ПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ РОСТОСТИМУЛИРУЮЩЕЙ АКТИВНОСТЬЮ ФАКТОРА РОСТА ГЕПАТОЦИТОВ (HGF) Российский патент 2011 года по МПК C07K14/475 

Изобретение относится к области биоорганической химии, биохимии и медицины, а именно к биологически активным веществам пептидной природы, обладающим ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.

Процесс регенерации печени можно разделить на три фазы: инициацию, пролиферацию и ингибирование. На этапе пролиферации преимущественно функционирует фактор роста гепатоцитов HGF [1], который обеспечивает переход гепатоцитов из G1 в S-фазу. Показано, что фактор роста гепатоцитов HGF участвует в регенерации печени in vivo и является митогеном для гепатоцитов [2]. Фактор роста гепатоцитов ("рассеивающий фактор", scatter factor, SF) представляет собой гликопротеин, состоящий из двух ковалентно связанных субьединиц с молекулярной массой 62 kDa и 34 kDa [3-4].

Заявляемый пептид обладает ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF и стимулирует пролиферацию гепатоцитов.

Задачей настоящего изобретения является расширение арсенала эффективных терапевтических средств, участвующих в регенерации печени.

Основной технический результат, который может быть получен при осуществлении настоящего изобретения, заключается в реализации данного назначения и достигается за счет создания нового синтетического пептида, обладающего ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF, общей формулы I:

,

где Х1 представляет собой Q или V;

Х2 представляет собой Р;

Х3 представляет собой G или β-А;

Х4 представляет собой R или K;

Х5 представляет собой G,

где G - глицин, (β-А) - β-аланин, Р - пролин, V - валин, Q - глутамин, K - лизин, R - аргинин.

Таким образом, выявлено 8 (восемь) последовательностей олигопептидов, которые проявляют активность фактора роста гепатоцитов.

Формула заявляемого пептида была выявлена по результатам компьютерного конструирования участков связывания фактора роста гепатоцитов HGF с рецепторами поверхности стволовых клеток. Компьютерное конструирование участков связывания фактора роста гепатоцитов HGF с его рецептором проводили с помощью программного комплекса, осуществляющего компьютерное моделирование пространственной структуры белковых молекул и дизайн низкомолекулярных соединений, ответственных за биологическую функцию белка.

Нижеследующие чертежи составляют часть описания настоящего изобретения и включены для дополнительной демонстрации некоторых аспектов настоящего изобретения. Настоящее изобретение можно лучше понять путем обращения к одному или нескольким из этих чертежей в сочетании с подробным описанием представленных здесь конкретных вариантов осуществления настоящего изобретения.

На фиг.1 представлена пространственная структура фактора роста гепатоцитов HGF [5].

На фиг.2 представлена пространственная структура белка фактора роста гепатоцитов HGF с идентифицированным функциональным сайтом (функциональный сайт выделен).

На фиг.3 представлена пространственная структура комплекса HGF/рецептор (PDB ID 1SHY) [6].

На фиг.4 представлена пространственная структура комплекса HGF/рецептор (PDB ID 1SHY) с идентифицированным функциональным сайтом белка Г-КСФ (функциональный сайт выделен).

Пример 1. In silico конструирование функционального сайта HGF на основе пространственной структуры белка HGF.

Для осуществления конструирования функционального сайта HGF использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [7]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры фактора роста гепатоцитов HGF. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру фактора роста гепатоцитов HGF [5] (фиг.1).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать аминокислотные остатки белка фактора роста гепатоцитов HGF, принимающие участие во взаимодействии фактора роста гепатоцитов HGF с его рецептором (фиг.2). На основе полученных данных спрогнозировали формулу заявляемого пептида.

Пример 2. In silico конструирование функционального сайта фактора роста гепатоцитов HGF на основе пространственной структуры комплекса HGF/рецептор.

Для осуществления конструирования функционального сайта HGF использовалась компьютерная программа.

Исходными данными для работы послужили первичные и пространственные структуры белков, импортированные из банка данных Protein Data Bank [7]. В базе данных банка проводили поиск пространственной структуры комплекса HGF/рецептор. В результате для компьютерного конструирования отобрали пространственную структуру комплекса HGF/рецептор [6] (фиг.3).

Далее проводили компьютерное моделирование, которое позволило идентифицировать аминокислотные остатки белка фактора роста гепатоцитов HGF, принимающие участие во взаимодействии фактора роста гепатоцитов HGF с его рецептором (фиг.4).

Из представленных на фиг.2 и фиг.4 данных, по результатам компьютерного моделирования можно сделать вывод, что заявляемый олигопептид представляет собой функциональный сайт фактора роста гепатоцитов HGF, принимающий участие в связывании с рецепторами на поверхности стволовых клеток и стимулирующий пролиферацию гепатоцитов. Данное соединение может найти применение в медицине и экспериментальной биохимии.

