК, то есть их действие в значительной степени основано на интактности сигнального пути p53 (Bykov, V.J. et al, Nat. Med. 8(3):282-8, 2002). Если учесть, что большое число опухолей ассоциируется с утратой функционального p53, такое лечение часто оказывается неэффективным.

Таким образом, существует потребность в улучшенных механизмах доставки цитотоксических агентов в раковые клетки, которые просты, недороги в производстве, реализуются без инвазивного вмешательства и характеризуются одновременно как высокой эффективностью, так и специфичностью в уничтожении раковых клеток.

Настоящее изобретение может реально обеспечить одно и более из вышеуказанных преимуществ или другие преимущества, которые станут очевидными для компетентных специалистов после ознакомления с настоящей заявкой.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Вкратце, изобретение связано с новыми композициями, содержащими AFP, и способами предупреждения, лечения или подавления злокачественных новообразований, экспрессирующих альфа-фетопротеиновый рецептор (AFPR). Изобретение также связано со способом экстракции бутанолом свиного альфа-фетопротеина, полученного из крови и амниотической жидкости на ранних стадиях эмбриогенеза.

В одном из вариантов реализации изобретение предлагает композицию, содержащую нековалентный комплекс экзогенного альфа-фетопротеина (AFP) и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который выбран из группы, включающей агенты, повышающие проницаемость митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальных пор, ионофоры, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3 и ретиноиды, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связан с экзогенным AFP. В одном из вариантов реализации изобретения композиция включает два агента, индуцирующих апоптоз, которые способны обратимо связываться с экзогенным AFP. В другом варианте реализации изобретения композиция включает агенты, индуцирующие апоптоз, которые могут быть выбраны из группы, включающей: атрактилозид, бетулиновую кислоту, тапсигаргин, ротенон, пиерицидин A, лонидамин, CD437, трехокись мышьяка, A23187, иономицин, витамины D2 и D3, дексаметазон и аккутан.

В настоящем изобретении предложено также использовать экзогенный AFP для доставки в раковую клетку (в организме млекопитающего) по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который можно выбрать из группы, включающей агенты проницаемости митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальных пор, ионофоры, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3 и ретиноиды, где по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с AFP, раковое заболевание экспрессирует по меньшей мере один рецептор AFP, а экзогенный AFP связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP.

В одном из вариантов реализации в изобретении предложено применение композиции, содержащей нековалентный комплекс из экзогенного альфа-фетопротеина (AFP) и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который можно выбрать из группы, включающей агенты проницаемости митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальной поры, ионофоры, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3 и ретиноиды, для получения лекарственного средства для нацеленной доставки в раковую клетку млекопитающего по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, причем указанная раковая клетка экспрессирует по меньшей мере один рецептор AFP на своей поверхности по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с экзогенным AFP, а экзогенный AFP связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP.

В другом варианте реализации изобретения предложено применение композиции, содержащей нековалентный комплекс из экзогенного альфа-фетопротеина (AFP) и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который можно выбрать из группы, включающей агенты проницаемости митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальной поры, ионофоры, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3 и ретиноиды, для подавления пролиферации раковых клеток у млекопитающего, причем указанная раковая клетка экспрессирует по меньшей мере один рецептор AFP на своей поверхности по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с экзогенным AFP, а экзогенный AFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP на поверхности клетки.

Еще в одном варианте реализации в изобретении предложено применение композиции, содержащей нековалентный комплекс из экзогенного альфа-фетопротеина (AFP) и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который можно выбрать из группы, включающей агенты проницаемости митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальной поры, ионофоры, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3 и ретиноиды, для лечения множественной лекарственной резистентности рефрактерных злокачественных новообразований, причем указанные рефрактерные злокачественные новообразования содержат раковую клетку, экспрессирующую по меньшей мере один рецептор AFP на своей поверхности, по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с экзогенным AFP, а экзогенный AFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP на поверхности клетки.

Еще в одном варианте реализации изобретение также предлагает способ подавления пролиферации раковой клетки у млекопитающего, причем указанная раковая клетка экспрессирует на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, а указанный способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей нековалентный комплекс из экзогенного AFP и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который можно выбрать из группы, включающей агенты проницаемости митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальной поры, ионофоры, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3 и ретиноиды, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связан с экзогенным AFP, а экзогенный AFP специфически связан по меньшей мере с одним рецептором AFP на поверхности клетки.

Еще в одном варианте реализации изобретение предлагает способ лечения множественной лекарственной резистентности рефрактерных злокачественных новообразований, причем указанные рефрактерные злокачественные новообразования содержат раковые клетки, экспрессирующие на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, а указанный способ включает введение млекопитающему терапевтически эффективного количества композиции, содержащей нековалентный комплекс из экзогенного AFP и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, который можно выбрать из группы, состоящей из агентов проницаемости митохондриальной мембраны, агентов, индуцирующих открытие митохондриальной поры, ионофоров, активаторов каспазы 9, активаторов каспазы 3 и ретиноидов, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связан с экзогенным AFP, а экзогенный AFP специфически связан по меньшей мере с одним рецептором AFP на поверхности клетки.

Еще в одном варианте реализации изобретение связано со способом экстракции свиного AFP из сырьевого материала с использованием бутанола, причем указанный способ включает последовательные этапы:

(a) собирания крови и амниотической жидкости от свиных эмбрионов в сроке беременности приблизительно от 3 до 14 недель;

(b) разделения крови и амниотической жидкости, собранной на этапе (a) на супернатант и преципитат;

(c) сбора супернатанта, полученного на этапе (b);

(d) сгущения супернатанта, накопленного на этапе (c), для получения концентрированного раствора;

(e) добавления бутанола к концентрированному раствору из этапа (d) до получения конечной концентрации бутанола в растворе приблизительно от 5% до 10%;

(f) взбалтывание раствора бутанола, полученного на этапе (e);

(g) разделение раствора бутанола, полученного на этапе (f), на верхнюю безводную фазу и нижнюю водную фазу;

(h) сбор безводной фазы, полученной на этапе (g), для получения конечного раствора, содержащего несвязанный свиной AFP.

В рамках некоторых специфических вариантов реализации изобретения описанные выше композиции содержат первый и второй агенты, индуцирующие апоптоз, в уникальных дозах.

В одном из вариантов реализации изобретения источником AFP, используемого в композициях, является организм млекопитающего. Еще в одном варианте реализации изобретения AFP извлекают из организма свиньи (PAFP). В других вариантах реализации изобретения AFP происходит от приматов, крупного рогатого скота, лошадей, собак, кошек или овец. AFP может иметь природное происхождение или представлять собой рекомбинантную форму AFP.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 - схема пути апоптоза, опосредованного каспазой в раковых клетках, подвергнутых воздействию химиотерапевтического агента.

Фиг.2 - электрофорез в геле чистого концентрата AFP (дорожка "C"), концентрата AFP, связанного с атрактилозидом (дорожка "A"), и стандартных маркеров молекулярного веса. Дорожка "B" сброшена для другого эксперимента.

Фиг.3 - объем опухоли (в см³) как функция времени (в днях) в мышиной модели лейкоза после лечения композициями PAFP-агент, индуцирующий апоптоз. Клетки лейкоза P-388 вводили мышам DBA₂ подкожной инъекцией. Через один день после инокуляции животные начали получать ежедневное лечение по следующей схеме: 1. препарат A (PAFP - атрактилозид (A)); 2. препарат T (PAFP - тапсигаргин (T)); 3. препарат S (экстракт селезенки (S)); 4. препарат A+S; 5. препарат T+S; 6. контроль (масло); 7. контроль (вода).

Фиг.4 - показатели выживания мышей DBA₂ после подкожной инъекции клеток лейкоза P-388 и последующего ежедневного лечения через день после инокуляции по следующей схеме: 1. препарат A (PAFP - продукт атрактилозида); 2. препарат T (PAFP - продукт тапсигаргина); 3. препарат S (экстракт селезенки); 4. препарат A+S; 5. препарат T+S; 6. контроль (масло); 7. контроль (вода).

Фиг.5 - объем опухоли (в см³) как функция времени (в днях) после подкожной инъекции мышам DBA₂ клеток лейкоза P-388 и их последующего ежедневного лечения, начатого через один день после инокуляции, по следующей схеме: 1) контроль (вода); 2) контроль (масло); 3) PAFP - бетулиновая кислота; 4) PAFP - бетулиновая кислота плюс дополнительная несвязанная бетулиновая кислота.

Фиг.6 - сравнение компьютерных томограмм до (слева) и после (справа) 8-недельного курса перорального лечения капсулами PAFP-атрактилозид ракового больного P. с метастатической аденокарциномой толстой кишки, демонстрирующее элиминацию метастаза в печени.

Фиг.7 - сравнение компьютерных томограмм до (слева) и после (справа) 6-недельного курса перорального лечения капсулами PAFP-атрактилозид ракового больного P.N.G. с метастатической аденокарциномой толстой кишки, демонстрирующее элиминацию метастаза в печени.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Изобретение относится к композициям, которые полезны для нацеленной доставки агентов, индуцирующих апоптоз, к раковым клеткам. Композиции, предлагаемые настоящим изобретением, составлены из экзогенного AFP, нековалентно связанного с соединениями, которые индуцируют апоптоз за счет прямого воздействия на митохондриальную функцию, то есть действуют в обход потребности вызывать апоптотическую реакцию через первоначальные ядерные сигналы. В одном варианте реализации изобретения источником AFP является свиной организм, а в другом AFP экстрагируют из свиных эмбрионов и амниотической жидкости в сроке беременности от 3 до 14 недель. Специфические соединения, полезные в настоящем изобретении для нековалентного связывания с AFP, включают атрактилозид, бетулиновую кислоту, тапсигаргин, CD437, ротенон, piercidin A и лонидамин.

