ГЕМОСТИМУЛИРУЮЩЕЕ СРЕДСТВО Российский патент 2014 года по МПК A61K31/439 A61P7/00 

Изобретение относится к медицине, конкретно к фармакологии и гематологии.

Высокая частота встречаемости миелосупрессивных состояний и их влияние на продолжительность и качество жизни пациентов [1, 2], является основанием широкого применения гемостимулирующих средств в медицинской практике.

Известно большое количество гемостимулирующих средств [1, 2].

Недостатком данных средств является зачастую их неэффективность и высокая частота побочных эффектов [3, 4].

Задачей, решаемой настоящим изобретением, является расширение арсенала высокоэффективных гемостимулирующих средств.

Поставленная задача достигается применением напеллина в качестве гемостимулирующего средства.

Новым в предлагаемом изобретении является использование в качестве гемостимулирующего средства напеллина.

Используемое оригинальное средство напеллина было разработано и получено ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН (г.Томск) совместно с Национальным исследовательским Иркутским Государственным Техническим Университетом (г.Иркутск) и представляло собой 0,00025% водный раствор данного алкалоида. Напеллин извлекался из растительного сырья (травы растений семейства лютиковых) в виде свободных оснований экстракцией стандартным методом [5].

Миелосупрессивные состояния, представляющие собой в большинстве случаев осложнения используемых в онкологической практике цитостатических методов лечения [3], зачастую для поддержания качества жизни пациентов и обеспечения переносимости терапии основного заболевания требуют применения различных гемостимулирующих средств. При этом достижения экспериментальной и клинической гематологии последних десятилетий, свидетельствующие о важной роли гуморальных ростовых факторов сыворотки крови и цитокинов, продуцируемых клеточными элементами гемопоэзстимулирующего микроокружения (ГИМ) в регуляции кроветворения [1, 3], легли в основу разработки целого ряда высокоэффективных гемостимуляторов - аналогов эндогенных гемопоэтинов.

Наиболее часто в клинике для коррекции нарушений в системе крови используются препараты на основе цитокинов [1, 3]. Данные препараты обладает выраженной гранулоцитопоэзстимулирующей активностью, однако их белковая природа предопределяет возможность лишь парентерального пути введения в организм и высокий риск развития побочных эффектов и осложнений [3, 4], обусловленных иммуногенностью данных факторов роста. Использование же других препаратов (растительного и синтетического происхождения) в ряде случаев оказывается абсолютно неэффективным [3].

В то же время в ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН была показана принципиальная возможность и высокая эффективность управления функциями мезенхимальных стволовых клеток с помощью отдельных дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского, в том числе с помощью напеллина [6]. При его пероральном приеме обнаружена выраженная стимуляция стромальных родоначальных клеток кожи, сопровождаемая ускорением процесса регенерации поверхностных тканей [6].

При этом влияние напеллина на процессы регенерации кроветворной ткани и возможность стимуляции гемопоэза за счет активации родоначальных клеток крови не известны. Эксперимент показал непредсказуемые результаты.

Факт применения напеллина с достижением нового технического результата, заключающегося в стимуляции гемопоэза, для специалиста является не очевидным.

Новые свойства не вытекают явным образом из уровня техники в данной области и не обнаружены в патентной и научно-технической литературе.

Предлагаемое изобретение может быть использовано в медицине.

Исходя из вышеизложенного, следует считать заявляемое техническое решение соответствующим критериям: «Новизна», «Изобретательский уровень», «Промышленная применимость».

Эксперименты были проведены на 58 мышах линии СВА. Животные получены из питомника отдела экспериментального биомедицинского моделирования ФГБУ «НИИ фармакологии» СО РАМН.

Исследования проводили в соответствии с правилами лабораторной практики (GLP), Приказом МЗСР РФ №708н от 23.08.2010 «Об утверждении правил лабораторной практики», Федеральным Законом от 12 апреля 2010 г. №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств», «Методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ» (2002) [7].

