СПОСОБ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ СУБЪЕКТОВ, СТРАДАЮЩИХ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫМИ ОПУХОЛЯМИ Российский патент 2012 года по МПК A61N5/67 A61K31/02 A61K31/28 A61P35/00 

Изобретение относится к медицине и предназначено для фотодинамической терапии субъектов, страдающих злокачественными опухолями.

В последние годы отмечается повышенный интерес исследователей к экспериментально-клиническому изучению фотодинамической терапии (ФДТ), как перспективного направления в лечении злокачественных новообразований, а также ряда неонкологических заболеваний, в основе развития которых лежат процессы активного неоангиогенеза и пролиферации (Каплан М.А., 1992-2008, Миронов А.Ф., 1993-1996; Странадко Е.Ф., 1993-2008).

По современным представлениям механизмы действия ФДТ основаны на селективной аккумуляции введенных в организм фотосенсибилизирующих препаратов в клетках с повышенной митотической активностью (в опухолевых клетках, эндотелии новообразованных сосудов и др.). Последующее облучение патологического очага светом с длиной волны, соответствующей максимуму полосы поглощения введенного фотосенсибилизатора (ФС), индуцирует фотохимические реакции в сенсибилизированных клетках и тканях с выделением синглетного кислорода и свободных радикалов - высокоактивных биологических окислителей, что приводит к фототоксическому повреждению патологически измененных клеток (Jori G. et al., 1983; Kessel D., 1997). Кроме того, также имеет место деструкция эндотелия кровеносных сосудов в зоне лазерного облучения, в результате которой имеет место тромбоз сосудов и нарушение питания в опухоли.

Вышеуказанная избирательность действия определяет несомненные преимущества ФДТ для использования в медицине. Прежде всего это возможность достижения необходимого лечебного эффекта (облитерации неоваскулярной сети или радикального разрушения новообразования) при минимальном повреждении окружающих структур, имеющих важное значение для сохранения необходимых функций.

На сегодняшний день в медицине накоплен достаточный клинический опыт по эффективному применению ФДТ в лечении злокачественных новообразований (рака кожи, нижней губы, метастатических поражений кожи, рака молочной железы, в комбинированном лечении трахеобронхиального рака, рака пищевода, мочевого пузыря и др.), а также неопухолевых заболеваний.

Весомый вклад в развитие данного направления внесли российские ученые: М.А.Каплан (1993-2008), А.Ф.Миронов (1996-1998), Е.Ф.Странадко (1993-2008), М.Л.Гельфонд (2000-2008).

Появление ФС нового поколения, в частности препаратов хлоринового ряда «Фотодитазин», «Радахлорин» (Россия), «Фотолон» (Беларусь), обладающих высокой фотодинамической активностью при низкой кожной фототоксичности и быстрой элиминации из организма, а также совершенствование лазерной техники открывает перспективы широкого внедрения метода ФДТ в практику.

Однако метод ФДТ обладает рядом существенных недостатков, связанных с природой использующихся активных начал, в частности имеет место наличие длительной кожной фототоксичности, требующей строгого соблюдения пациентами ограничений светового режима, либо высокой общей токсичности самих препаратов (Будзинская М.В., Лихванцева В.Г., 2005; Kliman G.,1994; Puliafito C.A. et al., 2002).

Иллюстрацией вышеуказанного служит, например, способ проведения фотодинамической терпи у больных злокачественными опухолями, выбранный нами в качестве прототипа, при котором фотодинамическую терапию осуществляют путем введения ФС фотосенса в дозе 0,3-0,8 мг/кг веса тела с последующим воздействием на зону опухолевого роста лазерным облучением с плотностью энергии облучения 300-600 Дж/см². Особенность заявляемого способа лечения заключается в том, что фотодинамическую терапию проводят пролонгированно в течение 5-10 сеансов, с интервалом между сеансами 24 ч и фракционированием терапевтической дозы лазерного облучения, при этом плотность энергии облучения составляет 30-60 Дж/см² за каждый сеанс лечения, ФС вводят больному внутривенно однократно за 1-1,5 ч до проведения первого сеанса (патент РФ №2161053, 27.12.2000).

Однако, как видно из анализа данного способа, даже сложные ухищрения в виде фракционирования доз не позволяют преодолеть ограничения, накладываемые на использование фотосенсибилизаторов.

