ОЛИГОПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ НЕЙРЕГУЛИНА-1 ПО ОТНОШЕНИЮ К ПРОЛИФЕРАЦИИ КАРДИОМИОЦИТОВ Российский патент 2012 года по МПК C07K7/06 A61K38/08 A61P9/00 

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, обладающим активностью природных факторов роста по отношению к пролиферации кардиомиоцитов, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Кардиомиоцит - основная клетка сердечной мышечной ткани. Эти клетки имеют цилиндрическую ветвящуюся форму диаметром около 15 мкм. При помощи межклеточных контактов (вставочные диски) рабочие кардиомиоциты объединены в так называемые сердечные мышечные волокна - функциональный синцитий - совокупность кардиомиоцитов в пределах каждой камеры сердца.

Часть кардиомиоцитов обладает определенным пролиферативным потенциалом и не является терминально дифференцированными клетками. Пролиферация подобных кардиомиоцитов активируется при таких патологических процессах, как инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, дилатационная и гипертрофическая кардиомиопатия. Помимо того, роль в замещении погибших кардиомиоцитов могут играть клетки-предшественники, мезенхимальные стволовые клетки, которые находятся в циркулирующей крови. Важную роль в регуляции пролиферации кардиомиоцитов играет белок нейрегулин-1 (NRG-1) [1].

В США разработан способ восстановления клеток сердечной мышцы и возвращения их в клеточный цикл с помощью деления клеток и восстановления здоровой ткани после сердечного приступа, согласно испытаниям на мышах и крысах, описанным в [5]. Ключевым ингредиентом является фактор роста, известный как нейрогулин-1. Исследователи предполагают, что этот фактор может быть использован для лечения человеческого сердца. Новые исследования предоставляют разные доказательства - включая видеозапись клетки в действии - и показывают, что нейрогулин-1 способен стимулировать процесс восстановления клеток сердечной мышцы за счет пролиферации кардиомиоцитов. Рассматривались различные факторы, влияющие на процесс пролиферации кардиомиоцитов во время пренатального развития. Среди них нейрогулин-1 обладал наиболее значительным эффектом. Было показало, что можно ускорить или замедлить скорость пролиферации кардиомиоцитов у животных, изменяя уровень нейрогулина-1. Более того, инъекция нейрогулина-1 взрослой мыши спровоцировала активное участие кардиомиоцитов в клеточном цикле и содействовала регенерации сердечной мышцы, приводя к улучшению функций после того, как животное пострадало от сердечного приступа.

Нейрегулин-1 - гликопротеин, отличающийся обилием изоформ и выполняемых в организме функций. Структура белка определяется одноименным геном (NRG1), расположенным на 8 хромосоме. NRG-1 включает три домена: иммуноглобулин-подобный (lg-подобный) домен, эпидермальный фактор роста - подобный домен (EGF-подобный) и трансмембранный домен. EGF-подобный домен NRG-1 связывается с тирозин-киназным рецептором и стимулирует пролиферацию кардиомиоцитов [1].

Сложность выделения нейрегулина-1 и высокая дороговизна этого процесса потребовали создание синтетического аналога.

Задача, решаемая при создании изобретения, заключается в создании биологически активных веществ пептидной природы - синтетических аналогов, моделирующих функциональную активность природных факторов роста.

Основной технический результат, который может быть получен при осуществлении настоящего изобретения, состоит в получении нового соединения - аналога фактора роста нейрегулин-1, способного в результате связывания с рецепторами на поверхности стволовых клеток стимулировать пролиферацию кардиомиоцитов.

Указанный технический результат достигается за счет создания обладающего активностью нейрегулина-1 по отношению к пролиферации кардиомиоцитов олигопептида общей формулы:

Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7,

где Х1 представляет собой K;

Х2 представляет собой G или А;

Х3 представляет собой А или отсутствует;

Х4 представляет собой М;

Х5 представляет собой G или А;

Х6 представляет собой А или отсутствует;

Х7 представляет собой K,

где А - аланин, G - глицин, K - лизин, М - метионин, при этом размер олигопептида, проявляющего данную активность, варьируется от пента- до септапептида.

Формула заявляемого олигопептида выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания нейрегулина-1 с рецепторами поверхности стволовых клеток, а также основываясь на результатах расщепления нейрегулина протеазами. Компьютерное конструирование участков связывания нейрегулина-1 с его рецептором на поверхности стволовых проводили с помощью программного комплекса [3], осуществляющего компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.