Пример 1

Используемое оригинальное средство получали из травы аконита байкальского и живокости высокой. Надземная часть растений, собранная в период цветения в Иркутской области, измельчалась до размера частиц менее 5 мм, обрабатывалась раствором карбоната натрия и подвергалась непрерывной экстракции хлороформом в течение 5 суток. Хлороформный экстракт упаривали до небольшого объема и тщательно экстрагировали 5% серной кислотой. Кислотную вытяжку подщелачивали карбонатом натрия до pH 9-10 и последовательно экстрагировали сначала эфиром, затем хлороформом. Эфирный экстракт упаривали досуха, растворяли в небольшом количестве эфира и хроматографировали на дезактивированной окиси алюминия в системе гексан-ацетон (90→50%). Эфирорастворимую фракцию подвергли дробной экстракции буферными растворами с увеличивающимися значениями pH. Эфирный раствор, оставшийся после экстракции наиболее щелочным буфером, упаривали досуха и хроматографировали на окиси алюминия в системе гексан-метанол с элюцией напеллина. Вещество растворяли в дистиллированной воде до конечной концентрации 0,00025%.

Пример 2

Эффективность стимуляции гемопоэза определялась на модели цитостатической миелосупрессии в соответствии с методическими указаниями по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ [7].

Цитостатическую миелосупрессию моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения раствора 5-фторурацила (5-ФУ) в ½ максимально переносимой дозы (МПД) (114 мг/кг). Начиная со следующего дня после введения цитостатика мыши опытной группы получали per os 0,00025%-водный раствор напеллина по 0,025 мг/кг 1 раз в сутки в течение 5 дней. Контрольным животным в аналогичных условиях вводили растворитель (дистиллированную воду) в эквивалентном объеме (0,2 мл).

На 5, 8-е и 12-е сут после введения цитостатика животных умерщвляли путем ингаляции CO₂. У опытных и контрольных мышей общепринятыми методами определяли содержание ретикулоцитов в периферической крови, а также показатели костномозгового кроветворения (общее количество миелокариоцитов, миелограмма) [8]. Содержание коммитированных клеток - предшественников гранулоцитопоэза (КОЕ-ГМ) и стромальных механоцитов (КОЕ-Ф) в костном мозге, а также продукцию колониестимулирующей активности активных субстанций (КСА) прилипающими и неприлипающими элементами гемопоэзиндуцирующего микроокружения (ГИМ) определяли с помощью культуральных методов in vitro [8].

Статистическую обработку полученных данных проводили методом вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. В случаях отклонения распределения вариант в выборках от нормального для оценки достоверности различий применяли непараметрический критерий Уилкоксона-Манна-Уитни.

В ходе эксперимента введение 5-ФУ проводило к закономерному [9] развитию депрессии гранулоцитарного ростка кроветворения. На протяжении всего сроки исследования отмечалось падение содержания незрелых (5-е сут) и зрелых (5, 8-е сут) нейтрофильных гранулоцитов в гемопоэтической ткани, сменяющееся возрастанием их количества на 8, 12-е и 12-е сут соответственно (табл.1). Отражением указанных изменений костномозгового кроветворения явилось падение числа палочко- и сегментоядерных нейтрофилов в периферической крови на 5-е сут и увеличение данных параметров на 12-е сут опыта (табл.2). В основе описанных феноменов лежало снижение содержания КОЕ-ГМ в костном мозге в начальные сроки исследования (5, 8-е сут) и развитие выраженной компенсаторной реакции [9] со стороны пула кроветворных предшественников к концу эксперимента (табл.3). При этом регистрируемое на 12-е сут возрастание числа костномозговых предшественников грануломоноцитопоэза было связано с повышением продукции гемопоэтинов (КСА) неприлипающими миелокариоцитами (табл.4). Кроме того, на 5-е сут было выявлено возрастание функциональной активности мезенхимальных прекурсоров (табл.3), играющее важную роль в восстановлении поврежденного данным цитостатическим агентом ГИМ [9].

