СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОДУКЦИИ ФАКТОРОВ ХОМИНГА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК Российский патент 2010 года по МПК C12N5/02 C12Q1/02 G01N33/15 G01N33/50 A61M1/16 

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицины.

Достижения в области клеточных технологий привели к возможности развития нового направления в лечении целого ряда заболеваний - с помощью клеточной терапии. Перспективность реализации данного подхода во многом связана со знанием механизмов и закономерностей функционирования прогениторных клеток, определяющих их пролиферативно-дифференцировочный статус, способность к миграции и хомингу в область повреждения.

Известны способы изучения миграции стволовых клеток in vitro и роль различных факторов, определяющих их хоминг, с помощью специальных камер, содержащих полупроницаемые мембраны и фильтры, способные под влиянием градиента концентрации хемоаттрактантов пропускать прогениторные элементы [1, 2]. При этом регистрация мигрировавших клеток определяется методами клеточного сортинга.

Недостатком данных способов является необходимость использования высокоспециализированного и дорогостоящего оборудования и материалов.

Задачей, решаемой данным изобретением, является упрощение способа.

Поставленная задача достигается тем, что клеточный материал, содержащий прогениторные клетки, находящиеся в жидкой культуральной среде, помещают поверх предварительно подготовленной агаровой среды, в которой находятся клеточные элементы микроокружения отдельных тканей, продуцирующие факторы хоминга. Полученную двухслойную культуру инкубируют в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 2-24 ч. Затем путем отмывания с поверхности агаровой среды собирают неприлипшие клетки, переносят их в полувязкую культуральную среду и инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% СО₂ и 100% влажности воздуха в течение 3-14 сут. После чего на основании регистрации разницы количества прогениторных элементов, содержащихся в клеточном материале, до и после его помещения на агаровую среду, осуществляют подсчет мигрировавших под влиянием факторов хемотаксиса клеток-предшественников. При этом наличие клеток-предшественников определяется по способности клеточного материала к колониеобразованию.

Новым в предлагаемом способе является использование в качестве полупроницаемой мембраны агаровой среды и изучение колониеобразующей способности клеточного материала в качестве критерия оценки миграции прогениторных клеток.

Полученные в последние годы сведения о свойствах мультипотентных клеток-предшественников организма открыли возможность развития новой стратегии лечения многих заболеваний - с помощью стволовых клеток [3, 4]. Причем наиболее физиологичным подходом к решению задач регенеративной медицины является метод фармакологической стимуляции эндогенных стволовых клеток (СК) путем подражания деятельности естественных регуляторных систем их функционирования [3, 4]. Изучение закономерностей жизнедеятельности и механизмов регуляции СК является основой для выбора необходимых направлений и «точек-приложения» действия потенциальных лекарственных средств - модификаторов функций прогениторных элементов. При этом весьма привлекательным выглядит возможность повышения регенераторного потенциала организма за счет модуляции процессов миграции и хоминга («оседания и приживления») СК, которые, как известно, осуществляются во многом благодаря градиенту концентрации хемоаттрактантов, вырабатываемых клеточными элементами микроокружения (фибробластами, макрофагами и др.) [1, 2].

Изучение миграции СК и роль различных факторов, определяющих их хоминг, осуществляются с помощью способов, в основе которых лежит использование специальных камер, оснащенных полупроницаемыми мембранами. При этом для подсчета мигрирующих элементов используют различные виды сортинга, предполагающие использование клеточного либо магнитного сортера [1, 2].

В то же время для изучения биологии СК в экспериментах in vitro при культивировании различных тканей широко используется агаровая среда, а также метод колониеобразования как инструмент определения содержания прогениторных элементов в клеточном материале [5]. Тем не менее, на сегодняшний день не известна возможность использования агаровой среды в качестве полупроницаемой мембраны, через которую может осуществляться миграция СК, в том числе под влиянием хемоаттрактантов, выработанных клетками, находящимися в ней. Кроме того, не исследована валидность применения метода колониеобразования для изучения хоминга прогениторных элементов.

Факт применения в качестве полупроницаемой мембраны in vitro агаровой среды, а также изучение колониеобразующей способности клеточного материала с целью исследования миграции стволовых клеток и продукции элементами микроокружения тканей факторов хоминга прогениторных клеток для специалиста не является очевидным и не вытекает явным образом из уровня техники в данной области. Новые признаки позволяют упростить способ, и предлагаемое изобретение может быть использовано в экспериментальной биологии и медицине с выходом в практическое здравоохранение для создания новых эффективных способов клеточной терапии. Идентичной совокупности признаков при исследовании уровня техники по патентной и научно-медицинской литературе не обнаружено.