Нижеследующие чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.1 представлена пространственная структура белка нейрегулин-1 [4].

На фиг.2 представлена пространственная структура белка нейрегулин-1 с идентифицированным функциональным сайтом.

Пример 1. In silico конструирование функционального сайта нейрегулина-1 на основе его пространственной структуры.

Для осуществления конструирования функционального сайта нейрегулина-1 использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [5]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры нейрегулина-1. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру нейрегулина-1 [4] (фиг.1).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать пространственно сближенные аминокислотные остатки, находящиеся на поверхности глобулы белка нейрегулин-1 и принимающие участие во взаимодействии нейрегулина-1 с его рецептором (фиг.2). На основе полученных данных спрогнозировали формулу заявляемого олигопептида.

Из представленных на фиг.2 данных, по результатам компьютерного моделирования можно сделать вывод, что заявляемый олигопептид представляет собой функциональный сайт нейрегулина-1, принимающий участие в связывании с рецепторами на поверхности стволовых клеток и стимулирующий пролиферацию кардиомиоцитов. Данное соединение может найти применение в медицине и ветеринарии при таких патологических процессах, как инфаркт миокарда, ишемическая болезнь сердца, дилатационная и гипертрофическая кардиомиопатия.

Пример 2. In vitro оценка влияния олигопептида, обладающего активностью нейрегулина-1, по отношению к пролиферации кардиомиоцитов из фетальных стволовых клеток.

Для выделения фетальных клеток (МСК) используют абортивный материал, полученный при искусственном прерывании беременности у здоровых женщин, предварительно обследованных на наличие вирусных и бактериальных инфекций. Использовавшаяся в работе [6] методика выделения МСХ была полностью воспроизведена. Было установлено, что наиболее эффективное выделение миогенных МСК из фетального биоматериала достигается на следующих сроках гестации: печень - 5-8 недель, тимус - 18-20 недель, костный мозг - 17-20 недель, подкожная жировая ткань - 17-19 недель. Если выделение клеток производится не из аспиратов (костный мозг, липоаспират), а из плотных тканей - например, тимуса, орган предварительно измельчают и ферментативно дезагрегируют. Суспензию фильтруют через мелкоячеистое сито из нержавеющей стали. Клеточную суспензию (аспират) разводят 1:1 солевым раствором Хэнкса, центрифугируют в режиме 1,500×g 10 минут и ресуспендируют в ростовой среде DMEM/F12, содержащей 15% эмбриональной телячьей сыворотки, селектированной для выращивания клеток в низкой плотности, 2 мМ глутамина. Суспензию клеток высевают на пластиковые чашки Петри с диаметром 100 мм. Плотность посева первичной клеточной суспензии составляет 1-20 миллионов мононуклеарных клеток на 1 см² в зависимости от источника выделения. Через 1 сутки неприкрепившиеся клетки удаляют, ростовую среду заменяют. Культуры инкубируют при 37°С в атмосфере 9-12% CO₂. Через 6 дней наблюдают рост гетерогенных клеточных популяций.

На данном этапе для опытных партий проводилось введение синтетических аналогов нейрегулина-1 в концентрации 2 нг/мл. По достижении культурой 50% конфлюэнтности монослой трипсинизируют и пересевают на новые чашки с плотностью 10-30 клеток на 1 см² в ростовой среде, дополнительно содержащей 10 мкг/мл трансферрина, 1 мкг/мл инсулина, 10 нг/мл фактора роста фибробластов - 2 и 8 U/мл гепарина. Через 7-10 дней отбирают плотные колонии мелких клеток (диаметром 7-10 мкм) с большим количеством митозов. Отобранные колонии рассевают в новые чашки с плотностью 20 клеток/см² и выращивают до состояния преконфлюэнтности. Замену среды производят через каждые 2 дня. Последующие пассажи производят в том же режиме. В плотно растущих колониях возможно появление многоядерных симпластов (миотубов), что подтверждает правильность соблюдения режима культивирования. Увеличение посевной дозы или изменение состава ростовой среды приводят к быстрому накоплению в культуре клеток зрелой стромы.

При данной методике дифференцировки МСК в кардиомиоциты к концу 3-й недели в культуре появляются клетки (1-2%), обладающие способностью спонтанно и ритмично сокращаться. К 4-й неделе культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток достигает своего максимума - 35-40% от общего количества клеток в культуре.