Вышеизложенное послужило основанием для проведения исследований по поиску методов, направленных на уменьшение побочных эффектов, присущих данной терапии, при сохранении ее эффективности.

На сегодняшний день большое распространение получили методы, основанные на использовании стволовых клеток.

Стволовые клетки обладают целым рядом характерных особенностей: они способны к самовозобновлению и к мультилинейной дифференцировке. Между стволовой клеткой и ее терминальным потомством обычно имеется несколько промежуточных клеток с возрастающей способностью к дифференцировке. Стволовые клетки недифференцированы и в большинстве тканей не способны выполнять специальные функции.

Первоначальные исследования концентрировались на гемопоэтических стволовых клетках костного мозга, и они сегодня достаточно хорошо изучены. Сейчас известно, что стволовые клетки существуют в большинстве органов. В органах они составляют незначительную популяцию, обычно 1-2% от общего числа клеток. До недавнего времени считали, что органоспецифичные стволовые клетки в дифференцировке ограничиваются своим происхождением. В последнее время доказано, что стволовые клетки могут обладать намного более широкими возможностями дифференцировки. Стволовые клетки стромы костного мозга могут дифференцироваться в мышечную, костную ткань, клетки печени, почки, кардиомиоциты и т.д. Это послужило толчком для лечения ряда заболеваний с использованием стволовых клеток, в частности клеток костного мозга (см., например, Смолянинов А.Б. и др. Клеточные технологии при ишемической болезни сердца. АГ-инфо, 2006, №2, с.6-15).

Также имеет место использование и другого свойства стволовых клеток - как метчиков процессов, связанных с активной пролиферацией. К стволовой клетке «цепляется» маркер и после этого отслеживается судьба данной клетки.

Эмульсии на основе ПФУ традиционно рассматриваются в качестве плазмозаменителей с газотранспортной функцией (Geyer R.P. Perfluorochemicals as oxygen transport vehicles // Biomater. Artif. Cells Artif. Organs., 1988, Vol.16, N1-3. P.455-457). Кроме того, перфторуглеродные наночастицы (НЧ) могут использоваться для визуализации тканей организма (магнитно-резонансная томография, рентгеноконтрастирование) (Winter P.M., Cai K., Caruthers S.D., Wickline S.A., Lanza G.M. // Expert Rev Med Devices. 2007 Mar; 4(2):137-145). В последнее время появились работы, в которых наночастицы ПФУ эмульсий используются как метчики стволовых клеток (Kathryn С. и др., ¹⁹F magnetic resonance imaging for stem/progenitor cell tracking with multiple unique perfluorocarbon nanobeacons, The FASEB Journal, 2007 June, vol.21, p.1647-1654). Мечение стволовых клеток перфторуглеродными наночастицами, которые легко детектируются с помощью магнитно-резонансной томографии, рентгена и газохроматографически, по предположению авторов вышеуказанной статьи, позволит отслеживать судьбу трансплантированных клеток в организме, используемых для активации роста сосудов в конечностях страдающих диабетом пациентов, восстановления сосудов, поврежденных при инфаркте или при проведении операции шунтирования, проведения мониторинга опухолей. Это позволит также наблюдать за динамикой лечения и оценивать его эффективность.

Кроме того, известно, что наночастицы ПФУ эмульсии, стабилизированные неиогенными поверхностно-активными веществами (ПАВ) (проксанолами, плюрониками и т.д.), обладают способностью сорбировать и прочно удерживать различные биологически активные вещества (Norman M.E., Williams Р., Illum L. / J. of Biomedical Materials Research, 1993, vol.27, р.861-866). Можно предположить, что сорбированные на частицах лекарственные вещества с частицами ПФУ эмульсий будут проникать внутрь стволовых клеток и транспортироваться с ними к органам и тканям.

Учитывая вышесказанное, нами было предложено при помощи наночастиц ПФУ эмульсий сорбировать лекарственный препарат - ФС на стволовых клетках костного мозга и с их помощью доставлять данный препарат в злокачественную опухоль с последующим проведением ФДТ.

Таким образом достигается адрессность воздействия и исключается наличие системных фототоксических поражений. Кроме того, нами неожиданно было установлено, что клетки, «нагруженные» ФС, сохраняют его в течение длительного времени.