Термин «агент, индуцирующий апоптоз», относится здесь к химическим или природным соединениям, обладающим способностью индуцировать апоптотическую гибель клеток. В одном из вариантов реализации изобретения агент, индуцирующий апоптоз, прямым образом воздействует на митохондрии. Такие соединения могут вызывать апоптоз, воздействуя на проницаемость митохондриальной мембраны, индуцируя открытие митохондриальных пор, меняя потенциал митохондриальной мембраны, а также активируя управляющие каспазы, в частности каспазу 3 и каспазу 9.

В контексте настоящего изобретения агент, индуцирующий апоптоз, индуцирует апоптоз в целевых раковых клетках, которые экспрессируют на своей поверхности рецепторы AFP. Примеры агентов, индуцирующих апоптоз и пригодных для применения в настоящем изобретении, включают (или получены из них), но не ограничиваясь ими, агенты, индуцирующие проницаемость митохондриальной мембраны, например атрактилозид, бетулиновую кислоту, тапсигаргин, CD437, лонидамин, трехокись мышьяка и ротенон, активаторы каспазы, например Pac-1 (Putt et al., Nature Chem. Biol. 2:543-550, 2006), ионофоры, например кальцимицин/A23187 и валиномицин, а также ретиноиды, например аккутан и цис-ретиноевую кислоту, такой известный химиотерапевтический агент как дексаметазон, такие антибиотики как олигомицин B, гидроксихлорохин фосфат, антиоксиданты, например кверцетин, витамин A, витамины D2 и D3, куркумин и капсаицин, тяжелые металлы, например цинк, свинец, медь, никель и кадмий (http://www.sigmaaldrich.com/catalog/search/TablePage/9560323, http://www.biomol.com/Online_Catalog/Online_Catalog/Products/36/?categoryId=234, http://www.emdbiosciences.com/html/cbc/apoptosis_inducers.html,
http://www. axxora.com/ apoptosisinducers inhibitors/opfa. 1014.2.1.0.html).

Термин «обратимость» при использовании здесь означает способность возвращаться в первоначальное («несвязанное») состояние, когда экзогенный AFP после доставки в раковую клетку первого агента, индуцирующего апоптоз (атрактилозида, тапсигаргина, бетулиновой кислоты, CD 437, трехокиси мышьяка, ротенона, лонидамина), повторно в несвязанном виде переходит во внеклеточную среду, где он способен связываться с другим соединением, к которому он имеет неотъемлемую аффинность связывания (атрактилозид, тапсигаргин, бетулиновая кислота, CD 437, трехокись мышьяка, ротенон, лонидамин). Возможно, что экзогенный AFP рециркулирует во внеклеточную среду неоднократно. Ранее во многих исследованиях in vitro было продемонстрировано, что AFP способен доставлять в клетки полиненасыщенные жирные кислоты (PUFA) через эндоцитоз, опосредованный рецепторами AFP, после чего он возвращается во внеклеточную среду в неизмененном виде (Torres et al, Int. J. Cancer 47:110-117, 1991; Uriel et al, в книге "Biological activities of alpha-fetoprotein", Florida Congresses, под редакцией Mizejewski, GJ, CRC Press Inc., Boca Raton, Vol. 2, 1987; а также Laborda et al, Int. J. Cancer 40:314-318, 1987). Эти исследования позволили предположить, что рециркулирующий AFP по возвращении во внеклеточное пространство способен повторно связываться с агентом, индуцирующим апоптоз.

Термин «терапевтически эффективное количество» при использовании здесь означает такое количество композиции, предлагаемой настоящим изобретением, которое при введении больному улучшает или облегчает симптомы описанного здесь рака (сóлидного или несóлидного). Специфическая доза композиции, вводимой согласно этому изобретению, несомненно, будет определяться индивидуальными обстоятельствами конкретного случая, включая, например, вводимую композицию, способ ее введения, клиническое состояние больного и тип рака, подлежащего лечению. Раковые заболевания, подходящие для лечения, предлагаемого настоящим изобретением, это такие формы рака, при которых раковые клетки экспрессируют рецепторы альфа-фетопротеина (AFPR). Примеры раковых заболеваний, демонстрирующих экспрессию AFPR, включают, но не ограничиваясь ими, рак мочевого пузыря, рак молочной железы, рак толстой и прямой кишки, рак эндометрия, рак почек (почечно-клеточный), лейкоз, рак печени, рак легких, меланому, неходжкинскую лимфому, рак яичников, рак поджелудочной железы, рак предстательной железы, рак кожи (не меланома), рак яичек и рак щитовидной железы (Moro-Vidal, R., Curex Technologies Inc., www.biocurex.com).

Термин «больной» означает всех млекопитающих, включая человека. Примеры больных включают человека, других приматов, крупный рогатый скот, собак, кошек, коз, овец, свиней, лошадей и кроликов.

Настоящее изобретение затрагивает применение экзогенного альфа-фетопротеина (AFP), действующего как носитель или транспортировщик агентов, индуцирующих апоптоз, непосредственно в раковые клетки, что приводит к апоптозу раковых клеток. Патенты США под номерами 6630445 и 6534479 описывают применение рекомбинантного AFP человека для конъюгации с цитотоксическими агентами. Ранее Nishi et al. (Ann. New York Acad. Sci. 259:109-118, 1975) продемонстрировали перекрестно-видовое сходство AFP млекопитающих в отношении иммунологических и антигенных свойств, что порождает возможность использования альтернативных источников AFP от разных млекопитающих. Сходство свиного AFP и AFP человека позволяет предположить, что свиной AFP можно применять для доставки агентов, индуцирующих апоптоз, в раковые клетки вместо AFP человека (таблица 1).

Таблица 1
Сравнение свойств AFP человека (HAFP), рекомбинантного AFP человека (rHAFP) и свиного AFP (PAFP) Свойство HAFP rHAFP PAFP % аминокислотного сходства с альбумином 40 40 38 % гликозилирования 3-4 0 3-4 Гликозилирующие сахара Различные 0 Неизвестны Микрогетерогенность Да Нет Нет Возможность патогенной контаминации из источника происхождения Да Нет Нет Этические проблемы, связанные с источником происхождения Да Нет Нет Способность связывания жирных кислот Да Неизвестна Да Аффинность к гидрофобному лиганду Да Неизвестна Да Противораковая активность
(AFP-опосредованная доставка связанных агентов, индуцирующих
апоптоз, в раковые клетки) Да Неизвестна Да

(Бластный анализ NCBI http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/; Parker, M.H. et al, Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004).

Термин «экзогенный» означает здесь происходящий извне больного или организма.

Изобретение относится к композиции экзогенного AFP и первого агента, индуцирующего апоптоз, который обратимо связан с экзогенным AFP in vitro, образуя комплекс AFP-первый агент, индуцирующий апоптоз, причем такая композиция также может включать второй агент, индуцирующий апоптоз, оба агента, индуцирующих апоптоз, представляют собой противораковые лекарства (то есть атрактилозид, тапсигаргин, бетулиновую кислоту, CD 437, трехокись мышьяка и лонидамин), а второй агент, индуцирующий апоптоз, способен обратимо связываться с рециркулирующим экзогенным AFP in vivo. Первый и второй агенты, индуцирующие апоптоз, могут быть одним и тем же веществом (например, бетулиновой кислотой) или разными веществами (например, бетулиновой кислотой и CD 437).

Наличие множественных доменов связывания на AFP создает возможность одновременного связывания с AFP in vitro более чем одного класса агентов, индуцирующих апоптоз (Hirano, K. et al., Biochem. J., 231:189-191, 1985; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5): 377-408, 2001). Это связано с тем фактом, что одни связывающие домены взаимодействуют с гидрофобными лекарствами, а другие связывающие домены взаимодействуют с гидрофильными или амфифильными лекарствами.

Согласно одному из вариантов реализации изобретения раковый больной должен получать ежедневную дозу изобретенной композиции, в которой общая суточная доза потребляемого AFP составляет от 0,07 мг до 1,2 мг в зависимости от состояния больного и агрессивности заболевания. Такая концентрация AFP основана на его физиологической концентрации, обычно обнаруживаемой в циркулирующей крови во время беременности. В мышиных аналогах соизмеримые дозы составляют от 0,0014 мг до 0,024 мг в соответствии с руководящими указаниями, представленными в ссылке "Natural Compounds in Cancer Therapy", (Boik, J., Natural Compounds in Cancer Therapy. Oregon Medical Press, 2001, pp.8-10).

Композиция, предлагаемая настоящим изобретением, может содержать варьирующиеся молярные соотношения первого и второго агентов, индуцирующих апоптоз, например, от эквимолярного соотношения до избытка первого агента, индуцирующего апоптоз, по отношению к AFP или от эквимолярного соотношения до избытка второго агента, индуцирующего апоптоз, по отношению к AFP. Условия связывания in vitro первого агента, индуцирующего апоптоз, с AFP зависят от свойств первого агента, индуцирующего апоптоз (то есть от его гидрофильности или гидрофобности). В типичном случае AFP смешивается с первым агентом, индуцирующим апоптоз, так, что молярное соотношение AFP и первого агента, индуцирующего апоптоз, варьируется от 1:1 до 1:3. Более типичное смешивание AFP с первым агентом, индуцирующим апоптоз, проводится в молярном соотношении AFP и первого агента, индуцирующего апоптоз, варьирующемся в диапазоне от 1:1 менее чем до 1:3. Первый агент, индуцирующий апоптоз, может быть составлен из одного и более противораковых лекарств. Однако при использовании составных лекарств необходимо быть уверенным в том, что каждое из лекарств связывается с другим (самостоятельным) доменом связывания на AFP, как упоминалось выше.

