СПОСОБ СТИМУЛЯЦИИ IN VITRO ПОЛИПОТЕНТНЫХ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2012 года по МПК C12N5/775 

Изобретение относится к области экспериментальной биологии и медицины и касается способа стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток.

Известно большое количество способов стимуляции in vitro гемопоэтических клеток-предшественников.

Наиболее близким по технической сущности, механизму действия и техническому результату прототипом является способ стимуляции гемопоэтических стволовых клеток с помощью препарата гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ), который добавляют в необходимой концентрации в культуру ткани [1].

Недостатком данного способа является проявление его эффективности только в отношении коммитированных клеток-предшественников: грануломоноцитарных (ГМ) и гранулоцитарных (Г) колониеобразующих единиц (КОЕ) [1], и практически отсутствие таковой в отношении полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (ПГСК).

Задачей, решаемой данным изобретением, является повышение эффективности способа.

Поставленная задача достигается тем, что клетки костного мозга, которые культивируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% СO₂ и 100% влажности воздуха в течение 14 сут в полувязкой культуральной среде, содержащей гранулоцитарный колониестимулирующий фактор, предварительно на 30 минут помещают в раствор гиалуронидазы 1 ЕД/мл.

Новым в предлагаемом изобретении является применение раствора гиалуронидазы в качестве среды для преинкубации клеточного материала, содержащего полипотентные гемопоэтические стволовые клетки.

Многие заболевания системы крови зачастую не поддаются лечению существующими медикаментозными средствами. Данное обстоятельство указывает на актуальность разработки новых гемостимуляторов. При этом наиболее перспективным является создание препаратов, способных оказывать влияние на наиболее ранние кроветворные предшественники - полипотентные гемопоэтические стволовые клетки, обладающие максимально высоким ростовым потенциалом [2, 3].

Для изучения закономерностей функционирования клеток-предшественников и исследования механизмов их регуляции в эксперименте для создания патогенитически обоснованных методов коррекции нарушений гемопоэза используют различные способы клонирования. Наиболее часто применяются методики культивирования клеточного материала in vitro [1]. При этом для эффективного клонирования необходимым условием является стимуляция кроветворных клеток. Данные способы относительно просты и доступны, но лишь при клонировании коммитированных клеток-предшественников, развитие которых, в отличие от полипотентных гемопоэтических стволовых клеток, уже детерминировано в определенном направлении. Так, существует способ клонирования КОЕ-ГМ и КОЕ-Г in vitro, где стимуляция клеток-предшественников осуществляется с помощью линейно-рестриктированного фактора роста - Г-КСФ [1]. При этом эффективность стимуляции Г-КСФ в отношении указанных клеток-предшественников определяется наличием на них специфических рецепторов к нему, а отсутствие таковой в отношении ПГСК объясняется отсутствием либо низкой экспрессией этих рецепторов на данных родоиачальных элементах [2].

Вместе с тем, известна возможность усиления гемостимулирующего действия Г-КСФ при его введении in vivo путем дополнительного применения препаратов гиалуронидазы [4]. При этом механизмом потенцирования эффектов Г-КСФ в отношении КОЕ-ГМ является образование под влиянием гиалуронидазы in situ в гемопоэтической ткани низко- и среднемолекулярных форм гиалуроновой кислоты, обладающих свойствами повышать интенсивность процессов клеточного деления, из ее высокомолекулярных полимеров, составляющих основную часть межклеточного матрикса [5, 6].

Тем не менее, способность гиалуронидазы оказывать влияние непосредственно на кроветворные клетки, тем более приводить к появлению чувствительности у полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (гранулоцито-эритроидно-моноцито-мегакариоцитарных колониеобразующих единиц [1, 2]) к Г-КСФ, реализующим свой эффекты через специфические рецепторы, которых у данных прогениторных элементов нет либо их количество чрезвычайно мало, не известна.

