СПОСОБ ОБЛУЧЕНИЯ УЛЬТРАФИОЛЕТОВЫМ СВЕТОМ КОНЦЕНТРАТОВ ТРОМБОЦИТОВ В ГИБКИХ КОНТЕЙНЕРАХ Российский патент 2012 года по МПК A61L2/00 A61M1/36 

Предметом изобретения является способ инактивации патогенных организмов, таких как бактерии и вирусы, и/или лейкоцитов в концентратах тромбоцитов (КТ) посредством облучения их ультрафиолетовым излучением.

Известно, что терапевтическое применение препаратов крови таит в себе риск того, что реципиенты препарата крови будут инфицированы вирусами и бактериями. Можно назвать, например, вирусы гепатита В (HBV) и гепатита С (HCV), а также возбудители СПИДа ВИЧ-1 и ВИЧ-2. Риск возникает в том случае, если при приготовлении препарата не проводится этап инактивации или удаления вышеуказанных патогенных организмов.

Ультрафиолетовое (УФ) излучение дифференцируется в зависимости от длины волны. В контексте данной заявки используется следующее определение: УФ-А диапазон - длина волны от 400 до 320 нм, УФ-В диапазон - длина волны от 320 до 280 нм и УФ-С диапазон - от 280 до 200 нм. Известно, что посредством облучения коротковолновым ультрафиолетовым (УФ-) излучением, то есть в диапазоне длин волн менее примерно 320 нм (УФ-В и УФ-С диапазоны), можно инактивировать как вирусы, так и бактерии, причем как в плазме крови, так и в препаратах клеток крови. При длине волны более 320 нм энергия излучения слишком мала для того, чтобы инактивировать микроорганизмы и вирусы. По сравнению с химическими, фотохимическими и фотодинамическими способами инактивации патогенных организмов, облучение УФ-излучением обладает, прежде всего, тем преимуществом, что оно эффективно само по себе и не требует добавления химически активных или фотоактивных веществ.

Такие добавки, продукты их расщепления или фотопродукты часто требуют последующего удаления, так как они токсичны или мутагенны. Кроме того, они могут способствовать появлению в обработанном препарате неоантигенных структур при связывании с белками плазмы и поверхностями клеток. Как правило, такие добавки невозможно полностью удалить, или, по меньшей мере, их удаление требует дополнительных затрат. Такие дополнительные этапы работы могут также снижать качество стерилизованного препарата. Наиболее эффективным в отношении прямой инактивации патогенных организмов является УФ-С диапазон. Тем не менее, излучение этого диапазона обладает недостатком, состоящим в том, что оно проникает в растворы, содержащие белки, такие как плазма крови, или в мутные суспензии (например - в КТ) лишь на очень небольшую глубину.

Во время второй мировой войны и в течение непродолжительного времени после нее УФ-С излучение использовали для стерилизации плазмы крови и растворов альбуминов, прежде всего - с целью инактивации вирусов гепатита. Тогда использовали способ, при котором раствор в проточной аппаратуре пропускали перед источником УФ-С излучения в виде тонкой пленки. Способ показал себя как недостаточно безопасный, и от него отказались (Kallenbach N.R., Cornelius P.A., Negus D. et al. Inactivation of viruses by ultraviolet light. Curr Stud Hematol Blood Transfus 1989, 56, 70-82).

В настоящее время для стерилизации препаратов белков плазмы используют усовершенствованные способы, работающие по тому же принципу. Во всех случаях речь шла или идет об обработке больших объемов, то есть пулов плазмы или растворов белков объемом до нескольких сотен литров и более (Hart Н., Reid К., Hart W. Inactivation of viruses during ultraviolet light treatment of human intravenous immunoglobulin and albumin. Vox Sang 1993; 64(2):82-8; и Chin S., Williams В., