СПОСОБ ЛАЗЕРНОЙ ВАКЦИНАЦИИ БОЛЬНЫХ С МЕТАСТАТИЧЕСКИМИ ФОРМАМИ РАКА Российский патент 2009 года по МПК A61K39/00 A61K41/00 A61P35/00 

Область техники

Изобретение относится к области биотехнологии, клинической иммунологии и онкологии.

Уровень техники

Известен способ иммунотерапии костномозговыми дендритными клетками (ДК) больных с солидными опухолями, заключающийся во внутрикожном введении после оперативного удаления опухолевого очага костномозговых ДК в дозе 3×10⁶ клеток/кг массы тела пациента, находящихся в 3,0 мл официнального 0,9%-ного физиологического раствора для инъекций и 0,6 мл раствора альбумина человека, в область опухоли и область регионарных лимфатических узлов в 12 точек по 0,3 мл. При этом 3 первые вакцинации проводят каждый 7-й день, а последующие - от 3-х до 12-ти каждый 21-й день [патент РФ №2203683, А61К 39/395, А61Р 35/00, заявл. 20.09.2001, опубл. 10.05.2003].

Способ позволяет активировать специфический иммунный ответ на проводимую иммунотерапию, однако эффективность его недостаточна, к тому же технология получения антигенпредставляющих клеток (АПК) из костномозговых предшественников является дорогой, технологически сложновыполнимой и весьма трудоемкой.

Известны способы вакцинации больных с использованием генно-модифицированных вакцин, получаемых путем введения генов в аутологичные или аллогенные опухолевые клетки, которые вызывают синтез белков, активирующих противоопухолевый иммунный ответ, и, в частности, белков теплового шока (БТШ). При этом из удаленной опухоли выделяют БТШ и вводят внутрикожно.

Известные способы вакцинации больных вакцинами на основе ДК и антигенов из аутологичных опухолевых клеток при диссеминированных опухолях после радикальной операции имеют низкую эффективность и пока являются только экспериментальным методом лечения [В.М.Моисеенко и др. Возможности вакцинотерапии меланомы кожи. - Практическая онкология, №4 (8), декабрь, 2001, с.58-64].

Известен способ лечения злокачественных опухолей с применением фотодинамической терапии при лечении онкологических заболеваний [патент РФ №2196623, A61N/067, заявл. 21.07.2000, опубл. 20.01.2003].

Способ заключается в нагреве зоны злокачественной опухоли, введении фотосенсибилизатора и проведении сеанса фотодинамической терапии и термотерапии. При этом до введения фотосенсибилизатора или во время его введения в зоне злокачественной опухоли проводят сеанс лазероиндукцированной термотерапии. Зону злокачественной опухоли прогревают до температуры 40-45°С, при этом нагрев осуществляется лазерным излучением со спектром излучения в ближней инфракрасной области оптического диапазона, отличного от спектра поглощения фотосенсибилизатора. Далее проводят сочетанные сеансы фотодинамической терапии и лазероиндукцированной терапии. Лечение таким способом повторяют с интервалом в 4-5 дней, как минимум, два раза.

Способ позволяет повысить эффективность лечения злокачественных новообразований при сокращении времени его проведения. Однако отсутствие дополнительной активации антигенпредставляющих клеток Лангерганса кожи снижает эффективность противоопухолевого иммунного ответа.

Известен способ иммунотерапии и иммунопрофилактики метастазирования, который заключается в послеоперационном воздействии на больного вакцинацией инкапсулированным противоопухолевым антигенным материалом с помощью полиакриламидной капсулы [патент РФ №2236868, А61К 39/39, А61К 47/30, А61К 48/00, заявл. 15.01.2003, опубл. 27.09.2004]. В качестве антигенного материала могут использоваться раковые клетки и, в частности, ксеногенные раковые клетки.

Недостатком предложенных решений является низкая эффективность противоопухолевого иммунного ответа.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому решению является способ лазерной вакцинации больных с метастатическими формами рака, включающий в качестве послеоперационного воздействия на поверхность кожи излучения СО₂ лазера на парах меди и введение в зоны образовавшегося инфильтрата культур опухолевых клеток, полученных из биопсийного материала больного [Г.А.Баранов, С.Б.Оникиенко, А.В.Земляной и др. Противоопухолевые вакцины in situ на основе лазерных технологий. Доклад на I Всероссийской конференции по биотерапии рака, М., 2002].

Недостатком известного способа является недостаточная эффективность противоопухолевого иммунного ответа.

Технический результат

Технический результат изобретения заключается в создании новой технологии иммунотерапии, в частности биотерапии рака с помощью вакцин с повышенной иммуногенностью.

Раскрытие изобретения

Для достижения указанного технического результата в способе лазерной вакцинации больных с метастатическими формами рака, включающем в качестве послеоперационного воздействия на поверхность кожи излучения СО₂ лазера на парах меди и введение в зоны образовавшегося инфильтрата культур опухолевых клеток, полученных из биопсийного материала больного, согласно предложению воздействие излучением СО₂ лазера производят на 4-6 участков кожи спины диаметром 5-15 мм, 1 раз в неделю, проводят 10-15 процедур на курс лечения для получения клеточного инфильтрата, содержащего повышенное число клеток Лангерганса, с последующим внутрикожным введением через 24-48 часов культур опухолевых клеток.

Авторами были получены терапевтические противоопухолевые вакцины, модифицированные на основе лазерных технологий. Концепция вакцины включает предактивацию антигенпредставляющих ЛК кожи и введение in situ целевых антигенов с повышенной иммуногенностью, получаемых из биоптатов пациента (аутовакцина), других больных с тем же заболеванием (гетеровакцина), культур клеток опухолей или эмбриональных тканей птиц и иглокожих (ксеновакцина).

Иммуногенность целевых антигенов повышали модификацией их импульсным лазерным излучением CO₂ лазера с длиной волны (λ) - 10 мкм и мощностью излучения (Р) - 0,5-1,0 кВт/см², воздействием на содержащую суспензию клеток капельную струю, а ЛК активировали воздействием на поверхность кожи высокоинтенсивного (Р>3 Вт/см²) излучения лазера на парах меди (λ=512 нм и λ=578 нм) или инфракрасного лазера (λ=830 нм). Введение модифицированных целевых антигенов in situ в зоны миграции АПК приводило к активации ЛК и специфического противоопухолевого иммунного ответа.

Первые исследования по лазерной вакцинотерапии при оперативном лечении больных колоректальным раком, раком желудка, поджелудочной железы и предстательной железы показали перспективность применения лазерных технологий для повышения неоадъювантной терапии рака.

Однако последующие исследования получили достаточное для заявки на изобретение развитие к 2005 году и были опубликованы в виде тезисов доклада на I Российско-Американской конференции «Биотехнология и онкология» [Сборник тезисов, МНТЦ, СПб, Россия, 29-31 мая 2005, с.51-52].

В заявляемом решении для создания вакцины используют антигенный материал с повышенной иммуногенностью, полученный путем модификации лучами CO₂ лазера или пучком электронов клеток опухоли (аутовакцина), антигены вводят in situ в кожу спины пациента в область клеточного инфильтрата, содержащего повышенное количество ЛК, которые мигрировали в зоны повышения концентрации белков теплового шока (БТШ) в коже in vivo, образование и секреция которых были вызваны воздействием на поверхность кожи лучами лазера на парах меди или инфракрасного лазера.

Длина волны излучения CO₂ лазера составляет 10 мкм, мощность излучения находится в пределах 0,5-1,0 кВт/см². В другом варианте модификацию клеток опухоли осуществляют широкоапертурным линейным ускорителем электронов, который функционирует в импульсном режиме, размер поля облучения - 270×270 мм, энергия электронов - 0,1-0,8 МэВ, предпочтительно 0,2 МэВ, поглощенная доза - 2-20 кГр, предпочтительно 5 кГр.

Активацию образования in vivo БТШ и последующую активацию in situ ЛК осуществляют импульсно-периодическим лазером на парах меди с одновременным излучением на двух длинах волн 510,6 нм и 578 нм с мощностью излучения, превышающей 3 Вт/см², и короткими импульсами 10-12 нс с пиковыми значениями мощности до 10-12 кВт/см² и частотой следования импульсов 5-15 кГц. Эта активация может быть осуществлена также излучением инфракрасного лазера с длиной волны 830 нм и плотностью мощности от 1,5 до 15 Вт/см², предпочтительно 5 Вт/см².

Противоопухолевая вакцина, составленная на основе ЛК кожи, предактивированных БТШ и антигенов, полученных из биоптатов пациента (аутовакцина), или других больных с тем же заболеванием (гетеровакцина), или культур клеток опухолей, или эмбриональных тканей птиц или иглокожих (ксеновакцина), иммуногенность которых повышена модификацией излучением СО₂ лазера или электронным пучком, применяется после удаления основной массы опухоли, антигены после их модификации вводятся внутрикожно в зоны образования клеточных инфильтратов, содержащих повышенное количество ЛК, которые были получены путем воздействия на участки поверхности кожи спины пациента лучей лазера на парах меди или инфракрасного лазера.

Лазерная вакцинация больных с метастатическими формами рака осуществляется после проведения условно-радикальной (циторедуктивной) хирургической операции путем воздействия на 4-6 участков кожи спины пациента диаметром 5-15 мм лучами лазера на парах меди для получения клеточного инфильтрата, содержащего повышенное число ЛК, процедуры проводят один раз в неделю, 10-15 процедур на курс лечения, с последующим через 24-48 ч после лазерного облучения кожи внутрикожным введением в области образования клеточного инфильтрата модифицированных опухолевых клеток.

Применение лазерной аутовакцины с антигенами из операционного материала IV стадии показало отсутствие признаков прогрессирования заболевания в течение одного года у 62% больных колоректальным раком (10 из 18), раком желудка (3 из 7), немелкоклеточным раком легкого (10 из 14), гипернефромой (4 из 5). Применение вакцины на основе дендритных клеток, полученных ex vivo у больных группы сравнения, показало отсутствие признаков прогрессирования заболевания в течение одного года у 71% больных (17 из 24 человек).

Однако финансовые и временные затраты, необходимые для получения вакцины ех vivo, превышают в 5-7 раз объем средств, необходимых для осуществления терапевтической вакцинации с использованием лазерных технологий in situ. Отмечалось увеличение средней продолжительности жизни в 1,6 раза в основной группе в сравнении с группой контроля. Это сопровождалось развитием специфического Т-клеточного иммунного ответа (по данным кожных тестов, реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ), связанного с активацией функциональной активности АПК.

Обоснование получения положительного клинического эффекта - импульсное воздействие лазерного излучения на каплю жидкости вызывает взрывное вскипание ее поверхностного слоя (0,5-1,0 мкм) и образование в ней ударных (сдвиговых) волн - светогидравлический эффект.

Ударная волна вызывает развертывание глобулярных структур белков и биомембран и выход гидрофобных участков на их наружную поверхность. Это приводит к изменению антигенного состава, «ксеногенизации» клеток. Перераспределение пептидов наружной поверхности клеток в иммуногенные кластеры способствует представлению целевых антигенов системе иммунного надзора организма с помощью АПК, стимуляции секреции цитокинов лимфоцитами, развитию противоопухолевого иммунного ответа.

Конформационные изменения фиксируются в результате взаимодействия с «активными» кластерными структурами воды, которые образуются из ее макромолекулы в результате разрыва «водородных» связей при воздействии ударной волны. Кластерные структуры воды взаимодействуют с гидрофобными участками мембран клеток и белков, что способствует возникновению их функционально активных межмолекулярных структур. Стабилизация конформационных перестроек макромолекул с помощью кластерных структур молекул воды способствует активации «участков связывания» и взаимодействию антител и антигенов, повышению их иммуногенности.

Другим механизмом лазерной модификации иммуногенности антигенов мембран клеток-мишеней является увеличение их поверхности за счет слияния клеток, их агрегации в «гигантские клетки». «Молекулярное сотрясение» мембранных структур клетки при взаимодействии с полем ударной волны при лазерном облучении способствует освобождению их от экранирующих блокирующих факторов (антител) и экспозиции целевого антигенного репертуара клеток-мишеней с последующим возникновением сенсибилизированных к целевым антигенам популяции цитотоксических Т-лимфоцитов. Блокирующие факторы препятствуют распознаванию целевых антигенов системой иммунного надзора.

Эксперименты показали, что активация образования in vivo белков теплового шока с последующей активацией in situ ЛК кожи позволяет повысить содержание ЛК в зоне облучения до 10 раз за счет фотоповреждения клеток кожи и выхода из них БТШ, эндогенных адъювантов и хемокинов. А введение антигенов с повышенной иммуногенностью in situ в зоны миграции ЛК в область клеточного инфильтрата вызывает активацию ЛК и специфического противоопухолевого иммунного ответа.

Излучение лазера на парах меди активирует секрецию БТШ, в частности БТШ-70, рецепторы к которым имеются на поверхности ЛК. Повышение уровня БТШ вызывает их миграцию в зону облучения кожи и активацию Т-клеточного иммунитета. Лазер на парах меди излучает одновременно в зеленом (510,6 нм) и желтом диапазонах (578 нм), импульсно-периодический характер его действия - образование коротких (10-20 нс) импульсов с высокими пиковыми значениями (10-12 кВт/см²) и большой частотой (5-15 кГц) создает возможность для селективного возбуждения метаболических структур, например рибофлавина, который является двухфотонным акцептором излучения лазера на парах меди. Энергия электронного возбуждения его молекулы трансформируется в работу цепи тканевого дыхания с образованием макроэргических соединений для трофического обеспечения функций клеток.

В течение 1998 - 2005 г. лазерная вакцинотерапия была проведена у 42 больных с метастатическими формами рака после проведения условно-радикальной хирургической операции. Основная группа включала больных с колоректальным раком - 18 человек, раком желудка - 7 человек, немелкоклеточным раком легкого - 14 человек, гипернефромой - 5 человек. Группа сравнения состояла из 24 больных с метастатическим колоректальным раком.

Лечение проводили следующим образом:

1) Воздействие на 5 участков поверхности кожи спины лучами лазера на парах меди с целью создания клеточного инфильтрата, содержащего повышенное количество ЛК, 1раз в неделю - 12 инъекций на курс.

2) Внутрикожное введение в зону клеточного инфильтрата (5 областей) через 24 часа лизата опухолевых клеток (культуры клеток, инактивированных гамма-лучами (200 кГр)), модифицированных излучением СО₂ лазера, 1 раз в неделю -12 инъекций на курс.

3) В качестве адъювантов использовали интерлейкин-2 в дозе 250-500 тыс.Ед.; или 0,05-1% раствор олигосахаридов, полученных из галактозо- и/или манозосодержащих полисахаридов путем воздействия на них излучения СО₂ лазера с энергией более 1,0 кВт/см² или пучка электронов в дозе более 100 кГр; или суспензию перфтордекалинов («Перфторан») 0,3-1,0 мл в каждую зону образования клеточного инфильтрата, 2 раза в неделю, 15-30 инъекций на курс лечения.

В группе сравнения вакцинацию осуществляли после введения in vitro (путем электропорации) целевых антигенов в ДК, полученные из моноцитов аутокрови, путем инкубации ex vivo в присутствии гранулоцит-макрофаг колонийстимулирующего фактора (GM-CSF) и интерлейкина-4 (IL-4). ДК культивировали 5 сут из прикрепившихся на пластик моноцитов, выделенных из 80-100 мл аутокрови в среде RPMI-1640 с добавлением 10% сыворотки IV гр.

Для индукции созревания ДК в среду добавляли: GM-CSF, 3000 Ед./мл, («Лейкомакс») и ИЛ-4 - 500 Ед./мл. На 5 день в ДК вводили целевой АГ с помощью электропорации. Истинные ДК имеют характерную морфологию, их маркеры - CD80, CD86, CD83. Количество ДК, необходимых для проведения одной инъекции, - 5×10⁶.

Лечение больных группы сравнения проводили следующим образом.

Вакцину на основе ДК вводили внутрикожно 1 раз в неделю, всего 12 инъекций. Использовали адъюванты аналогично их применению в основной группе. Проведено лечение у 24 больных вакциной на основе ДК и аутоантигенов из лизата клеток опухолей. Для определения эффективности иммунного ответа использовали результаты РТМЛ с опухолевыми антигенами, исследовали цитотоксическую активность натуральных киллеров, функциональную активность моноцитов, «кислородный взрыв» в нейтрофилах периферической крови, производили сцинцитиографию с мечеными лимфоцитами (Kasi L.P., Lamki L.M., Saranti S. et al. - Indium-111 labeled leukocytes in evaluation of active specific immunotherapy responses- Int. J. Gynecol. Cancer. 1995; vol.5, №3, p.226-232).

Использование в РТМЛ аутологичных опухолевых антигенов, модифицированных лазерным излучением, позволяет выявить лимфоциты, сенсибилизированные к антигенам опухоли, и определить эффективность вакцинотерапии. Модифицированные аутологичные антигены обладали наибольшей антигенностью. Адъюванты усиливали специфический иммунный ответ, который развивался через 3-5 недель после начала вакцинотерапии in situ. В определении эффективности иммунотерапии ключевую роль играли метаболические и функциональные показатели активности АПК и лимфоцитов - активность сукцинатдегидрогеназы (СДГ), лактатдегидрогеназы (ЛДГ), глутатионредуктазы (ГР), 6-фосфоглюконатдегидрогеназы (6-ФГДГ), тест с нитросиним тетразолем (НСТ), лизосомальный катионный тест (ЛКТ), секреторная активность моноцитов.

Стойкое снижение цитотоксичности и числа натуральных киллеров, функционально-метаболических показателей АПК и лимфоцитов, секреторной активности моноцитов, значительное снижение активности ГР, 6-ФГДГ указывают на отсутствие эффективности проводимой терапии и нарастание вторичной иммуносупрессии.

Полученные данные свидетельствуют о перспективности использования терапевтических вакцин in situ на основе лазерных технологий и использования пучков электронов в иммунопрофилактике рецидивов рака после проведения условно-радикального (циторедуктивного) хирургического лечения, а также о том, что иммунотерапия рака может быть эффективна только при ее сочетании с хирургическим удалением основной массы опухоли. У больных с распространенными формами онкопатологии это позволяет в ряде случаев увеличить продолжительность жизни в 1,6-3 раза и улучшить ее качество, затормозить прогрессирование заболевания и возникновение рецидивов опухолей.

Клинический пример. Больной Т., 1945 г.р. В сентябре 2003 г. диагностирован рак левой почки с метастатическими очагами в легких.

Компьютерная томография (ноябрь, 2003) - новообразование левой почки, размеры образования составляют 10,8×7,9×15 см. Определяются лимфатические узлы парааортальной группы на уровне ворот почек диаметром 6-8 мм, в легочной ткани определяются множественные округлые образования диаметром до 15 мм, выявляются лимфатические узлы бронхопульмональной группы слева диаметром до 15 мм и трахеобронхиальной группы диаметром 12 мм.

В декабре 2003 г. произведена операция - левосторонняя нефрэктомия. Гистология - светлоклеточный рак почки.

Из биопсийного материала получена культура опухолевых клеток, которые были обработаны пучком электронов энергией 0,2 МэВ, с поглощенной дозой 2 кГр, суспензия опухолевых клеток (3 млн/мл) была подвергнута воздействию СО₂ лазера мощностью 1 кВт/см², экспозицией 5 мс.

Производили облучение 5-ти участков кожи спины диаметром 10 мм лазером с активными средами на парах меди одновременным излучением на двух длинах волн 510,6 нм и 578,0 нм с мощностью излучения 3,5 Вт/см², импульсами продолжительностью 10 нс с пиковыми значениями мощности до 12 кВт/см² и частотой импульсов 10 кГц.

Через 24 часа после облучения в область клеточного инфильтрата в зоне облучения внутрикожно вводили суспензию опухолевых клеток, инактивированных пучком электронов и модифицированных излучением CO₂ лазера, в 1 мл физиологического раствора в количестве 3 млн клеток. Процедуры лазерной вакцинации проводили 1 раз в неделю, а именно 12 процедур на курс лечения.

Критерии эффективности вакцинации - формирование клеточной реакции гиперчувствительности замедленного типа (подобно реакции Манту).

У больного Т. формирование целевого иммунного ответа развилось после 4 процедуры - на пятой неделе вакцинации. Лабораторные критерии эффективности вакцинации - формирование положительной реакции торможения миграции лейкоцитов (РТМЛ) с антигеном из аутовакцины. Положительная РТМЛ с модифицированным опухолевым антигеном зарегистрирована у больного Т. через 6 недель после начала курса вакцинотерапии. В течение 3,5 лет у больного не выявлено признаков рецидива и прогрессирования заболевания. В легких лимфаденопатии нет.

При контрольной КТ легких выявлен один метастаз диаметром до 1,5 см (в 2003 г. было более 5 метастазов). При лабораторном исследовании 21.11.2006: увеличение содержания активированных Т-лимфоцитов (CD25), циркулирующих Т-хелперов (CD4), цитотоксических Т-клеток (CD8), натуральных киллеров (CD 16), функциональной активности лимфоцитов и нейтрофилов характеризует наличие активного иммунного ответа.

Изобретение относится к области медицины и касается способа лазерной вакцинации больных с метастатическими формами рака. Изобретение включает послеоперационное воздействие на 4-6 участков кожи диаметром 5-15 мм излучения лазера на парах меди, 1 раз в неделю, проведением 10-15 процедур на курс лечения и введение в зоны образовавшегося инфильтрата, содержащего повышенное число клеток Лангерганса, культур опухолевых клеток, полученных из биопсийного материала больного. Преимущество изобретения заключается в снижении метастазов.

Способ лазерной вакцинации больных с метастатическими формами рака, включающий в качестве послеоперационного воздействия на поверхность кожи излучения лазера на парах меди и введения в зоны образовавшегося инфильтрата культур опухолевых клеток, полученных из биопсийного материала больного, модифицированных излучением СО₂-лазера, отличающийся тем, что воздействие излучением лазера на парах меди производят на 4-6 участков кожи диаметром 5-15 мм, 1 раз в неделю, проведением 10-15 процедур на курс лечения для получения клеточного инфильтрата, содержащего повышенное число клеток Лангерсанса, с последующим внутрикожным введением через 24-48 ч культур опухолевых клеток, инактивированных гамма-лучами, модифицированных излучением СО₂-лазера.