Введение напеллина приводило к значительному повышению интенсивности процессов регенерации гранулоцитарного ростка кроветворения. Наблюдалось увеличение содержания незрелых и зрелых нейтрофильных гранулоцитов в костном мозге: до 161,6% и 126,6% от цитостатического контроля на 8-е и 12-е сут опыта соответственно (табл.1). В периферической крови имело место повышение числа палочко- и сегментоядерных нейтрофилов (до 1000,0% и 187,9% от контрольных значений на 5-е сут соответственно) (табл.2). При этом несопоставимость сроков изменений картины крови с динамикой восстановления костномозгового кроветворения свидетельствует о значительной активации перераспределительных механизмов под влиянием напеллина.

Исследование механизмов гемостимулирующего действия алкалоида напеллина выявило зависимость формирования картины крови и костного мозга от состояния пула костномозговых родоначальных клеток. Введение раствора исследуемого фармакологического вещества сопровождалось резким увеличением содержания КОЕ-ГМ в гемопоэтической ткани на 5-е и 8-е сут опыта (до 643,8% и 2566,0% от цитостатического контроля соответственно) (табл.3).

При этом реакция со стороны кроветворных предшественников, во многом, определялась изменением секреторной функции стромальных элементов ГИМ. В ходе эксперимента регистрировалось возрастание выработки гемопоэтически активных субстанций прилипающими миелокариоцитами на 5, 8-е сут исследования. В то же время напеллин, извлеченный из аконита байкальского, подавлял продукцию КСА мобильной (неприлипающей) фракцией нуклеаров костного мозга 61,3% от контрольных значений на 5-е сут эксперимента (табл.4).

В ходе углубленного изучения механизмов действия исследуемого алкалоида было установлено его значительное влияние на состояние пула стромальных прогениторных клеток костного мозга. Введение алкалоида на фоне моделирования цитостатической миелосупрессии приводило к снижению уровня содержания мезенхимальных предшественников (КОЕ-Ф) на 5-сут опыта в 8 раз по сравнению с контрольной группой (табл.3) При этом, учитывая сведения литературы [6] о стимулирующем влиянии ряда алкалоидов аконита байкальского на дифференцировку мезенхимальных предшественников, можно предположить, что развитие выявленного феномена явилось результатом ускорения созревания данных родоначальных элементов. Обнаруженные изменения, очевидно, определяли ускоренное течение регенеративных процессов кроветворной ткани за счет максимально быстрого восстановления ГИМ [9], проявлением которого явилось, в том числе, описанное выше повышение секреции КСА прилипающими миелокариоцитами.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о выраженных гранулоцитопоэзстимулирующих свойств напеллина. При этом механизмом ускорения регенерации кроветворной ткани является активация родоначальных гемопоэтических клеток за счет как, очевидно, прямого действия на них алкалоида [6], так и в результате возрастания фидерной способности стромального компартмента ГИМ. В то же время выявленное выраженное влияние напеллина на функции фибробластных предшественников (содержащих в своем составе, помимо коммитированных прогениторных элементов, истинные (мультипотентные) стволовые клетки [10]) указывает на перспективность разработки на основе напеллина не только гемостимулирующего средства, но и препарата для регенеративной медицины в целом.

Цитируемая литература

1. Metcalf D. Hemopoietic growth factors. 1. // The Lancet. - 1989. - Vol.15. - P.825-827.

2. Машковский М.Д. Лекарственные средства: 15-е изд. - М.: 00 «Изд-во Новая Волна», 2008. - 1206 с.

3. Волкова М.А. Гранулоцитарный колониестимулирующий фактор граноцит и его клиническое применение // Тер. архив. - 1998. - №4. - С.80-84.

