ОЛИГОПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО БЕЛКА ХРЯЩЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (CDMP-1) ПО ОТНОШЕНИЮ К ПРОЛИФЕРАЦИИ ХОНДРОЦИТОВ Российский патент 2011 года по МПК C07K5/83 C07K5/103 A61K38/06 A61K38/07 A61P19/02 

Настоящее изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии, косметологии, ветеринарии и медицины, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, обладающим активностью факторов роста по отношению к пролиферации хондроцитов, и может найти применение в медицине, косметологии, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Хондроцит - основная клетка хрящевой ткани, образующая ее межклеточное вещество. Основными факторами роста, которые участвуют в пролиферации хондроцитов, являются белки суперсемейства трансформирующего фактора роста TGF, в частности морфогенетический белок хрящевого происхождения Cartilage-Derived Morphogenetic Protein - CDMP-1 (Growth Differentiation Factor 5 - GDF-5) [1, 2].

Выделение и очистка природных соединений весьма трудный и дорогостоящий процесс, кроме того, соединения, выделяемые из тканей, могут являться носителями побочных опасных веществ.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала эффективных терапевтических средств, ускоряющих регенерацию хрящевой ткани суставов.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении настоящего изобретения, заключается в реализации данного назначения: создании биологически активных веществ пептидной природы (синтетических низкомолекулярных пептидных аналогов), моделирующих функцию морфогенетического белка хрящевого происхождения (CDMP-1) по отношению к пролиферации хондроцитов.

Указанный технический результат достигается за счет создания олигопептида, обладающего активностью морфогенетического белка хрящевого происхождения (CDMP)-1 по отношению к пролиферации хондроцитов, общей формулы (I):

Х1-Х2-Х3-Х4,

где Х1 представляет собой М;

Х2 представляет собой А или G;

Х3 представляет собой W;

Х4 представляет собой W или отсутствует,

при этом размер олигопептида варьируется от три- до тетрапептида.

В формуле: М - метионин, А - аланин, G - глицин, W - триптофан.

Формула заявляемого олигопептида была выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания морфогенетического белка хрящевого происхождения CDMP-1 с его клеточным рецептором. Компьютерное конструирование участков связывания CDMP-1 с его рецептором проводили с помощью программного комплекса [3], осуществляющего компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.

Прилагаемые чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На чертежах представлены:

фиг.1 - пространственная структура белка CDMP-1 [4];

фиг.2 - пространственная структура белка CDMP-1 с идентифицированным функциональным сайтом;

фиг.3 - пространственная структура комплекса CDMP-1/рецептор [5];

фиг.4 - пространственная структура комплекса CDMP-1/рецептор с идентифицированным функциональным сайтом белка CDMP-1;

фиг.5 - культуры хондроцитов человека, полученные в результате исследований (пример 3):

А - культура хондроцитов без пептида, 1 пассаж, 3 сутки культивирования;

В - культура хондроцитов без пептида, 4 пассаж, 3 сутки культивирования;

С - культура хондроцитов с введением наиболее активного пептида - M-A-W-W, 1 пассаж, 3 сутки культивирования;

D - культура хондроцитов с введением наиболее активного пептида - M-A-W-W, 4 пассаж, 3 сутки культивирования. Увеличение: × 200.

Пример 1.

In silico конструирование функционального сайта CDMP-1 на основе пространственной структуры белка CDMP-1.

Для осуществления конструирования функционального сайта CDMP-1 использовалась компьютерная программа [3].

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [6]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры CDMP-1. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру CDMP-1 (PDB IB 2BHK, [4]) (фиг.1).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать пространственно сближенные аминокислотные остатки, находящиеся на поверхности глобулы белка CDMP-1 и принимающие участие во взаимодействии CDMP-1 с его рецептором (фиг.2). На основе полученных данных спрогнозировали формулу заявляемого олигопептида.

Пример 2.

In silico конструирование функционального сайта CDMP-1 на основе пространственной структуры комплекса CDMP-1/рецептор.

Для осуществления конструирования функционального сайта CDMP-1 использовалась компьютерная программа [3].

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [6]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры комплекса CDMP-1/рецептор. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса CDMP-1/рецептор (PDB ID 3EVS, [5]) (фиг.3).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать аминокислотные остатки белка CDMP-1, принимающие участие во взаимодействии CDMP-1 с его рецептором (фиг.4).

Полученные результаты совпадают с результатами примера 1, что доказывает правильность конструирования функционального сайта CDMP-1 in silico.

Из представленных на фиг.2 и 4 данных по результатам компьютерного моделирования можно сделать вывод, что заявляемый олигопептид представляет собой функциональный сайт CDMP-1, принимающий участие в связывании с его рецептором на поверхности клеток и стимулирующий пролиферацию хондроцитов. Данное соединение может найти применение в медицине, косметологии и ветеринарии в качестве средства, позволяющего восстанавливать хрящевую и костную ткань.

Пример 3.

Получение клеток хондроцитов для тестирования ростовой активности синтетических пептидов.

Для проведения исследований использовали хрящевую ткань фетусов человека и хрящевую ткань межпозвонковых дисков новорожденной собаки.