В качестве сведений, подтверждающих возможность осуществления изобретения, исследовано (Пример 3) влияние полипептидного препарата, созданного синтетическим путем, на эксплантаты печени крыс в возрасте 14 суток, полученные в соответствии с методиками, описанными в работах Хавинсона В.Х. и сотр. [8, 9]. Эксперименты проведены на 90 образцах эксплантов тканей. Методика культивирования подробно описана ранее [10].

Пример 3. Исследование биологической активности синтезированных пептидов.

Исследуемые пептиды добавляли в культуральную среду в концентрациях 20 нг/мл. Контролем служили эксплантаты без добавления пептидов в культуральную среду. Чашки Петри с эксплантатами тканей помещали в термостат при температуре 37°C и через 3 суток просматривали в фазово-контрастном микроскопе. Затем определяли индекс площади (ИП), который рассчитывали в условных единицах как соотношение площади всего эксплантата, вместе с зоной выселяющихся клеток, к исходной площади эксплантата. Значения ИП выражали в процентах, контрольное значение ИП принимали за 100%. Достоверность различий ИП в контрольных и опытных образцах оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Результаты биологических испытаний выбранных олигопептидов приведены в таблице.

Соединение QPGRG QPGKG VPGRG VPGKG QPβ-ARG QPβ-AKG VPβ-ARG VPβ-AKG Площадь, % к контролю 170 175 150 145 180 185 160 155 Достоверность * * * * * * * * * - Р<0,05 по сравнению с контролем

По результатам проведенных исследований можно сделать вывод о том, что при применении заявляемых пептидов в качестве ростовых факторов возрастает пролиферация клеток гепатоцитов.

Источники информации

1. Michalopoulos G.K., De Frances M.C. Liver regeneration. Science 1997; 276: 60-66.

2. Michalopoulos G.K. Liver regeneration: molecular mechanisms of growth control. // FASEB J., 4, 176-187, 1990. FASEB J. 1990.

3. Gherardi E., Coffer, Purification and characterization of scatter factor. // Cell and Motilty factors, ed. I.D.Goldberg. Birkhauser Verlag, Cell and Motilty factors, ed. I.D.Goldberg. Birkhauser Verlag, Basel, 53-62, 1991.

4. Weidner K.M., Behrens J., Vandekerckhove J., Birchmeier W. Scatter factor: molecular characteristics and effect on the invasiveness of epithelial cells. // J. Cell. Biol., 111, 2097-2108, 1990. J. Cell. Biol. 1990.

5. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=1SI5

6. http://www.rcsb.org/pdb/explore/explore.do?structureld=1SHY

7. http://www.rcsb.org/pdb/home/home.do

8. Хавинсон В.Х., Малинин В.В., Чалисова Н.И., Григорьев Е.И. Тканеспецифическое действие пептидов в культуре тканей крыс разного возраста // "Успехи геронтологии", 2002 г., выпуск 9, Т.3, с.278-285.

9. Хавинсон В.Х. Тканеспецифическое действие пептидов // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2001. - Т.132, N 8. - С.228-229.

10. Хавинсон В.Х., Морозов В.Г., Чалисова Н.И., Окулов В.Б. Влияние пептидов головного мозга на клетки нервной ткани in vitro // Цитология. - 1997. - Т.39, N 7. - С.571-575.

Перечень последовательностей аминокислот (в однобуквенном коде):

1. Q-P-G-R-G

2. Q-P-G-K-G

3. Q-P-(β-A)-R-G

4. Q-P-(β-A)-K-G

5. V-P-G-R-G

6. V-P-G-K-G

7. V-P-(β-A)-R-G

8. V-P-(β-A)-K-G

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к пептиду, который обладает ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF. Данный пептид имеет общую формулу I: , где X1 представляет собой Q или V; Х2 представляет собой Р; Х3 представляет собой G или (β-А); Х4 представляет собой R или Х4 представляет собой K при X1 - Q или при X1 - V и Х3 - (β-А); Х5 представляет собой G, где G - глицин, (β-А) - β-аланин, Р - пролин, V - валин, Q - глутамин, K - лизин, R - аргинин. Предложенное изобретение позволяет расширить арсенал эффективных терапевтических средств, участвующих в регенерации печени. 4 ил., 1 табл.

Пептид, обладающий ростостимулирующей активностью фактора роста гепатоцитов HGF, общей формулы I:
,
где X1 представляет собой Q или V;
Х2 представляет собой Р;
Х3 представляет собой G или (β-А);
Х4 представляет собой R или
Х4 представляет собой K при X1 - Q или при X1 - V и Х3 - (β-А);
Х5 представляет собой G,
где G - глицин, (β-А) - β-аланин, Р - пролин, V - валин, Q - глутамин, K - лизин, R - аргинин.