4. Anderson J.A. Allergic reactions to drugs and biologic agents. JAMA. - 1992 - vol. 268. - p.2845-2857.

5. Погодаева Н.Н., Жапова Ц., Верещагин А.Л., Горшков А.Г., Семенов А.А. Изучение алкалоидного состава некоторых видов сибирских аконитов //Раст. ресурсы, вып.2, 2000 г.С.79-84.

6. Зюзьков Г.Н., Крапивин А.В., Нестерова Ю.В., Поветьева Т.Н., Жданов В.В., Суслов Н.И., Фомина Т.И., Удут Е.В., Мирошниченко Л.А., Симанина Е.В., Семенов А.А., Кравцова С.С., Дыгай A.M. Механизмы регенераторного действия дитерпеновых алкалоидов аконита байкальского //Бюл. эксперим. биол. и медицины. - 2012. - №6. - С.823-827.

7. Дыгай A.M., Жданов В.В., Гольдберг В.Е. и др. Методические указания по изучению гемостимулирующей активности фармакологических веществ // Ведомости научного центра экспертизы и государственного контроля лекарственных средств. - 2002. - №1(9). - С.29-32.

8. Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П. Методы культуры ткани в гематологии. - Томск: Изд-во ТГУ, 1992. - 272 с.

9. Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V., et al. Effect of Transplantation of Peripheral Blood Mononuclears Obtained Using Granulocytic Colony-Stimulating Factor and Hyalu-ronidase on Regeneration of Hemopoietic Tissue during Myelosuppression // Bulletin of Experimental Biology and Medicine. - 2009.- Vol.148. - №1. - P.120-125.

10. Dygai A.M., Zyuz'kov G.N., Zhdanov V.V., Udut E.V., Miroshnichenko L.A., Simanina E.V., Khrichkova T.Yu., Minakova M.Yu., Madonov P.G. Specific Activity of Electron-Beam Synthesis Immobilized Hyaluronidase on G-CSF Induced Mobilization of Bone Marrow Progenitor Cells // Stem Cell Reviews and Reports, 2013, (on line) (DOI) 10.1007 / sl2015-012-9423-2.