Экстрагируемый материал подвергают диафильтрации для удаления мелких несвязанных молекул без разрушения комплекса PAFP-агент, индуцирующий апоптоз. Ранее Sotnichenko et al. (FEBS Letters 450:49-51, 1999) продемонстрировали, что фетальный AFP человека образует комплекс с диоксином в молярном соотношении 1:2, а фильтрация в геле эффективно удаляет несвязанные молекулы без разрушения комплекса AFP-диоксин.

В типичном случае второй агент, индуцирующий апоптоз, представлен в таком количестве, которое по меньшей мере в 10 раз ниже количества, используемого в способах, описанных в известном уровне техники. Например, Pezzuto еt al. (патентная заявка США № 20030186945) рекомендуют дозу бетулиновой кислоты 3000 мкг (ежедневная пероральная доза от 0,2 мг до 500 мг), тогда как в настоящем изобретении доза бетулиновой кислоты (второго агента, индуцирующего апоптоз) может быть снижена до 150 мкг. В настоящем изобретении предлагается комплексировать 0,6 мг PAFP с 0,007 мг бетулиновой кислоты. В другом варианте реализации изобретения в лекарственную рецептуру включают 0,15 мг несвязанной бетулиновой кислоты.

PAFP нестабилен и может агрегироваться, выпадать в осадок или становиться неактивным в результате манипуляций, например, таких, которые связаны со способом конъюгации и были описаны ранее (G.J. Mizejewski, "Alpha-fetoprotein", в книге Monographs on Endocrinology, ed. Ulrich Westphal, Steroid-protein interactions II, Springer-Verlag, Berlin, New-York, Tokyo, 1986, pp.320-356; Nunez, E.A. et al, The physiochemical and biological properties of AFP depend on its ligand environment, J. Nucl. Med. Allied Sci., 33:18-16,1989). В настоящем изобретении время, необходимое для того, чтобы in vitro при 18-25°C произошла связь PAFP с первым агентом, индуцирующим апоптоз составляет 10 минут, что намного меньше времени, необходимого для осуществления способа нековалентного связывания, описанного на ранее известном уровне техники, когда время выстаивания при 18-25°C составляет 10-12 часов (например, патент США № 6878688, выданный Pak et al). Снижение времени для достижения связи in vitro между PAFP и первым агентом, индуцирующим апоптоз, можно приписать следующим факторам: (1) более высокой концентрации несвязанного PAFP, способного вступать в связь, который представлен в концентрате, полученном методами ультрафильтрации и экстракции бутанолом, предложенными настоящим изобретением, и (2) микрогомогенностью PAFP, полученного в предложенном способе, по сравнению с HAFP, полученным другими способами, для которого, как указано выше, характерна микрогетерогенность (Wu, J.T. and Clayton, F., "Detection and isolation of various isoforms of human AFP", в книге "Biological activities of AFP", CRC Press, 1987, Boca Raton, Florida, vol.2, pp.3-14; ' Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med., vol. 226(5):377-408, 2001).

В типичном случае первый агент, индуцирующий апоптоз, относится к одному из классов противораковых лекарств и представлен в ежедневной концентрации не более 150 мкг. Агенты, индуцирующие апоптоз, которые полезны в настоящем изобретении, предпочтительно, выбираются из группы, включающей агенты проницаемости митохондриальной мембраны, агенты, индуцирующие открытие митохондриальных пор, активаторы каспазы 9, активаторы каспазы 3, ионофоры и ретиноиды.

Устойчивость ко многим лекарствам, или множественная лекарственная резистентность (MDR), часто ассоциирована с высоким уровнем экспрессии насоса gp170 на поверхности раковых клеток (Lehnert M., Eur J Cancer 32A: 912-920, 1996; Germann U.A., Eur. J. Cancer 32A:927-944, 1996; Thomas, H.,. et al, Cancer Control 10(2): 159-165, 2003). Однако известно, что MDR также наблюдается в клетках с поврежденным p53 или с повышающей регуляцией экспрессии такого ингибитора апоптоза как Bcl-2 (Jaattela, M., Exp. Cell Res. 248:30-43, 1999). Многие химиотерапевтические агенты нацелены на мишени, расположенные выше активности p53, например, ДНК, РНК, телоизомеразы и топоизомеразы. Эти агенты не эффективны в индукции апоптоза в клетках с поврежденным p53 или с повышающей регуляцией Bcl-2 (Evan, G.I. and Vousden, K.H., Nature 411:342-348, 2001)(фиг.1). Группа авторов Moskaleva et al. (Cell Biol. Int., 21(12):793-799, 1997) продемонстрировала, что конъюгаты AFP-лекарство эффективно уничтожают раковые клетки с множественной лекарственной резистентностью, в которых наблюдается избыточная экспрессия MDR (насос откачки p-гликопротеиновых лекарств), а это позволяет предположить, что опосредованный рецепторами эндоцитоз конъюгатов AFP-лекарство способен побеждать раки с множественной лекарственной резистентностью. В настоящем изобретении выбор агентов, индуцирующих апоптоз, основан на их способности индуцировать апоптоз на уровне митохондрий, то есть ниже p53. Благодаря своим воздействиям на проницаемость митохондриальной мембраны, перенос через митохондриальные поры и/или активацию каспазы, эти индукторы апоптоза способны вызывать цитотоксические эффекты в отношении раковых клеток, обладающих множественной лекарственной резистентностью (фиг.1).

Предпочтительно, чтобы агенты, индуцирующие апоптоз, применительно к настоящему изобретению, были получены из природных источников (Pessayre et al., "Apoptosis Trigged by Natural Substances", в книге "Apoptosis and Its Modulation by Drugs", eds. R.G. Cameron, G. Feuer, Springer Press, 2000, pp. 86-108). Например, бетулиновую кислоту получают из бетулина, вещества, которое в изобилии находится в бересте березы пушистой (Betula alba). Типичные агенты, индуцирующие апоптоз, которые полезны для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь ими, тапсигаргин, атрактилозид, бетулиновую кислоту, CD437, трехокись мышьяка, ротенон, пиерицидин A и лонидамин.

Другие примеры агентов, индуцирующих апоптоз, которые подходят для применения в настоящем изобретении, включают, но не ограничиваясь ими (или получены из них), дексаметазон, олигомицин B, гидроксихлорохин фосфат, кверцетин, витамин A, витамины D2 и D3, куркумин, капсаицин, а также такие тяжелые металлы, как цинк, свинец, медь, никель, кадмий, и химиотерапевтические агенты.

Композиции, предлагаемые настоящим изобретением, могут быть доставлены в раковую клетку любым известным в настоящее время способом введения, включая, но не ограничиваясь ими, пероральные дозовые формы (капсулы, мягкие гели и таблетки), суппозитории, ингаляции, носовые или глазные капли, бандажи, нюхательные порошки, инъекционные формы, линименты (жидкие мази) и лекарственные формы для местного применения. В одном из вариантов реализации изобретения композиции изготавливают для перорального дозирования в виде мягких гелей. В другом варианте реализации изобретения композиции изготавливают для внутривенного дозирования в виде инъекционных препаратов.

ПРИМЕР 1

Выделение и очистка PAFP

PAFP экстрагировали из печени и крови свиных эмбрионов из амниотической жидкости и из плаценты. Стадия развития плода, на которой проводят экстракцию, критически важна из-за флюктуации посттрансляционных свойств PAFP, что может повлиять как на его биологическую активность, так и на способность связываться с агентами, индуцирующими апоптоз. PAFP, экстрагированный из плодного материала на ранних сроках вынашивания (до 3 недель) или на поздних сроках вынашивания (после 14 недель), имеет другие показатели гликозилирования по сравнению с PAFP, экстрагированным из плодного материала в сроке вынашивания от 3 до 14 недель (Ruoslahti, E. et al, Int. J. Cancer, 22:515-520, 1978; Keel, B.A. et al, в книге "Biological Activities of Alpha 1-Fetoprotein", Boca Raton, Florida, CRC Press vol 2, pp. 24-31, 1989; Mizejewski, G.J., Exp. Biol. Med. 226(5):377-408, 2001; Parker, M.H. et al, Protein Expression and Purification, 38:177-183, 2004; Mizejewski, G.J., в книге "Monographs on Endocrinology", ed. Ulrich Westphal, Steroid-protein interactions II, Springer-Verlag, Berlin, New-York, Tokyo, 1986, pp.320-356). Было сказано, что разные показатели гликозилирования влияют на связывающие свойства HAFP, то есть сроки экстрагирования жидкостей из эмбриона критически важны, поскольку гликозилирование PAFP подвержено вариациям в ходе эмбриогенеза, а выход (количество) жидкости после 14-й недели беременности значительно снижается. В идеальном варианте плодный материал у свиней собирают в промежутке от 3-й до 14-й недели эмбриогенеза и подвергают его способу экстракции.

После экстракции кровь и амниотическую жидкость (далее "сырьевой материал") выдерживали при температуре 4-10°C от 12 до 24 часов для развития естественного осаждения. Супернатант собирали и переносили в другой контейнер, после чего концентрировали его в 3-5 раз ультрафильтрацией с использованием мембраны 50 кДа. В способе ультрафильтрации температура не превышала 15°C. Этот этап концентрации позволял существенно увеличить выход PAFP. Затем добавляли бутанол до конечной концентрации 5-10% (в типичном случае конечная концентрация бутанола составляла приблизительно 8%). Сырьевой материал и бутанол перемешивали в течение 2 минут, а полученную смесь дополнительно выдерживали еще минуту, чтобы раствор разделился на верхнюю безводную фазу и нижнюю водную фазу. Верхний безводный слой, содержащий несвязанный PAFP, аккумулировали и подвергали диафильтрации, чтобы удалить из смеси остаточный бутанол. Полученный раствор, содержащий PAFP, подвергали in vitro связыванию с агентами, индуцирующими апоптоз, для дальнейшего применения в лечении упорного (лекарственно устойчивого) рака.

Способ экстракции PAFP, предлагаемый настоящим изобретением, превосходит традиционные способы экстракции AFP в том отношении, что он позволяет существенно увеличить выход высококонцентрированного и не связанного PAFP. Термин «не связанный» означает, что PAFP не связан с эндогенными связывающими партнерами. В результате повышенной концентрации не связанного PAFP ожидалось, что можно достичь более высокой концентрации PAFP, связанного с нужными агентами, индуцирующими апоптоз.

PAFP, экстрагированный подробно описанным выше способом, был подвергнут электрофорезу в полиакриламидном геле (фиг.2). При окрашивании геля красителем кумасси были четко различимы две мажорные белковые зоны (фиг.2, дорожки A и C). Верхняя полоса (приблизительно 70 кДа) соответствует PAFP, а нижняя полоса (приблизительно 61 кДа) соответствует альбумину.

ПРИМЕР 2

PAFP имеет сходные характеристики связывания по сравнению с HAFP.

В ранее проведенных исследованиях не рассматривался вопрос о том, обладает ли PAFP сходными биологическими свойствами с HAFP. PAFP, экстрагированный способом, подробно описанным выше, был проанализирован с применением двух разных иммуноферментных наборов, чтобы обнаружить присутствие PAFP в экстракте, полученном способом, который подробно описан выше. Образцы PAFP сравнивали с AFP, выделенным из сыворотки и амниотической жидкости человека. В начальной стадии образцы проанализировали мембранным тестом EIA на альфа-фетопротеин (№ по каталогу 410-1, IND Diagnostic Inc., Ванкувер, Канада), который основан на встраивание моноклонального антитела в HAFP. PAFP не давал реакции с набором теста EIA на альфа-фетопротеин по сравнению с образцом AFP человека, что позволяло думать о потенциальных различиях в химической структуре PAFP и AFP человека. Позже был применен второй аналитический набор, встраивающий поликлональное антитело в HAFP (номер по каталогу T-8456, AFP-EIA-BEST-Strip, Vector-BEST, Новосибирск, Россия), который позволял выявить присутствие PAFP в экстракте. Наблюдалась положительная реакция, свидетельствующая о способности PAFP реагировать с антителами против AFP человека. Результаты иммуноанализа позволяют предположить, что PAFP способен распознавать антитела к HAFP, то есть обладает структурным сходством с HAFP.

Ранее было продемонстрировано, что HAFP, сам по себе, способен индуцировать апоптоз. Было показано, что индукция гибели опухолевых клеток происходит при высоких физиологических дозах AFP (>250 мг/мл), но не происходит при низких дозах (<200 мг/мл) (Dudich et al., Eur. J. Biochem. 266:1-13, 1999). В дополнение к этому проведенные исследования показали, что HAFP способен связываться с различными гидрофобными и гидрофильными соединениями (Hirano, K., et al., Biochem. J. 231;189-191, 1985). Однако не было выяснено, способен ли PAFP сходным образом индуцировать апоптоз или другие нижерасположенные биологические реакции, и способен ли PAFP, наподобие HAFP, связываться с разными агентами вследствие различий в аминокислотной последовательности PAFP и HAFP (аминокислотное сходство обоих вариантов AFP составляет 82%) (Kim et al., Animal Genetics, 33:468-485, 2002).

Исследования, проведенные на мышиной модели рака, продемонстрировали способность PAFP доставлять в раковые клетки агенты, индуцирующие апоптоз (например, атрактилозид, тапсигаргин и бетулиновую кислоту), и вследствие этого снижать опухолевый груз (примеры 4 и 6). Впоследствии эти результаты были воспроизведены в исследовании на человеке, продемонстрировавшем противоопухолевые эффекты агентов, индуцирующих апоптоз, которые были связаны с PAFP (примеры 5, 7 и 8). Взятые в совокупности, эти данные позволяют думать о том, что PAFP распознается как мышиными рецепторами AFP, так и рецепторами AFP человека.

ПРИМЕР 3a

Связывание PAFP и агента, индуцирующего апоптоз, in vitro.

PAFP, полученный в подробно описанной выше процедуре экстракции, объединяли с агентом, индуцирующим апоптоз, на одну минуту, и дополнительно давали их смеси инкубироваться в течение 10 минут при 10-15°C. Хотя приемлемы и более длительные периоды инкубации, увеличение времени инкубации не дает существенных выгод в отношении количества агента, связанного с PAFP. Затем смесь PAFP с агентом, индуцирующим апоптоз, подвергали этапам ультрафильтрации через мембрану 50 кДа и диафильтрации для удаления мелких молекул и других загрязнений, например солей биологического буфера, использованного на предыдущих этапах экстракции во время накопления сырьевого материала. Этап диафильтрации дополнительно помогал удалить остатки несвязанного агента, индуцирующего апоптоз. Полученный ультраконцентрат содержал смесь PAFP с агентом, индуцирующим апоптоз, необходимую на последующих этапах.

Этап заключительной фильтрации проводили с использованием мембраны 0,22 микрона, а его назначением была фильтрационная стерилизация полученного раствора. В этой смеси оставался альбумин, который, однако, не снижал эффективности композиций, предлагаемых изобретением.

Полученный раствор был быстро заморожен при -45°C вплоть до полного замораживания. Затем композицию PAFP-агент, индуцирующий апоптоз, высушивали в сублимационной сушилке вплоть до полного высушивания слоя. После этого сублимационно высушенную композицию PAFP-агент, индуцирующий апоптоз, измельчали до состояния тонкодисперсных частиц, не допуская, чтобы температура порошка превышала 35°C. Получали порошок с размером частиц 80 меш и менее, чтобы облегчить включение композиции в различные лекарственные препараты или системы доставки. Точное количество PAFP в порошке можно рассчитать по данным ЖХВР (HPLC) или электрофореза в полиакриламидном геле (PAAG).

ПРИМЕР 3b - композиция PAFP-атрактилозид

Один литр ультраконцентрата PAFP, имеющего конечную концентрацию общего белка 35 г/л и PAFP приблизительно 21 г/л PAFP, соединяли с 250 мг атрактилозида (MW=803), растворенного в 50 мл воды для того, чтобы достичь молярного соотношения между PAFP и атрактилозидом 1:1. Раствору давали перемешаться в течение 10 минут при 4-15°C, а затем подвергали ультрафильтрации и диафильтрации с 2-3 объемами воды. Один литр конечного раствора подвергали сублимационному высушиванию для получения композиции PAFP-атрактилозид.

ПРИМЕР 3c - композиция PAFP-тапсигаргин

Пол-литра ультраконцентрата PAFP, имеющего конечную концентрацию общего белка 8 г/л и PAFP приблизительно 1,7 г/л, соединяли с 10 мг тапсигаргина (MW=650), растворенного в 10 мл спирта для того, чтобы достичь молярного соотношения между PAFP и тапсигаргином 1:1. Раствору давали перемешаться в течение 30 минут при 15-25°C, а затем подвергали ультрафильтрации и диафильтрации с 2-5 объемами воды. Сто миллилитров конечного раствора подвергали сублимационному высушиванию для получения композиции PAFP-тапсигаргин.

ПРИМЕР 3d - композиция PAFP-бетулиновая кислота

Два литра ультраконцентрата PAFP, имеющего конечную концентрацию общего белка 20 г/л и PAFP приблизительно 14 г/л, соединяли с 500 мг бетулиновой кислоты (MW=456), растворенного в 100 мл DMSO, который добавляли по каплям для того, чтобы достичь молярного соотношения между PAFP и бетулиновой кислотой 1:1. Раствору давали перемешаться в течение 10 минут при 25-37°C, а затем подвергали диафильтрации. Один литр конечного раствора подвергали сублимационному высушиванию для получения композиции PAFP-бетулиновая кислота.

ПРИМЕР 4

Мышиная модель лейкоза in vivo: композиция PAFP + агент, индуцирующий апоптоз, уничтожает опухолевые клетки у мышей при оценке через 24 дня после инокуляции опухолевыми клетками.

Мышам линии DBA2 делали подкожную инокуляцию на боку туловища 20000 клеток мышиного лейкоза P-388, которые, как было продемонстрировано ранее, экспрессировали рецепторы AFP (Severin et al, Dokl. Acad. Nauk,366(4):561-564, 1999; Moro-Vidal, R., Curex Technologies Inc., www.biocurex.com). Все животные выжили после инокуляции. Каждая группа численностью по десять мышей ежедневно получала лечение по одной из следующих схем:

1 - препарат A (композиция PAFP-атрактилозид)

2 - препарат T (композиция PAFP-тапсигаргин)

3 - препарат S (экстракт селезенки)

4 - препарат A+S

5 - препарат T+S

6 - контроль (масло)

7 - контроль (вода)

Каждая группа, состоявшая из 10 мышей, ежедневно получала пероральную дозу 0,2 мл назначенного препарата в масляном носителе, начиная со 2-го дня эксперимента (следующего дня после инокуляции клетками P-388). Оценку животных на рост опухоли проводили через 24 дня после инокуляции. Сводка результатов представлена в таблице 2.