Идентификация кардиоспецифичности клеток осуществлялась по выявлению в них кардиоспецифичного тропонина-I иммуногистохимическим методом с использованием мышиных моноклональных антител к тропонину-I.

Указанная методика полностью была воспроизведена в контрольных экспериментах, для анализа действия синтетических олигопептидов, как отмечено выше, вводились заявляемые соединения. По сравнению с контрольной группой в опытных образцах к концу 3-й недели в культуре появляются кардиомиоцитоподобные клетки (5-7%), обладающие способностью спонтанно и ритмично сокращаться. К 4-й неделе культивирования количество кардиомиоцитоподобных клеток достигало своего максимума - 55-70% от общего количества клеток в культуре в зависимости от вида введенного пептидного соединения, что представлено в таблице в % отношении к контролю.

Таблица № п/п Соединение Эффективность роста кардиомиоцитов по сравнению с контролем 1. KGAMGAK 210% 2. KAAMGAK 180% 3. KGMGAK 160% 4. KAMGAK 150% 5. KGAMGK 138% 6. KAAMGK 145% 7. KGMGK 127% 8. KAMGK 125% 9. KGAMAAK 205% 10. KAAMAAK 194% 11. KGMAAK 175% 12. KAMAAK 156% 13. KGAMAK 142% 14. KAAMAK 120% 15. KGMAK 120% 16. KAMAK 115% Контроль   100%

Полученные результаты доказывают, что заявляемый олигопептид является синтетическим аналогом, обладающим активностью нейрегулина-1 по отношению к пролиферации кардиомиоцитов.

Перечень последовательностей аминокислот предлагаемых аналогов нейрегулина-1 (в однобуквенном коде):

1. K-G-A-M-G-A-K

2. K-G-A-M-G-K

3. K-G-A-M-A-A-K

4. K-G-A-M-A-K

5. K-G-M-G-A-K

6. K-G-M-G-K

7. K-А-М-А-А-K

8. K-А-М-А-К

9. K-A-A-M-G-A-K

10. K-A-A-M-G-K

11. K-A-A-M-A-A-K

12. K-A-A-M-A-K

13. K-A-M-G-A-K

14. K-A-M-G-K

15. K-А-М-А-А-K

16. K-А-М-А-K

Источники информации

1. Deepak Srivastava. Making or Breaking the Heart: From Lineage Determination to Morphogenesis // Cell, Volume 126, Issue 6, pp.1037-1048.

2. Шутова, И.В. Компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул / И.В.Шутова, Л.М.Чемитова, В.П.Голубович // Химия, структура и функция биомолекул: Тез. докл. - Мн., 2006. - С.PR-162.

3. http://www.rcsb.org/pdb/explore.do?structureld=1HAE

4. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

5. Kevin, B. Neuregulin1/ErbB4 Signaling Induces Cardiomyocyte Proliferation and Repair of Heart Injury/ Kevin Bersell, Shima Arab, Bernhard Haring, Bernhard Kühn// Cell, Volume 138, Issue 2, 257-270, 23 July 2009.

6. В.И.Шумаков, Н.А.Онищенко, М.Е.Крашенинников и др. «Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцито-подобные клетки у различных видов млекопитающих.» Бюл. эксперим. биол. мед. 2003. №4. С.461-465.

Настоящее изобретение относится к биологически активным веществам пептидной природы, обладающим активностью природных факторов роста по отношению к пролиферации кардиомиоцитов, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии. Технический результат, состоящий в получении синтетического аналога фактора роста нейрегулин-1, способного в результате связывания с рецепторами на поверхности стволовых клеток стимулировать пролиферацию кардиомиоцитов, достигается за счет создания обладающего активностью нейрегулина-1 по отношению к пролиферации кардиомиоцитов олигопептида общей формулы: Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7, где X1 - K, Х2 - G или А, Х3 - А или отсутствует, Х4 - М, Х5 - G или А, Х6 - А или отсутствует, Х7 - K, при этом размер олигопептида варьируется от пента- до септапептида. 2 ил., 1 табл.

Олигопептид, обладающий активностью нейрегулина-1 по отношению к пролиферации кардиомиоцитов, общей формулы
Х1-Х2-Х3-Х4-Х5-Х6-Х7,
где X1 - К, Х2 - G или А, Х3 - А или отсутствует, Х4 - М, Х5 - G или А,
Х6 - А или отсутствует, Х7 - К, при этом размер олигопептида варьируется от пента- до септапептида.