Факт применения гиалуронидазы с достижением нового технического результата, заключающегося в эффективной стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток, для специалиста является не очевидным.

Заявляемые существенные признаки проявили в совокупности новые свойства, не вытекающие явным образом из уровня техники в данной области. Предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом.

Взвесь клеток костного мозга в концентрации лабораторных животных (мышей) помещают на 30 минут в питательную среду, содержащую 1 ЕД/мл гиалуронидазы, после чего клеточный материал дважды отмывают центрифугированием, получают неприлипающую фракцию клеток, которую помещают в среду следующего состава: 80% среды RPMI-1640, 19% ЭТС, 280 мг/л L-глутамина, 1% метилцеллюлозы, 50 мг/л гентамицина, 5 нгмл рекомбинантного Г-КСФ и инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 14 сут.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на мышах линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 20 шт. массой 18-20 г. Получены из питомника экспериментально-биологической клиники лабораторных животных НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1

Костный мозг мыши в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) поместили на 30 минут в среду RPMI-1640 («Sigma», США), содержащую 1 ЕД/мл гиалуронидазы («Лидаза», ФГУП «НПО Микроген» МЗ РФ). Затем клеточный материал дважды отмыли центрифугированием и получали неприлипающую фракцию миелокариоцитов. Для этого суспензию костномозговых клеток инкубировали в течение 45 мин в среде, содержащей 90% RPMI-1640 («Sigma», США) и 10% ЭТС («Sigma», США), в пластиковых чашках Петри диаметром 35 мм при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности. После чего с помощью пипетки собирали неприлипающие миелокариоциты и помещали их в концентрации 3×10⁵ клеток в среду следующего состава: 80% среды RPMI-1640 («Sigma», США), 19% ЭТС («Sigma», США), 280 мг/л L-глутамина («Sigma», США), 1% метилцеллюлозы («Sigma», США), 50 мг/л гентамицина («Sigma», США), 5 нг/мл гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (пэг-Г-КСФ, ООО «Саентифик фьючер менеджмент», г.Новосибирск). По 0,5 мл приготовленной клеточной взвеси помещали в 24-луночные планшеты («Corning», США) в CO₂-инкубаторе при 37°C, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха и инкубировали, в одном случае - 7 сут (для подсчета КОЕ-ГМ и КОЕ-Г), а в другом - 14 сут (для подсчета КОЕ-ГЭММ).

После этого в 7 суточных культурах подсчитывали число КОЕ-ГМ и КОЕ-Г, а в 14 суточных культурах количество КОЕ-ГЭММ. Под гранулоцитарно-макрофагальными колониями (КОЕ-ГМ) подразумевали образовавшиеся в полутвердой культуре клеточные агрегаты, содержащие 50 и более элементов грануломоноцитарного ряда, а под КОЕ-Г - образование, содержащее 30 и более клеток гранулоцитарного типа. Под колонией гранулоцито-эритроидно-моноцито-мегакариоцитарного типа (КОЕ-ГЭММ) подразумевали образовавшийся в культуре очаг гемопоэза, содержащий 300 и более клеток различных типов. Подсчет проводили под инвертированным микроскопом «Axio Observer A.1» (Carl Zeiss, Германия).

При этом контролем служили культуры неприлипающих клеток костного мозга без добавления Г-КСФ и полученных по способу-прототипу: аналогичным описанному путем, но не подвергшихся преинкубации в растворе гиалуронидазы.

В ходе эксперимента наблюдалась значительная стимуляция роста КОЕ-ГМ и КОЕ-Г при добавлении в культуру ткани миелакариоцитов, не обработанных гиалуронидазой, Г-КСФ (табл.). Однако изменений уровня колониеобазования в 14-суточной культуре не наблюдалось, что свидетельствовало об отсутствии стимулирующего эффекта у Г-КСФ в отношении КОЕ-ГЭММ.