С учетом вышеизложенного нами был предложен способ фотодинамической терапии у субъектов, страдающих злокачественными опухолями, включающий проведение фотодинамической терапии (ФДТ), при котором осуществляют следующие этапы:

а) проводят добавление ФС к эмульсии перфторуглеродов (ПФУ), включающей по крайней мере перфтордекалин и перфторметилциклогексилпипередин, стабилизированных раствором проксанола 268;

б) добавляют эмульсию ПФУ с ФС к стволовым клеткам костного мозга (СККМ) и проводят их совместное культивирование;

в) осуществляют введение СККМ после культивирования субъекту, страдающему злокачественными опухолями;

г) на зону опухолевого роста воздействуют световым облучением в дозе, достаточной для полного или частичного разрушения опухоли

При этом в качестве субъекта выступает млекопитающее, в частности человек.

Техническими результатами предлагаемого нами способа являются адрессность воздействия и исключение наличия системных фототоксических поражений. Кроме того, нами неожиданно было установлено, что клетки, «нагруженные» ФС, сохраняют его в течение длительного времени. Также в результате осуществления заявляемого способа достигается полный или частичный регресс опухоли.

Ниже данный способ подтверждается следующими примерами частного выполнения.

Пример 1. Первая фаза экспериментов.

Предварительно в результате проведенных нами исследований было показано, что клетки, «нагруженные» ФС, встраиваются тропную ткань и препарат при этом сохранят свою активность.

ПФУ эмульсия. В работе использовались наночастицы ПФУ эмульсии, состоящие из смеси перфторуглеродов: перфтордекалина и перфторметилциклогексилпипередина, в соотношении 9:1 об.%, стабилизированных 4% раствором проксанола 268.

Сорбция ФС на частицах ПФУ эмульсии. В качестве ФС использовали «Радахлорин», который представляет собой композицию из трех циклических тетрапирролов хлориновой природы (с гидрированным кольцом D), основной из которых - хлорин Е₆ (70,0-90,0%), обладает интенсивной полосой поглощения в длинноволновой части спектра, с пиком поглощения 662 нм, производится ООО «РАДА-ФАРМА» (Москва, Россия).

7 мг Радахлорина добавляли к 1 мл эмульсии ПФУ, встряхивали в течение 5 мин. Затем частицы эмульсии осаждали центрифугированием в течение 30 мин при 4000 об/мин, надосадочную жидкость сливали, осадок ресуспендировали в растворе Хенкса. Процедуру осаждения и отмывки наночастиц раствором Хенкса повторяли трижды.

Получение стволовых и прогениторных клеток. В качестве доноров стволовых и прогениторных клеток были использованы мыши линии C 57 black10 GFP, цитоплазма которых содержит белок, флюоресцирующий (зеленый цвет) под действие УФ-излучения. Клетки костного мозга выделяли из бедренной кости и культивировали в среде DMEM, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 5 мкг/л инсулина, 10 нМ дексаметазона, в течение 5 дней при 37°С.

Введение наночастиц с радахлорином в стволовые клетки. После 5 дней культивирования к клеткам костного мозга добавляли наночастицы, содержащие радахлорин, и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. После 5-кратной отмывки раствором Хенкса клетки снимали трипсином и трансплантировали реципиенту в/в и в/б в дозе от 2×10⁴ до 2×10⁷ клеток. Реципиентами являлись однородные по группе беспородные мыши, не содержащие GFP и содержащиеся в условиях вивария.

Через 3-7 дней после трансплантации животных забивали, извлекали костный мозг и готовили клеточную суспензию. Под микроскопом в УФ-диапазоне проводили поиск клеток, содержащих зеленый белок, и после обнаружения клетки облучали лазером (662 нм) мощностью 1 Дж/см² в течение 1 минуты. Затем в видимом свете проводили фотографирование облученной клетки в течение 3 минут с интервалом 15 секунд.

При проведении исследований в качестве источника светового излучения использовали полупроводниковый лазерный аппарат «ЛАМИ» с длиной волны лазерного излучения 662 нм, что соответствует максимуму спектрального поглощения используемых фотосенсибилизаторов мощностью излучения на конце световода 1,3 Вт, рег. номер 29/10020203/5212-03 (20.05.2003 г.) код ОКП 944420, класс II А.

В ходе работы было показано, что наночастицы ПФУ, содержащие ФС, проникают внутрь стволовых клеток костного мозга (фиг.1).

После облучения лазером образуются активные формы кислорода, которые вызывают разрушение мембраны клеток (фиг.2).

Также было показано, что поглощенные частицы остаются в цитоплазме клеток, сохраняя способность образовывать активные формы кислорода в течение всего времени культивирования (до 20 дней наблюдения).

Представленные результаты показывают, что наночастицы эмульсии ПФУ, при инкубации со стволовыми клетками, поглощаются ими. Стволовые клетки донора, содержащие наночастицы с сорбированным на них ФС и введенные внутривенно и внутрибрюшинно мышам с GFP-белоком, обнаруживаются в костном мозге реципиента. Это говорит о том, что клетки сохранили свою физиологическую активность. Как показали эксперименты, связанный с наночастицами радахлорин проникает внутрь стволовых клеток и также сохраняет свою активность длительное время (до 20 дней наблюдения). При обработке клеток, содержащих наначастицы с радахлорином, лазером мощностью 1 Дж/см² выделяются активные формы кислорода, что приводит к гибели клетки (фиг.2). В экспериментах также in vitro показано, что нагруженные свободными наночастицами и наночастицами с сорбированным радахлорином стволовые клетки по скорости деления, распластыванию на пластиковой подложке, образованию монослоя не отличались от контрольных. При введении в организм реципиета меченные GFP-белком клетки находили в костном мозге, печени и селезенке, что говорит об их свободной миграции. Что касается сорбированного на частицах эмульсии и включенного в клетку радахлорина, он в условиях культивирования (37°С) сохраняет свою активность (способность при облучении лазером выделять активные формы кислорода) до 20 дней культивирования клеток. В организме мы также наблюдаем активность препарата, включенного в клетку, достаточно длительное время (до 5-7 суток наблюдения). После обработки лазером клетка, содержащая наночастицы с радахлорином, погибает, в то время как находящиеся рядом контрольные клетки не реагируют на облучение.

На основе полученных данных становится очевидным возможность использования стволовых клеток для транспорта лекарственных веществ в организме.

Пример 2. Вторая фаза экспериментов.

Цель данной фазы заключалась в выяснении вопроса о том, имеет ли место накопление стволовых клеток с ФС в опухолевой ткани.

Приготовление ПФУ эмульсии, сорбцию ФС на частицах ПФУ эмульсии и получение стволовых клеток осуществляли способом, описанным в примере 1.

Введение наночастиц с радахлорином в стволовые клетки. После 5 дней культивирования к клеткам костного мозга добавляли наночастицы, содержащие радахлорин, и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. После 5-кратной отмывки раствором Хенкса клетки снимали трипсином и трансплантировали реципиенту в/в в дозе от 2×10⁴ до 2×10⁷ клеток. Реципиентами являлись мыши линии С 57 black, не содержащие GFP и содержащиеся в условиях вивария. У данных животных развивался спонтанный рак молочной железы.

Через 5 дней после трансплантации животных забивали, извлекали опухоль, печень, селезенку. Выделенные ткани подвергали газовой хроматографии в сочетании с масс-спектрометрией для количественного определения уровня фторуглеродов.

В результате проведенного исследования было показано (фиг.3), что ткань опухоли (105±25 мг) накапливает около 30% клеток, содержащих фторуглеродные частицы (32±5%) с ФС. При этом печень накапливает 8±3%, селезенка 5±2%. Масса самих животных составляла 28,5±4,2 г.

Введение стволовых клеток с ФС у здоровых беспородных мышей показало следующее распределение клеток: печень 7±2%, селезенка 6±2%, костный мозг 10±2%. Масса самих животных составляла 25,4±3,9 г.

Из проведенного исследования видно, что накопление стволовых клеток с ФС осуществляется прежде всего в активно растущей ткани - в опухоли. Эти данные согласуются с известными нам работами по распределению стволовых клеток в организме.

Пример 3. Третья фаза экспериментов.

Цель данной фазы заключалась в выяснении вопроса о том, имеет ли место повреждение опухоли за счет действия ФС при воздействии на нее лазерным излучением.

Приготовление ПФУ эмульсии, сорбцию ФС на частицах ПФУ эмульсии и получение стволовых клеток осуществляли способом, описанным в примере 1.