Выделение хондроцитов из хрящевой ткани проводили механо-ферментативным методом, используя в качестве диспергента коллагеназу IV типа (МР Biomedicals) в концентрациях 0,05%, 0,1%, 0,15%, трипсин в концентрации 0,025%, гиалуронидазу I-S типа (Sigma-Aldrich) в концентрации 0,05% и сочетание ферментов коллагеназы и гиалуронидазы в концентрации по 0,05% каждого. Хрящевую ткань, очищенную от окружающих мягких тканей, измельчали до кусочков размером 1-3 мм², затем обрабатывали ферментом фетальную ткань в течение 5-8 часов и 18-20 часов - хрящевую ткань позвоночника при постоянном помешивании при температуре 37°C. После ферментации полученную взвесь клеток пропускали через нейлоновый фильтр и отмывали 2 раза от раствора диспергента питательной средой, затем центрифугировали при 1500 об/мин в течение 10 мин. Процент жизнеспособных хондроцитов подсчитывали с помощью трипанового синего [7]. Индекс пролиферации культуры определяли при каждом пассаже [8, 9]. Клетки культивировали с использованием среды DMEM/F12 с добавлением 20% сыворотки крови телят. Клетки с поверхности культуральной чашки снимали с помощью смеси растворов 0,02% Версена и 0,025% трипсина в соотношении 5:1. Пассирование проводили 2 раза в неделю [8, 9]. Морфологию культур клеток оценивали с помощью инвертированного микроскопа «Carl Zeiss Jena». Криоконсервацию проводили ступенчатым методом погружения в жидкий азот с помощью внутриклеточного криопротектора DMSO (МР Biomedicals) в концентрации 10% [8, 9]. Для статистической обработки данных использовали метод достоверности различий между группами по критерию Стьюдента (t) с определением показателя статистической достоверности (при p<0,05 различия рассматривались как статистически достоверные).

Пример 4.

Тестирование синтетических пептидов на ростостимулирующую активность полученных клеток хондроцитов по сравнению с ростом в культуральной жидкости.

В соответствии с описанием примера 3 были получены культуры хондроцитов, которые исследовались на влияние синтетических пептидов при их введении в культуральную среду (контроль) в концентрации 0,15%. Результаты тестирования приведены в таблице.

  № Соединение Относительная активность 1 пассажа на 3-и сутки культивирования, по сравнению с контролем, % Относительная активность 4 пассажа на 3-и сутки культивирования, по сравнению с контролем, % 1 Контроль (среда DMEM/F12 с добавлением 20% сыворотки крови телят = среда) 100 100 2 M-A-W-W + среда 212 26570 3 M-G-W-W + среда 150 21000 4 М-А-W + среда 130 12000 5 M-G-W + среда 120 11000

Полученное соединение полностью сохраняет биологическое действие природного ростового фактора.

Источники информации

1. Chang, S. Cartilage-derived morphogenetic proteins. New members of the transforming growth factor-beta superfamily predominantly expressed in long bones during human embryonic development / Chang S., Hoang В., Thomas J.T., Vukicevic S., Luyten F.P., Ryba N.J.P., Kozak C.A., Reddi A.H., Moos M. //J. Biol. Chem. 1994, 269:28227-28234.

2. Schreuder, H. Crystal structure of recombinant human growth and differentiation factor 5: evidence for interaction of the type I and type II receptor-binding sites / Schreuder H, Liesum A, Pohl J, Kruse M, Koyama M // Biochem Biophys Res Commun. 2005 Apr 15; 329(3):1076-86.

3. Шутова, И.В. Компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул / И.В.Шутова, Л.М.Чемитова, В.П.Голубович // Химия, структура и функция биомолекул: Тез. докл. - Мн., 2006. - С.PR-162.

4. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=2BHK.

5. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=3EVS.

6. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do.

7. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. Томск: Изд-во Томского ун-та; 1992.

8. В. Фрешни Р. Культура животных клеток. Методы. M.: Мир; 1989:117-33.

9. Пинаев Г.Л. Методы культивирования клеток: Сборник научных трудов. П.: Наука; 1988.

ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ АМИНОКИСЛОТ

ОЛИГОПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ АКТИВНОСТЬЮ

МОРФОГЕНЕТИЧЕСКОГО БЕЛКА ХРЯЩЕВОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ (CDMP-1)

ПО ОТНОШЕНИЮ К ПРОЛИФЕРАЦИИ ХОНДРОЦИТОВ

Общая формула

Х1-Х2-Х3-Х4,

где Х1 представляет собой М;

Х2 представляет собой А или G;

Х3 представляет собой W;

Х4 представляет собой W или отсутствует.

В формуле: М - метионин, А - аланин, G - глицин, W - триптофан

Формулы со всеми возможными вариантами последовательностей

1. M-A-W-W

2. M-G-W-W

3. M-A-W

4. M-G-W

Изобретение относится к получению биологически активных веществ пептидной природы, обладающих активностью морфогенетического белка хрящевого происхождения CDMP-1 по отношению к пролиферации хондроцитов. Путем in silico конструирования получают олигопептид общей формулы I: , где X1 представляет собой М; Х2 представляет собой А или G; Х3 представляет собой W; X4 представляет собой W или отсутствует. Изобретение позволяет получить олигопептид, обладающий активностью морфогенетического белка хрящевого происхождения CDMP-1 по отношению к пролиферации хондроцитов, и тем самым расширить арсенал эффективных терапевтических средств, ускоряющих регенерацию хрящевой ткани суставов. 5 ил., 1 табл.

Олигопептид общей формулы I:
,
где X1 представляет собой М;
Х2 представляет собой А или G;
Х3 представляет собой W;
Х4 представляет собой W или отсутствует,
обладающий активностью морфогенетического белка хрящевого происхождения (CDMP-1) по отношению к пролиферации хондроцитов, при этом размер олигопептида варьируется от три- до тетрапептида.