Таблица 2 Группа лечения Выживание (%) на 24-й день Средний размер опухоли (см³) 1 - композиция PAFP-атрактилозид, 0,02 мг в день (препарат A) 90% 0,92+/-1,17 2 - композиция PAFP-тапсигаргин, 0,08 мг в день (препарат T) 80% 1,33+/-0,68 3 - экстракт селезенки, 4,0 мг в день (препарат S) 70% 2,97+/-2,62 4 - препарат A+S (0,02 мг A + 4,0 мг S) 40% 4,17+/-0,65 5 - препарат T+S (0,08 мг T + 4,0 мг S) 20% 5,59+/-3,36 6 - контроль (масло) 10% 6,34 7 - контроль (вода) 0% Нет выживших животных для оценки

Рост клеток лимфоцитарного лейкоза линии P-388, привитых подкожно на боку туловища мышей, которые после инокуляции ежедневно получали лечение по указанной схеме, показано на фиг.3.

Результаты:

1. Рост опухолей у животных в группе 1 (PAFP-атрактилозид) и в группе 2 (PAFP-тапсигаргин) был подавлен в среднем на 79% и 53% соответственно, по сравнению с контрольной группой 6 (масло) при оценке на 24-й день после инокуляции. При оценке на 22-й день после инокуляции рост опухолей был подавлен в среднем на 85% и 79% соответственно, по сравнению с контрольной группой 7 (вода).

2. Оценку показателя выживания (по длительности) проводили, когда в каждой группе из 10 животных оставались живыми 50% (то есть 5 животных). Показатель длительности 50-процентного выживания в группе 1, получавшей композицию PAFP-атрактилозид, оказался в 1,4 раза больше по сравнению с контрольной группой 7 (30 дней и 21 день соответственно). Показатель длительности 50-процентного выживания в группе 2, получавшей композицию PAFP-тапсигаргин (27 дней), оказался в 1,28 раза больше по сравнению с контрольными животными (фиг.4).

3. При оценке через 38 дней после инокуляции все еще были живы 3 из 10 мышей, ежедневно получавших лечение композицией PAFP-атрактилозид ("препарат A"), и одна из 10 мышей, получавших лечение композицией PAFP-тапсигаргин ("препарат T") (фиг.4). В контрольной группе животных, получавшей воду, все мыши умерли к 24-му дню, а в контрольной группе животных, получавшей масло, все мыши умерли к 25-му дню.

4. У одной из трех мышей, выживших на 38-й день после инокуляции, которые получали ежедневное лечение "препаратом A", наблюдалась регрессия опухоли (таблица 3).

Таблица 3 Число дней после инокуляции 13 15 17 20 22 24 38 Размер опухоли (см³) 0 0,05 0,05 0,05 0,03 0,01 *ND

*ND = не определено

Сходная регрессия опухолевого роста была продемонстрирована группой исследователей Severin et al., которые использовали AFP как транспортное средство для доставки ковалентно связанного с ним антибиотика эсперамицина (Severin, S.E. et al., Dokl. Akad. Nauk. 366(4): 561-4, 1999).

Выводы:

1. "Препарат A" и "препарат T", содержащие композиции PAFP-атрактилозид и PAFP-тапсигаргин соответственно, в указанных концентрациях подавляли опухолевый рост.

2. Введение агентов, индуцирующих апоптоз (атрактилозида и тапсигаргина), которые были связаны с PAFP, удлиняло выживание больных животных в мышиной модели лейкоза.

ПРИМЕР 5

Данные in vivo - опухоли: композиция PAFP-атрактилозид уничтожает опухолевые клетки у человека

Восемь больных, у которых по определению их лечащих врачей был диагностирован рак на IV стадии прогрессирования, в течение одного месяца получали пероральное лечение композицией PAFP-атрактилозид в форме капсул (от 2 до 6 капсул ежедневно). В течение последующих четырех месяцев лечащие врачи наблюдали за состоянием этих больных. Сами больные отметили улучшение качества жизни. По данным компьютерной томографии, проведенной этим больным, у лиц, получавших лечение композицией PAFP-атрактилозид, наблюдалось уменьшение скорости роста первичной опухоли, в некоторых случаях уменьшение размеров первичной опухоли, а также ограничение распространения метастазов. По первому исследованию на человеке можно сделать следующие выводы:

1. Показано, что пероральное употребление продукта PAFP-атрактилозид (при его доставке крахмальным и масляным носителем) в ежедневной дозе 2-6 капсул безопасно и в ходе лечения сопряжено с минимальными побочными эффектами.

2. Снижение размеров первичной и метастатической опухоли, а также уменьшение болей в участке метастазирования подтверждает специфическое противораковое действие продукта PAFP-атрактилозид.

3. У больных, получавших лечение композицией PAFP-атрактилозид (в изолированном виде или в комбинации с другими лекарствами) наблюдалось заметное повышение качества жизни по описанному самими больными усилению их физической активности и улучшению общего самочувствия.

4. Данные по больным, получавшим лечение композицией PAFP-атрактилозид, свидетельствуют о наличии реакции с эффектом дозовой зависимости, которая определялась по наблюдаемому уменьшению массы как первичных, так и метастатических опухолей.

5. Введение композиции PAFP-атрактилозид лишь изредка сопровождалось острой иммунной реакцией (повышением температуры тела, локальными болями в участке опухоли/метастаза) при увеличении дозы лекарства.

6. Снижение опухолевого груза у раковых больных на IV стадии заболевания в ответ на введение композиции PAFP-атрактилозид позволяет думать о биологической доступности этой композиции при ее оральной доставке.

ПРИМЕР 6

Данные in vivo - лейкоз: композиция, включающая экзогенный PAFP, обратимо связанный in vitro с первым агентом, индуцирующим апоптоз, а также со вторым агентом, индуцирующим апоптоз, уничтожает опухолевые клетки у мышей.

Ежедневное лечение проводили по следующим схемам:

1 - Контроль (вода)

2 - Контроль (масло)

3 - PAFP, связанный in vitro с первым агентом, индуцирующим апоптоз, бетулиновой кислотой (композиция PAFP-бетулиновая кислота)

4 - PAFP, связанный in vitro с первым агентом, индуцирующим апоптоз, бетулиновой кислотой (композиция PAFP-бетулиновая кислота в сочетании с дополнительной несвязанной бетулиновой кислотой).

В 1-й день эксперимента мышам делали инокуляцию 20000 клеток мышиного лейкоза P-388, а во 2-й день начинали ежедневно вводить оральные дозы 0,2 мл воды (1) или масла (2) в контрольных группах, либо 0,2 мл испытуемых препаратов 3 или 4 в опытных группах. По плану эксперимента численность каждой группы альтернативного лечения составляла 10 животных. Фиг.5 наглядно отображает кривую роста клеток лейкоза P-388 в зависимости от времени у животных, которые ежедневно получали оральную дозу одного из четырех средств: воды (1), масла (2), PAFP-связанной бетулиновой кислоты (3) или PAFP-связанной бетулиновой кислоты к комбинации с дополнительной свободной бетулиновой кислотой (4), причем два последних препарата были суспендированы в 0,2 мл масла.

Лекарственный препарат для группы 4 готовили, растворяя избыток бетулиновой кислоты в DMSO в концентрации 0,5 мг/мл, а затем добавляя 2 мкл (1 мкг) этого раствора к 0,2 мл препарата PAFP-связанная бетулиновая кислота. Предполагается, что после доставки комплекса PAFP-связанная бетулиновая кислота в опухолевую клетку PAFP возвращается во внеклеточное пространство, что позволяет экзогенному PAFP вступать в связь с избытком бетулиновой кислоты в опухолевой микросреде для последующей доставки в опухолевые клетки. Эта гипотеза основана на результатах исследований in vitro, которые продемонстрировали, что AFP с радиоактивной меткой II25 через механизм эндоцитоза захватывается неопластическими линиями лимфоидных клеток и высвобождается из этих клеток практически неизмененным (Torres et al., Int. J. Cancer 47(1): 110-117, 1991).

Бетулиновую кислоту (BA) применяли для лечения злокачественной меланомы (публикация патентной заявки США № 2003/0186945), однако для этого требуются большие дозы BA (0,2 мг-500 мг ежедневно). PAFP перемешивают с BA в молярном соотношении 1:2, причем для лечебного применения на человеке 0,6 мг этой композиции вводят в 0,2 мл масла, действующего как носитель. В весовом отношении бетулиновая кислота представлена в этой композиции в суточной дозе 0,008 мг. Обнаружено, что при комплексировании с PAFP бетулиновая кислота эффективна для человека в концентрациях на уровне микрограммов. Boik (в ссылке Natural Compounds in Cancer Therapy, 2001) приводит следующее уравнение для эквивалентного перерасчета между мышиной оральной дозой и дозой для человека: доза для человека (граммы/кг)= мышиная доза (мг/кг)/104. Вес человека 75 кг и вес мыши 0,02 кг дают следующий результат: 0,0006 г (доза для человека)×104= мышиная доза (мг/кг)=0,0624 мг/кг. Для мыши весом 0,02 кг дозу можно рассчитать как 0,0624 мг/кг×0,02 кг=0,01248 мг или 12 мкг. Коэффициент для расчета мышиной дозы по дозе для человека составляет 600 мкг (ежедневная доза для человека)/12 мкг (ежедневная доза для мыши)=50. В тех случаях, когда в дозу предполагается включить избыточное количество второго индуктора апоптоза, этот второй индуктор апоптоза добавляют позднее в виде масляной суспензии к уже приготовленной масляной суспензии первого комплекса (PAFP/первый индуктор апоптоза). Например, типичная мышиная доза состоит из 7 мкг комплекса PAFP-бетулиновая кислота в сухом виде, смешанного с 0,05 мл масла и скомбинированного с 0,15 мг бетулиновой кислоты, растворенной в масле до конечного объема 0,2 мл масла.