Исходя из вышеизложенного следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Способ осуществляют следующим образом:

Клеточный материал, содержащий прогениторные клетки, находящиеся в жидкой культуральной среде, помещают поверх предварительно подготовленной агаровой среды, в которой находятся клеточные элементы микроокружения отдельных тканей, продуцирующие факторы хоминга. Полученную двухслойную культуру инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 2-24 ч. Затем путем отмывания с поверхности агаровой среды собирают неприлипаюшие клетки, переносят их в полувязкую метилцеллюлозную культуральную среду и инкубируют в CO₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 3-14 сут. После чего на основании регистрации разницы количества прогениторных элементов, содержащихся в клеточном материале, до и после его помещения на агаровую среду осуществляют подсчет мигрировавших под влиянием факторов хемотаксиса клеток-предшественников. При этом наличие клеток-предшественников определяется по способности клеточного материала к колониеобразованию. Количество мигрировавших клеток и продукцию хемотаксических веществ, активных в отношении прогениторных клеток, оценивают в условных единицах по формуле:

Х=а-в,

где а - количество колоний, выросших (в контроле) из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, не содержащей клеток; в - количество колоний, выросших из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки.

Предлагаемый способ был изучен в экспериментах на клетках культуры костного мозга мышей линии CBA/CaLac (животные 1 категории, конвенциональные линейные мыши) в количестве 36 шт., массой 18-20 г.Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования НИИ фармакологии СО РАМН (сертификат имеется).

Пример 1

У мышей линии CBA/CaLac, массой 22 г, умерщвленных с помощью дислокации шейных позвонков под эфирным наркозом, в стерильных условиях (боксе, оборудованном ламинаром) выделяли бедренную кость, очищали ее от мягких тканей и промывали канал 0,5 мл питетельной среды (90% RPMI-1640, 90% эмбриональной телячей сыворотки (ЭТС), "Sigma", США). Костный мозг ресуспендировали шприцом через иглы уменьшающегося диаметра, отмывали центрифугированием и подсчитывали их количество, определяя жизнеспособность миелокариоцитов с помощью 0,5% трипанового синего ("Serva", ФРГ) [5]. Затем помещали в агаровую среду следующего состава: 1% бактоагар («Difco», США), 50% среды DMEM ("Sigma", США), 20% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Sigma", США) и доводили концентрацию клеток до 106 жизнеспособных миелокариоцитов/мл. Клеточный материал в 2 мл среды помещали в чашки Петри (диаметр 30 мм) и инкубировали в СО₂ инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 5 сут. После этого на агаровую культуру с клеточным материалом и на агаровую среду, не содержащую клеток (контроль), «наслаивали» 3 млн вновь полученных миелокариоцитов, находящихся в 2 мл культуральной среды (80% среды DMEM ("Sigma", США), 20% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Sigma", США). При этом в случае изучения миграции кроветворных предшественников использовали неприлипающие клетки кроветворной ткани, а при исследовании миграции стомальных прекурсоров применяли цельный костный мозг. Полученные культуры инкубировали в CO₂ инкубаторе ("Jouan", Франция) при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 2-3 ч. Затем путем пятикратного отмывания (средой DMEM ("Sigma", США)) с поверхности агаровых сред собирали неприлипшие клетки, отмывали их центрифугированием, переносили в 24-луночные планшеты в полувязкой культуральной среде. Для изучения числа грануломоноцитарных (КОЕ-ГМ) и эритроидных (КОЕ-Э) клеток-предшественников среда была следующего состава: 1% метилцеллюлозы ("Sigma", США), 50% RPMI ("Sigma", США), 20% ЭТС ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), а также при клонировании КОЕ-ГМ 5 мкг/л рекомбинантного Г-КСФ («Нейпоген», Швейцария) и 0,5 Ед/мл рекомбинантного эритропоэтина ("Sigma", США) при культивировании КОЕ-Э. Клеточный материал инкубировали в СО₂-инкубаторе при 37°С, 5% CO₂ и 100% влажности воздуха в течение 3 и 7 сут соответственно.

При исследовании миграции мезенхимальных прекурсоров клеточный материал в аналогичном режиме инкубировали 7 сут в среде, состоявшей из 1% метилцеллюлозы ("Sigma", США), 50% DMEM ("Sigma", США), 280 мг/л L-глутамина ("Sigma", США), 50 мг/л гентамицина ("Serva", ФРГ), 5000 МЕ/л гепарина ("Sigma", США). После этого производили подсчет эритроидных, грануломоноцитарных и фибробластных (КОЕ-Ф) колоний [5]. Под колонией подразумевали клеточное образование, содержащее 50 и более клеток. Затем определяли разницу количества прогениторных элементов, собранных с агаровой среды без клеток, и отмытых со среды, в которой находились миелокариоциты.