Таблица 1 Динамика костномозгового кроветворения у мышей линии BALBc после введения дистиллированной воды (1) и напеллина (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ½ МПД, (X±m) Сроки исследования, сутки Общее количество миелокариоцитов Незрелые нейтрофильные гранулоциты Зрелые нейтрофильные гранулоциты Эозинофильные гранулоциты Лимфоидные клетки Моноциты Эритроидные клетки фон 10,92±0,83 1,10±0,10 3,72±0,31 0,47±0,09 3,38±0,30 0,48±0,06 1,77±0,32 5-е 1 2,74±0,16∗ 0,04±0,01∗ 0,11±0,04∗ 0 1,87±0,15∗ 0,55±0,04 0,18±0,05∗ 2 2,50±0,16∗ 0,05±0,02∗ 0,16±0,03∗ 0 1,57±0,13∗ 0,60±0,11 0,13±0,03∗ 8-е 1 9,90±0,09 4,22±0,26∗ 1,45±0,26∗ 0,30±0,08 2,03±0,21∗ 0,86±0,08∗ 1,04±0,16 2 12,48±1,11# 6,82±0,46∗# 1,69±0,23∗ 0,07±0,07∗ 2,66±0,26 0,98±0,20∗ 1,27±0,28 12-е 1 13,20±0,57∗ 2,78±0,30∗ 7,71±0,37∗ 0,30±0,08 0,87±0,15∗ 0,96±0,08∗ 0,59±0,08∗ 2 13,75±0,86∗ 2,68±0,11∗ 9,76±0,16∗# 0,23±0,05 1,37±0,32∗ 1,01±0,13∗ 0,72±0,12∗ Примечание: ∗ - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Таблица 2 Общее количество лейкоцитов и их отдельных морфологических форм в периферической крови (г/л) у мышей линии BALBc после введения дистиллированной воды (1) и напеллина (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ½ МПД, (X±m) Сроки исследования, сутки Общее количество лейкоцитов Палочкоядерные нейтрофилы Сегментоядерные нейтрофилы Эозинофилы Моноциты Лимфоциты фон 10,08±0,70 0,01±0,01 1,27±0,23 0,02±0,02 0,78±0,10 8,00±0,78 5-е 1 10,63±0,81 0,01±0,01 0,33±0,05∗ 0 0,23±0,11∗ 10,06±0,84 2 12,25±1,22 0,10±0,04∗# 0,62±0,09# 0,02±0,02 0,32±0,08∗ 11,19±0,40∗ 8-е 1 14,21±1,29∗ 0,08±0,05 1,39±0,11 0,07±0,03 1,10±0,13 11,60±1,27∗ 2 9,46±0,90# 0,06±0,03 1,46±0,13 0,07±0,04 0,55±0,15# 7,31±0,78# 12-е 1 14,42±1,12∗ 0,17±0,04∗ 3,14±0,63∗ 0,04±0,03 1,26±0,31 9,80±0,35 2 12,67±0,81∗ 0,10±0,05 3,12±0,36 0 1,20±0,27 9,25±0,69 Примечание: ∗ - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Таблица 3 Динамика содержания КОЕ-ГМ (на 10⁵ неприлипающих миелокариоцитов) и КОЕ-Ф (на 2,5×10⁵ миелокариоцитов) в костном мозге мышей линии BALBc после введения дистиллированной воды (1) и напеллина (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ½ МПД, (X±m) Сроки исследования, сутки КОЕ-ГМ КОЕ-Ф Фон 4,50±0,62 9,00±0,73 5-е 1 2,33±0,21∗ 16,00±1,98∗ 2 15,00±1,46∗# 2,00±0,45∗# 8-е 1 0,50±0,34∗ 7,17±0,79 2 12,83±1,60∗# 9,17±2,01 12-е 1 8,67±1,41∗ 3,33±0,84∗ 2 1,83±0,65∗# 3,17±0,87∗ Примечание: ∗ - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Таблица 4 Колониестимулирующая (КСА) активность кондиционных сред прилипающих и неприлипающих миелокариоцитов и сыворотки крови мышей линии BALBc после введения дистиллированной воды (1) и напеллина (2) на фоне однократного введения 5-фторурацила в ½ МПД (X±m) Сроки исследования, сутки Прилипающие миелокариоциты Неприлипающие миелокариоциты Фон 2,00±0,52 1,67±0,61 5-е 1 0,67±0,21∗ 2,17±0,40∗ 2 1,33±0,33∗# 1,33±0,21∗# 8-е 1 0,50±0,22 3,33±0,42 2 2,83±0,21# 1,50±0,43 12-е 1 1,67±0,56 4,33±1,09∗ 2 1,50±0,34 6,50±0,85∗ Примечание: ∗ - различия достоверны по отношению к фону,
# - различия достоверны по отношению к группе, получавшей дистиллированную воду на фоне введения 5-фторурацила (1)

Предложено применение напеллина (гетероциклическое азотсодержащее соединение, его экстрагируют из растений рода Аконит семейства лютиковых) в качестве гемостимулирующего средства. Показано достижение заявленного назначения. Механизмом действия средства является активация гемопоэтических клеток-предшественников за счет прямого действия на них алкалоидов, а также в результате повышения функциональной активности мезенхимальных прогениторных элементов костного мозга и возрастания фидерной способности стромального компартмента гемопоэзиндуцирующего микроокружения. Предполагается возможность применение средства не только для высокоэффективной гемостимуляции, но также в качестве препарата для регенеративной медицины в целом. 4 табл.

Применение напеллина в качестве гемостимулирующего средства.