Рост КОЕ-ГМ, КОЕ-Г и КОЕ-ГЭММ под влиянием Г-КСФ в культурах клеток неприлипающих миелокариоцитов, не обработанной гиалуронидазой (1) и подвергшихся воздействию данного фермента (2), (X±m)   КОЕ-ГМ, на 100 тыс. миелокариоцитов КОЕ-Г, на 100 тыс. миелокариоцитов КОЕ-ГЭММ, на 100 тыс. миелокариоцитов фон 8,17±0,28 17,0±0,37 4,78±0,3 1 24,3±2,7* 36,9±4,2* 4,61±0,34 2 31,7±1,44*# 45,8±2,9* 16,3±1,1*# * - отмечена достоверность различий с фоновыми значениями при p<0,05 # - отмечена достоверность различий с показателями в 1 группе при p<0,05

Вместе с тем, исследование культур клеток, подвергшихся перед инкубацией воздействию гиалуронидазы, показало не только более существенное (чем без такового) увеличение выхода коммитированных клеток-предшественников (КОЕ-ГМ и КОЕ-Г), но и значительное повышение количества полипотентных гемопоэтических стволовых клеток (КОЕ-ГЭММ) в 14-суточной культуре неприлипающих миелокариоцитов: до 341% от фона (табл.).

Таким образом, предварительная обработка клеточного материала, содержащего клетки-предшественники, раствором гиалуронидазы приводит к стимуляции с помощью Г-КСФ не только коммитированных, но и полипотентных кроветворных элементов in vitro. При этом появление у ПГСК способности отвечать на стимулы Г-КСФ, по-видимому, связано с модификацией под влиянием фермента рецепторного аппарата ранних родоначальных клеток крови.

Предлагаемый способ позволяет эффективно стимулировать и клонировать in vitro полипотентные гемопоэтические стволовые клетки.

Литература

1. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - С.130-145.

2. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В. Роль гемопоэзиндуцирующего микроокружения в регуляции кроветворения при цитостатических миелосупрессиях. - Томск: STT, 1999. - 114 с.

3. Чертков И.Л., Дризе Н.И., Воробьев А.И. Схема кроветворения // Терапевтический архив. - 2005. - №7. - С.5-12.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов В.В. Формирование реакций системы крови под влиянием гранулоцитарного колониестимулирующего фактора и гиалуронидазы // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - №6. - С.628-633.

5. Зюзьков Г.Н., Жданов В.В., Дыгай A.M., Гольдберг Е.Д. Роль гиалуронидазы в регуляции гемопоэза // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - №12. - С.690-695.

6. Дыгай A.M., Зюзьков Г.Н., Жданов ВВ., Верещагин Е.И., Удут Е.В., Хричкова Т.Ю., Симанина Е.В., Ставрова Л.А., Андреева Т.В., Минакова М.Ю., Мадонов П.Г., Киншт Д.Н. Регуляция функций прогениторных клеток с помощью гиалуронидазы // Вестник РАМН. - 2009. - №11. - С.6-9.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к клеточным технологиям, и может быть использовано в медицине. Клетки костного мозга подвергают 30-минутной преинкубации в питательной среде, содержащей 1 ЕД/мл гиалуронидазы, и дважды отмывают центрифугированием. Затем неприлипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в питательной среде с добавлением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора. Изобретение позволяет осуществлять эффективную стимуляцию полипотентных гемопоэтических стволовых клеток in vitro. 1 табл.

Способ стимуляции in vitro полипотентных гемопоэтических стволовых клеток костного мозга, заключающийся в том, что неприлипающую фракцию миелокариоцитов культивируют в питательной среде с добавлением гранулоцитарного колониестимулирующего фактора, отличающийся тем, что перед получением неприлипающей фракции миелокариоцитов клетки костного мозга подвергают 30-минутной преинкубации в питательной среде, содержащей 1 ЕД/мл гиалуронидазы, и дважды отмывают центрифугированием.