Введение наночастиц с радахлорином в стволовые клетки. После 5 дней культивирования к клеткам костного мозга добавляли наночастицы, содержащие радахлорин, и инкубировали в течение 30 минут при 37°С. После 5-кратной отмывки раствором Хенкса клетки снимали трипсином и трансплантировали реципиенту в/в в дозе от 2×10⁴ до 2×10⁷ клеток. Реципиентами являлись мыши линии С 57 black, не содержащие GFP и содержащиеся в условиях вивария. У данных животных развивался спонтанный рак молочной железы. Всего для эксперимента было взято 63 мыши.

Через 5 дней после трансплантации животных облучали контактным способом с помощью микролинзы на поверхность ткани в зоне опухоли. В качестве светового излучения использовали полупроводниковый лазерный аппарат «ЛАМИ» с длиной волны лазерного излучения 662 нм.

ФДТ осуществляли при следующих параметрах: плотность энергии лазерного излучения 200-300 Дж/см², плотность мощности 0,141-0,39 Вт/см². Продолжительность облучения (Т, мин) определяли по формуле: Т=E/P_s, где P_s - плотность мощности излучения (Вт/см²), Е - заданная величина плотности энергии (доза лазерного облучения).

P_s=Р_в/S, где Р_в - мощность лазерного излучения на выходе световода (Вт),

S - площадь светового пятна (см²). С целью облегчения расчетов использовали таблицу плотности мощности (P_s) в зависимости от выходной мощности на конце световода (Р_в) и размеров светового пятна. С целью измерения мощности лазерного излучения нами применялся дозировщик мощности ДИ-6А. Непосредственные, ближайшие и отдаленные результаты ФДТ оценивалась как:

- полный регресс - полное исчезновение опухоли;

- частичный регресс - уменьшение опухоли более чем на 50%;

- отсутствие эффекта - уменьшение опухоли менее чем на 50%, состояние без изменений или увеличение размеров опухоли.

Проведенные исследования показали полный регресс - 22% особей, частичный регресс - 46% особей, отсутствие эффекта - 32% особей.

Затем животные забивались и проводилось исследование гистологической картины опухолей. Гистологическая картина соответствовала результатам лечения

Таким образом, предлагаемый способ может быть широко применен в лечении как рака молочной железы, так и других видов злокачественных новообразований, для которых применимо использование ФДТ.

Изобретение относится к медицине, фотодинамической терапии опухолей. Проводят добавление фотосенсибилизатора (ФС), в частности радахлорина, к наночастицам эмульсии перфторуглеродов (ПФУ), состоящим из перфтордекалина и перфторметилциклогексилпиперидина, стабилизированных раствором проксанола 268. Добавляют эмульсию ПФУ с ФС к стволовым клеткам костного мозга (СККМ), в частности аутологичным. Проводят их совместное культивирование, после чего вводят СККМ субъекту, страдающему злокачественными опухолями, в частности раком молочной железы. На зону опухолевого роста воздействуют световым облучением в дозе, достаточной для полного или частичного разрушения опухоли. Субъектом может быть млекопитающее, в частности человек. Способ обеспечивает адресность воздействия, полный или частичный регресс опухоли, исключает системные фототоксические поражения. 5 з.п. ф-лы, 3 ил.

1. Способ фотодинамической терапии субъектов, страдающих злокачественными опухолями, включающий проведение фотодинамической терапии (ФДТ), отличающийся тем, что способ осуществляют следующим образом:
а) проводят добавление фотосенсибилизатора (ФС) к наночастицам эмульсии перфторуглеродов (ПФУ), состоящим из перфтордекалина и перфторметилциклогексилпиперидина, стабилизированных раствором проксанола 268;
б) добавляют эмульсию ПФУ с ФС к стволовым клеткам костного мозга (СККМ) и проводят их совместное культивирование;
в) осуществляют введение СККМ после культивирования субъекту, страдающему злокачественными опухолями;
г) на зону опухолевого роста воздействуют световым облучением в дозе, достаточной для полного или частичного разрушения опухоли.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве субъекта выступает млекопитающее.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в качестве млекопитающего выступает человек.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве ФС выступает радахлорин.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве злокачественной опухоли выступает рак молочной железы.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве СККМ выступают аутологичные СККМ.