Сравнение объема опухоли у животных, получавших композицию PAFP-связанная бетулиновая кислота (группа 3) при отсутствии избытка бетулиновой кислоты, с объемом опухоли у животных, получавших композицию PAFP-связанная бетулиновая кислота в сочетании с избытком бетулиновой кислоты (группа 4), свидетельствовало о том, что второй вариант лечения приводит к более существенному снижению объема опухоли. Полученные результаты позволяют предположить более выраженный лечебный эффект при использовании композиции PAFP-связанная бетулиновая кислота в сочетании с избытком бетулиновой кислоты. Кроме того, полученные данные позволяют предположить, что агент, индуцирующий апоптоз и способный связываться с PAFP, можно использовать для лечения злокачественных новообразований, клетки которых экспрессируют рецепторы AFP, благодаря: 1) доставке PAFP в связке с агентом, индуцирующим апоптоз, в опухолевую клетку, и 2) последующей доставке дополнительного (второго) агента, индуцирующего апоптоз и способного связываться с PAFP in vivo, для того, чтобы улучшить результаты лечения.

Результаты проведенного исследования свидетельствуют о том, что включение избытка несвязанной бетулиновой кислоты в препарат PAFP-связанная бетулиновая кислота дает больший эффект в ограничении опухолевого роста, чем применение только одной композиции PAFP-связанная бетулиновая кислота. Кроме того, полученные данные позволяют предположить, что применение второго агента, индуцирующего апоптоз, в предлагаемой изобретением композиции дает терапевтические преимущества.

ПРИМЕР 7

Данные in vivo - опухоль: композиция, включающая экзогенный PAFP, обратимо связанный in vitro с первым соединением, а затем со вторым соединением, применима для уничтожения опухолевых клеток у больных людей при раках сóлидного типа.

Предварительные результаты по 5 больным (4 женщины и 1 мужчина) с сóлидными опухолями с метастазами или без метастазов:

Больная №1: женщина 57 лет, локализованный рак молочной железы

Больная №2: женщина 63 лет, рак молочной железы с метастазами в кости

Больная №3: женщина 44 лет с раком яичников и молочной железы

Больная №4: женщина 60 лет, рак молочной железы с метастазами в лимфатические узлы

Больной №5: мужчина 58 лет, рак яичек.

Цель этого исследования заключалась в оценке реакции больных с раковыми опухолями сóлидного типа, расцененными как неоперабельные, не поддающиеся современным методам консервативного лечения или давшие рецидив после операции.

Больные ежедневно принимали на пустой желудок две стандартные порции мягкого геля: одну утром, а еще одну перед ночным сном. Каждый порционный мягкий гель содержал продукт PAFP-бетулиновая кислота (то есть бетулиновую кислоту, обратимо связанную с экзогенным PAFP in vitro) и избыток бетулиновой кислоты (то есть дополнительную бетулиновую кислоту, не связанную с PAFP). Продукт PAFP-бетулиновая кислота был представлен в стандартной дозовой форме (300 мкг PAFP и 6 мкг бетулиновой кислоты на порцию мягкого геля). Избыток дополнительной бетулиновой кислоты был представлен дозой 150 мкг на порцию мягкого геля.

Предварительные результаты показали, что у 4 больных из 5 наблюдалось снижение скорости прогрессирования рака и улучшение общего качества жизни, оцененное самими больными по уменьшению болей, повышению уровня энергии и усилению аппетита. Больные не сообщали о каких-либо побочных эффектах, связанных с лечением указанным мягким гелем.

ПРИМЕР 8

Данные in vivo - снижение объема метастатической опухоли у больных людей.

Цель этого исследования заключалась в оценке терапевтической пользы комплекса PAFP-атрактилозид при лечении солидных опухолей. Больные с раковыми метастазами ежедневно принимали перорально (на пустой желудок) две капсулы с мягким гелем: одну утром, а еще одну перед ночным сном.

Клиническую оценку прошли тринадцать больных. У двенадцати из них был диагностирован рак толстой кишки, а у одной больной - рак молочной железы. У каждого больного были обнаружены раковые метастазы по меньшей мере в одном участке организма. Семь больных были женского пола, а шесть мужского, возраст всех больных варьировался в диапазоне от 45 до 65 лет.

Каждый больной получал композицию PAFP-связанный агент, индуцирующий апоптоз (под условным названием CPA) в дозе две капсулы в день (0,3 мг PAFP + 0,006 мг атрактилозида на капсулу) ежедневно от 4 до 8 недель. Снимки компьютерной томографии (КТ) (Siemens, 16 слоев) были получены до и после лечения.

Ниже представлены результаты исследования. По результатам КТ реакция больных на лечение была классифицирована следующим образом:

Полная: Отсутствие очевидных метастазов Частичная: По меньшей мере один метастаз исчез или уменьшился в размерах. Стабильность: Рост метастазов в пределах стандарта Всемирной организации здравоохранения для стабилизации (рост менее чем на 25%). Прогрессирование: Либо увеличение размеров метастаза (более чем на 25%), либо ухудшение клинического состояния больного. Прекращение: Побочные эффекты привели к прекращению лечения.

Сводные данные по больным представлены в таблице 4. Снимки КТ, сделанные до и после лечения, представлены на фиг.6 и 7 для больных P. и P.N.G., соответственно (оба больных продемонстрировали полную реакцию на лечение).

Таблица 4 Больной Пол Возраст
(лет) Опухоль Предшествующее лечение Реакция P м 56 Аденокарцинома толстой кишки Резекция опухоли полная P.N.G. м 62 Аденокарцинома толстой кишки Резекция опухоли полная A.N.A. ж 48 Аденокарцинома толстой кишки Химиотерапия частичная A.N.P. ж 63 Аденокарцинома толстой кишки Правосторонняя гемиколонэктомия, химиотерапия частичная S.V.A. ж 45 Аденокарцинома толстой кишки Левосторонняя гемиколонэктомия частичная Z.T.P. ж 49 Карцинома молочной железы Мастэктомия,
Лучевая терапия региональных лимфоузлов стабильность G.N.K. ж 62 Аденокарцинома толстой кишки Резекция опухоли стабильность P.A.G. м 65 Аденокарцинома толстой кишки Химиотерапия стабильность B.L.N. ж 57 Аденокарцинома толстой кишки Резекция опухоли прогрессирование K.A.R. м 52 Аденокарцинома толстой кишки Химиотерапия прогрессирование K.V.I. м 48 Аденокарцинома толстой кишки Химиотерапия прогрессирование P.A.V. м 65 Аденокарцинома толстой кишки Резекция опухоли, химиотерапия прогрессирование R.D.P. ж 62 Аденокарцинома толстой кишки Резекция опухоли прекращение лечения

Ниже представлена полная информация по каждому больному:

Больной: P.

Пол: мужской. Возраст: 56 лет.

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T2 N0 M0). Аденокарцинома (B-123256-68 от 21.01.2005).

Предшествующее лечение: Хирургическое (резекция опухоли) - 15 января 2005 г.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Май 2006 г. - прогрессирование: 1 метастаз (Mts) в печени (13×15 мм) (КТ от 15.05.2006)

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 5.05.2006- 15.07.2006г.

Результаты лечения: Отсутствие Mts в печени (КТ от 02.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=80%.   Побочные эффекты: нет

Заключение: Полная реакция. Метастаз исчез.

Для больного P. сравнение снимков КТ (фиг.6), сделанных до лечения (слева) и после лечения (справа) показывает, что после лечения метастаз (стрелка) не виден.

Больной: P.N.G.

Пол: мужской. Возраст: 62 года.

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T2 N0 M0). Аденокарцинома (O-1045-48 от 01.09.2005).

Предшествующее лечение: Хирургическое (резекция опухоли, слева) - август 2005 г.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид: Май 2006 г. - прогрессирование; 1 Mts в печени: 7×10 мм (КТ от 20.05.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 10.06.2006 г. - 22.07.2006

Результаты лечения: Отсутствие Mts в печени (КТ от 16.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Полная реакция. Метастаз (7×10 мм) исчез.

Для больного P.N.G. сравнение снимков КТ (фиг.7), сделанных до лечения (слева) и после лечения (справа) показывает, что после лечения метастаз (стрелка) не виден.

Больная: A.N.A.

Пол: женский. Возраст: 48 лет.