Количество мигрировавших клеток и продукцию хемотаксических веществ, активных в отношении прогениторных клеток и определяющуюся как хемотаксическая активность (ХТА), оценивали в условных единицах по формуле:

Х=а-в,

где а - количество колоний, выросших из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, не содержащей клеток (в контроле); в - количество колоний, выросших из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки (опыт).

В ходе эксперимента количество прогениторных элементов в клеточном материалале, состоящем из неприлипающих миелокариоцитов, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки, было достоверно ниже, чем их содержание во фракции неприлипающих клеток, собранных с поверхности агаровой среды без клеток (табл.). При этом количество мигрировавших клеток / ХТА исследуемого материала в отношении различных предшественников было практически равным.

Предлагаемый способ позволяет объективно изучать миграцию стволовых клеток in vitro и продукцию элементами микроокружения тканей факторов хоминга прогениторных клеток различных классов.

Таблица   Прогениторные клетки КОЕ-Ф КОЕ-ГМ КОЕ-Э Количество колоний Контроль 57,3±2,4 36,8±1,7 42,6±2,7 Опыт 26,1±2,9* 17,6±1,02* 22,3±0,97* ХТА / количество мигрировавших клеток 21,2±1,3 19,2±1,3 20,3±1,45 * - отмечена достоверность различия показателя от его значения в контроле при р<0,05

Источники информации

1. Kim C.H., Broxmeyer H.E. In Vitro Behavior of Hematopoietic Progenitor Cells Under the Influence of Chemoattractants: Stromal Cell-Derived Factor-1, Steel Factor, and the Bone Marrow Environment // Blood, Vol.91 No.1 (January 1), 1998: pp.l00-110.

2. Aiuti A., Webb I.J., Bleui C, Springer Т., Gutierrez-Ramos J.C. The Chemokine SDF-1 Is a Chemoattractant for Human CD34 + Hematopoietic Progenitor Cells and Provides a New Mechanism to Explain the Mobilization of CD34 + Progenitors to Peripheral Blood // J. Exp. Med. - Vol.185. - January 1997. №1. - Р.111-120.

3. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Фармакологические аспекты регенеративной медицины // Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2008. - приложение 2. - С.14-21.

4. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Жданов В.В., Зюзьков Г.Н. и др. Фармакологическая регуляция стволовых клеток // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т.7. - Ч.1. - С.1662-1663.

5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к способу определения продукции факторов хоминга стволовых клеток костного мозга, и может быть использовано в клеточной терапии для определения пролиферативно-дифференцировочного статуса стволовых клеток. Клеточный материал, содержащий стволовые клетки костного мозга, находящиеся в жидкой культуральной среде, помещают поверх предварительно подготовленной агаровой среды, в которой находятся клеточные элементы костного мозга, продуцирующие факторы хоминга. После инкубации полученной двухслойной культуры неприлипшие клетки переносят в полувязкую культуральную среду и инкубируют в режиме, необходимом для колониеобразования. Затем на основании регистрации разницы количества стволовых клеток, содержащихся в клеточном материале в контроле и после его помещения на агаровую среду, содержащую факторы хоминга, осуществляют подсчет мигрировавших под влиянием факторов хоминга стволовых клеток. Изобретение позволяет упростить способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток за счет применения в качестве полупроницаемой мембраны агаровой среды и введения в качестве критерия оценки продукции факторов хоминга стволовых клеток изменения колониеобразующей способности клеточного материала. 1 табл.

Способ определения продукции факторов хоминга стволовых клеток костного мозга, основанный на подсчете мигрировавших стволовых клеток через полупроницаемый материал, содержащий клетки ткани костного мозга, отличающийся тем, что в качестве полупроницаемого материала используют агаровую среду, а в качестве критерия оценки миграции стволовых клеток - изменение колониеобразующей способности клеточного материала, при этом количество мигрировавших клеток определяют по формуле
Х=а-в,
где Х - количество мигрировавших стволовых клеток; а - количество колоний, выросших (в контроле) из стволовых клеток, полученных с поверхности агаровой среды, несодержащей клетки костного мозга; в - количество колоний, выросших из стволовых клеток, полученных с поверхности агаровой среды, содержащей клетки костного мозга.