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T3a Nl Ml), метастазы: 1 (печень). Аденокарцинома (B-l 167-75 от 25.09.2005)

Предшествующее лечение: Операции НЕ БЫЛО; химиотерапия (Eloxatin, Alimta), октябрь 2005 г. - февраль 2006 г.; стабилизация роста опухоли

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Май 2006 - прогрессирование. Mts в печени (левая доля): 25×27 мм (КТ от 28.05.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=80%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 10.06.2006- 12.08.2006

Результаты лечения: Mts в печени (левая доля): 16×11 мм (КТ от 21.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Частичная реакция: Уменьшение метастаза.

Снимки КТ показали уменьшение печеночного метастаза рака толстой кишки на 73% (25×27=675, 16×11=176, 675-176=499, 499/675=73,9%) у больной, получавшей ежедневно (2 раза в день) дозы композиции PAFP-атрактилозид.

Больная: A.N.P.

Пол: женский. Возраст: 63 года.

Клинический диагноз: Карцинома толстой кишки (T3 N0 M0). Аденокарцинома (0-1117-29 от 14.01.2005)

Предшествующее лечение: хирургическое (гемиколонэктомия, справа) - декабрь 2004 г.

Август 2005 г. - прогрессирование. Химиотерапия - Eloxatin, Xeloda, 5-FU; частичная реакция

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Май 2006 г. - прогрессирование, рецидив: 3 Mts в печени: 21×28 мм, 27×29 мм, 10×12 мм (КТ от 17.05.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=70-80%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 05.06.2006- 30.07.2006

Результаты лечения: 2 Mts в печени: 21×28 мм, 27×29 мм (КТ от 08.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Частичная реакция: Исчезновение одного из метастазов в печени (10×12 мм).

Больная: S.V.A.

Пол: женский. Возраст: 45 лет.

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T2 N1 M0). Аденокарцинома (O-1135-42 от 25.03.2004)

Предшествующее лечение: хирургическое (гемиколонэктомия, слева) - март 2005 г.

Май 2006 г. - симптоматическая терапия

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Апрель 2006 г. - прогрессирование: 3 Mts в печени: 45×65 мм, 26×42 мм и 7×9 мм (КТ от 26.04.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=80%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 29.06.2006- 24.07.2006

Результаты лечения: 2 Mts в печени: 42×55 мм и 26×42 мм (КТ от 03.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Частичная реакция: 1 метастаз исчез (7×9 мм), 2 метастаза стабилизировались.

Больная: Z.T.P.

Пол: женский. Возраст: 49 лет.

Клинический диагноз: Рак молочной железы (T3b N1 M0)

Предшествующее лечение: хирургическое (мастэктомия) - декабрь 2004 г., лучевая терапия (регион лимфатических узлов);

Лечение препаратом Taxotere, стабилизация

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид: Июль 2006 г. - прогрессирование. 1 Mts в печени: 67×69 мм (КТ от 18.07.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 05.08.2006- 02.09.2006

Результаты
лечения: 1 Mts в печени: 68×66 мм (КТ от 30.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Стабилизация.

Больная: G.N.K.

Пол: женский. Возраст: 62 года.

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T2 N0 M0). Аденокарцинома (O-1086-92 от 14.06.2005)

Предшествующее лечение: Хирургическое (резекция опухоли, справа) - июнь 2005 г.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Июнь 2006 г. - прогрессирование: 2 Mts в печени: 8×6 мм и 6×6 мм (КТ от 10.06.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 1.07.2006 - 2.09.2006

Результаты лечения: 2 Mts в печени: 8×6 мм и 6×6 мм (КТ от 15.09.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Стабилизация.

Больной: P.A.G.

Пол: мужской. Возраст: 65 лет

Клинический диагноз: Карцинома толстой кишки (T2 N0 M0). Аденокарцинома (0-1256-65 от 25.09.2005)

Предшествующее лечение: хирургическая операция - сентябрь 2005 г. Декабрь 2005 г. - прогрессирование; Mts в печени

5 курсов химиотерапии: 5-FU.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Июнь 2006 - прогрессирование: 2 Mts в печени: 32×24 мм и 32×26 мм (КТ от 14.06.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 19.06.2006- 13.08.2006

Результаты лечения: 2 Mts в печени: 32×24 мм и 32×26 мм (КТ от 22.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Стабилизация.

Больная: B.L.N.

Пол: женский. Возраст: 57 лет

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T3b N0 M0). Аденокарцинома (O-l245-61 от 14.01.2006)

Предшествующее лечение: хирургическое (резекция опухоли, справа) - декабрь 2005 г.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид: Июнь 2006 г. - прогрессирование: Mts в печени: 18×12 мм (КТ от 19.06.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 2.07.2006- 27.08.2006

Результаты лечения: Mts в печени: 22×18 мм (КТ от 4.09.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

  Побочные эффекты: нет

Заключение: Прогрессирование. Метастаз увеличился более чем на 25%.

Больной: K.A.R.

Пол: мужской. Возраст: 52 года

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T3b N1 M1-Hep.). Аденокарцинома (B-1189-96)

Предшествующее лечение: Хирургической операции НЕ БЫЛО. Химиотерапия - Eloxatin (декабрь 2005 г. - февраль 2006 г.).

Стабилизация

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Июнь 2006 г. - прогрессирование: 1 Mts в печени: 118×85 мм (КТ от 19.06.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=60-70%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 26.06.2006- 27.08.2006

Результаты лечения: 1 Mts в печени: 118×85 мм (КТ от 19.06.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=40-50%. Подъем температуры по вечерам. Не может ходить   Побочные эффекты: тошнота, рвота

Заключение: Клиническое прогрессирование. Метастаз - отсутствие динамики (стабилизация).

Больной: K.V.I.

Пол: мужской. Возраст: 48 лет

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T3b Nl Ml-Hep.). Аденокарцинома (B-1245-50)

Предшествующее лечение: Хирургической операции НЕ БЫЛО. Химиотерапия - Eloxatin (октябрь-ноябрь 2005 г.). Частичная реакция

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:
Май 2006 г. - прогрессирование: 1 Mts в печени: 19×9 мм (КТ от 16.05.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 05.06.2006- 30.07.2006

Результаты
лечения: 1 Mts в печени: 28×32 мм (КТ от 08.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Прогрессирование.

Больной: P.A.V.

Пол: мужской. Возраст: 65 лет

Клинический диагноз: Карцинома толстой кишки (T3a N0 M0). Аденокарцинома (0-1212-34 от 12.02.2005).

Предшествующее лечение: хирургическое (резекция опухоли) - февраль 2005 г.

Октябрь 2005 г. - прогрессирование, Mts в печени

Октябрь-ноябрь 2005 г. - Химиотерапия (Eloxatin) - частичная реакция.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид: Июнь 2006 г. - прогрессирование. 2 Mts в печени: 7×8 мм и 5×6 мм (КТ от 06.06.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%.

Введение композиции PAFP-атрактилозид: 5.06.2006- 6.08.2006.

Результаты
лечения: 2 Mts в печени: 12×9 мм и 6×8 мм (КТ от 07.08.2006)   Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%   Побочные эффекты: нет

Заключение: Прогрессирование.

Больная: R.D.P.

Пол: женский. Возраст: 62 года

Клинический диагноз: Рак толстой кишки (T2 N1 M0). Аденокарцинома (O-1187-48 от 29.09.2004)

Предшествующее лечение: хирургическое (резекция опухоли, слева) - сентябрь 2004 г.

Перед введением композиции PAFP-атрактилозид:

Май 2006 г. - прогрессирование: 2 Mts в печени: 65×85 мм и 46×22 мм, тенденция к слиянию (КТ от 14.05.2006)

Качество жизни (индекс Karnofsky)=90%

Введение композиции PAFP-атрактилозид: Июнь 2006 г.

Результаты лечения: Не определены   Побочные эффекты: тошнота и рвота, не подавляемые противорвотными средствами

Заключение: Лечение было прекращено из-за побочных эффектов (тошнота, рвота).

Принимая во внимание далеко зашедшую стадию рака у больных, получавших лечение в этом исследовании, полученные результаты свидетельствуют о том, что из 13 больных, получавших ежедневные дозы CPA, 61% (8/13) продемонстрировали реакцию на лечение. Наличие реакции означает, что в результате лечения метастатические массы перестали обнаруживаться (15%, 2/13), по меньшей мере одна метастатическая масса была элиминирована или уменьшилась в размерах (23%, 3/13), либо в росте метастазов не наблюдалось прогрессирования (произошла стабилизация, 23%, 3/13).

У четырех больных (31%) наблюдалось прогрессирование заболевания, а один больной (8%) выбыл из исследования из-за развития побочных эффектов (тошнота, рвота). Ответственный исследователь не мог определить, были ли побочные эффекты непосредственно связаны с лечением, и предположил, что определенное значение мог иметь размер первоначальных метастазов в печени (65×85 мм и 46×22 мм, с тенденцией к слиянию).

За исключением одного случая рвоты, которая, возможно, не имела прямой связи с употреблением испытуемого продукта, не было других сообщений от больных о серьезных побочных эффектах.

Больные A.N.A. и A.N.P. имели метастазы с множественной лекарственной резистентностью, которые развились после лечения препаратами Eloxatin/Alimta и Eloxatin/Xeloda/5-FU соответственно. После лечения композицией PAFP-атрактилозид эти больные продемонстрировали уменьшение размеров метастатической опухоли. Полученные данные подтверждают способность комплекса PAFP-атрактилозид преодолевать мультилекарственную резистентность in vivo.

Выше приведены специфические примеры, иллюстрирующие некоторые аспекты настоящего изобретения. Также возможны многие другие варианты реализации этого изобретения, включая модификации и вариации приведенных примеров, что должно быть понятно для компетентных специалистов, которые внимательно ознакомятся с материалами, представленными в этой заявке. Таким образом, могут быть использованы все подходящие модификации, вариации и эквиваленты, которые не выходят за рамки этого изобретения и соответствуют приведенным выше положениям, а также прилагаемым пунктам формулы изобретения.

Изобретение относится к медицине и касается композиции, содержащей нековалентный комплекс из свиного альфа-фетопротеина (PAFP), полученного из крови и амниотической жидкости свиных эмбрионов посредством экстракции бутанолом, и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз. Изобретение также касается применения указанной композиции для ингибирования пролиферации раковой клетки у пациента, имеющей на своей поверхности альфа-фетопротеиновый рецептор; применения указанной композиции для лечения множественной лекарственной резистентности рефрактерных злокачественных новообразований у пациента. Изобретение обеспечивает надежный и дешевый источник продукта. 10 н. и 15 з.п. ф-лы, 7 ил., 4 табл.

1. Композиция для лечения, предупреждения и подавления пролиферации злокачественных клеток у млекопитающих, содержащая нековалентный комплекс из свиного альфа-фетопротеина (PAFP), полученного из крови и амниотической жидкости свиных эмбрионов посредством экстракции бутанолом, и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, выбранного из группы, состоящей из агентов, повышающих проницаемость митохондриальной мембраны, агентов, индуцирующих открытие митохондриальных пор, ионофоров, активаторов каспазы 9, активаторов каспазы 3 и ретиноидов, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связан с PAFP.

2. Композиция по п.1, в которой представлены два агента, индуцирующих апоптоз, которые обратимо связаны с PAFP.

3. Композиция по п.1 или 2, в которой PAFP получен следующим способом:
(a) сбором крови и амниотической жидкости из свиных эмбрионов на сроке беременности приблизительно от 3 до 14 недель;
(b) разделением собранной на стадии (а) крови и амниотической жидкости на супернатант и преципитат;
(c) сбором супернатанта, полученного на стадии (b);
(d) концентрированием супернатанта, полученного на стадии (с) с получением концентрированного раствора;
(e) добавлением бутанола к концентрированному раствору со стадии (а) до получения конечной концентрации бутанола в растворе, приблизительно составляющей от 5 до 10%;
(f) перемешиванием раствора бутанола, полученного на стадии (е);
(g) разделением раствора бутанола, полученного на стадии (f), на верхнюю безводную фазу и нижнюю водную фазу; и
(h) сбором безводной фазы, полученной на стадии (g), с получением конечного раствора, содержащего PAFP.

4. Композиция по п.1, в которой PAFP получен из свиных эмбрионов на сроке вынашивания приблизительно от 3 до 14 недель.

5. Композиция по п.1, в которой агент, индуцирующий апоптоз, выбран из группы, состоящей из бетулиновой кислоты, тапсигаргина, ротенона, пиерицидина А, лонидамина, CD437, трехокиси мышьяка, А23187, иономицина, витаминов D2 и D3, Рас-1, дексаметазона и аккутана (Accutane™).

6. Композиция по п.1, в которой по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, выбран из группы, состоящей из атрактилозида, бетулиновой кислоты и тапсигаргина.

7. Композиция по п.1, в которой PAFP указанной композиции специфически связывается с клетками, имеющими по меньшей мере один рецептор AFP на клеточной поверхности.

8. Композиция по п.1, которая представлена в виде капсулы, мягкого геля или таблетки для орального применения, суппозитория, инъекционного препарата, ингаляционного препарата, капель для носа, глазных капель, повязки, жидкой мази или в виде лекарственной формы для местного применения.

9. Композиция для лечения, предупреждения и подавления пролиферации злокачественных клеток у млекопитающих, содержащая нековалентный комплекс PAFP, полученного из крови и амниотической жидкости свиных эмбрионов посредством экстракции бутанолом, с атрактилозидом, причем атрактилозид обратимо связан с PAFP.

10. Композиция по п.9, в которой PAFP получен следующим способом:
(a) сбором крови и амниотической жидкости из свиных эмбрионов на сроке беременности приблизительно от 3 до 14 недель;
(b) разделением собранной на стадии (а) крови и амниотической жидкости на супернатант и преципитат;
(c) сбором супернатанта, полученного на стадии (b);
(d) концентрированием супернатанта, полученного на стадии (с), с получением концентрированного раствора;
(e) добавлением бутанола к концентрированному раствору со стадии (d) до получения конечной концентрации бутанола в растворе, приблизительно составляющей от 5 до 10%;
(f) перемешиванием раствора бутанола, полученного на стадии (е);
(g) разделением раствора бутанола, полученного на стадии (f), на верхнюю безводную фазу и нижнюю водную фазу; и
(h) сбором безводной фазы, полученной на стадии (g), с получением конечного раствора, содержащего PAFP.

11. Способ экстракции AFP из крови и амниотической жидкости эмбриона млекопитающего, не являющегося человеком, с использованием бутанола, включающий в себя следующие последовательные стадии:
(a) сбор крови и амниотической жидкости от эмбрионов млекопитающих на сроке беременности приблизительно от 3 до 14 недель;
(b) разделение собранной на стадии (а) крови и амниотической жидкости на супернатант и преципитат;
(c) сбор супернатанта, полученного на стадии (b);
(d) концентрирование супернатанта, полученного со стадии (с) с получением концентрированного раствора;
(e) добавление бутанола к концентрированному раствору со стадии (d) до получения конечной концентрации бутанола в растворе, приблизительно составляющей от 5 до 10%;
(f) перемешивание раствора бутанола, полученного на стадии (е);
(g) разделение раствора бутанола, полученного на стадии (f), на верхнюю безводную фазу и нижнюю водную фазу; и
(h) сбор безводной фазы, полученной на стадии (g), с получением конечного раствора, содержащего гликозилированный AFP.

12. Способ по п.11, в котором эмбрионами млекопитающих, не являющихся человеком, являются эмбрионы приматов, крупного рогатого скота, лошадей, собак, кошек или овец.

13. Способ по п.11, в котором эмбрионом млекопитающего, не являющегося человеком, является эмбрион свиньи.

14. Способ по любому из пп.11-13, в котором гликозилированный AFP, полученный на стадии (h), находится в свободном (несвязанном) состоянии.

15. Применение PAFP, полученного в соответствии со способом по п.13, для доставки в организме больного по меньшей мере одного индуцирующего апоптоз агента, выбранного из группы, состоящей из агентов, повышающих проницаемость митохондриальной мембраны, агентов, индуцирующих открытие митохондриальных пор, ионофоров, активаторов каспазы 9, активаторов каспазы 3 и ретиноидов, в раковую клетку, имеющую на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с PAFP, и PAFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP.

16. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства для нацеленной доставки в организм пациента по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, в раковую клетку, имеющую на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с PAFP, и PAFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP.

17. Применение композиции по п.1 для ингибирования пролиферации раковой клетки у пациента, причем указанная раковая клетка имеет на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, где по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с PAFP, a PAFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP на клеточной поверхности.

18. Применение композиции по п.1 для лечения множественной лекарственной резистентности рефрактерных злокачественных новообразований у пациента, содержащих раковые клетки, имеющие на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, где по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с PAFP, a PAFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP на клеточной поверхности.

19. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства для ингибирования пролиферации раковой клетки упациента, причем указанная раковая клетка имеет на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, где по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с PAFP, a PAFP связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP на клеточной поверхности.

20. Применение композиции по п.1 для получения лекарственного средства для лечения множественной лекарственной резистентности рефрактерных злокачественных новообразований у пациента, причем в указанных рефрактерных злокачественных новообразованиях имеются раковые клетки, имеющие на своей поверхности по меньшей мере один рецептор AFP, где по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связывается с PAFP, a PAFP специфически связывается по меньшей мере с одним рецептором AFP на клеточной поверхности.

21. Применение по любому из пп.15-20, в котором раковое заболевание выбрано из группы, состоящей из рака мочевого пузыря, рака молочной железы, рака толстой и прямой кишки, рака эндометрия, рака почек, лейкоза, рака печени, рака легких, меланомы, неходжкинской лимфомы, рака яичников, рака поджелудочной железы, рака предстательной железы, рака кожи, рака яичек и рака щитовидной железы.

22. Применение по любому из пп.15-20, согласно которому PAFP получен по п.13, и по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, выбран из группы, состоящей из атрактилозида, бетулиновой кислоты и тапсигаргина.

23. Оральная лекарственная форма для лечения, предупреждения и подавления пролиферации злокачественных клеток у млекопитающих, содержащая композицию, включающую нековалентный комплекс из свиного альфа-фетопротеина (PAFP), полученного из крови и амниотической жидкости свиных эмбрионов посредством экстракции бутанолом, и по меньшей мере одного агента, индуцирующего апоптоз, выбранного из группы, состоящей из агентов, повышающих проницаемость митохондриальной мембраны, агентов, индуцирующих открытие митохондриальных пор, ионофоров, активаторов каспазы 9, активаторов каспазы 3 и ретиноидов, указанный, по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, присутствует в композиции в количестве 150 мкг или менее, причем по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, обратимо связан с PAFP.

24. Оральная лекарственная форма по п.23, где по меньшей мере один агент, индуцирующий апоптоз, выбран из группы, состоящей из атрактилозида, бетулиновой кислоты и тапсигаргина.

25. Оральная лекарственная форма по п.23 или 24, где указанная композиция проявляет эффективную желудочно-кишечную абсорбцию после орального введения.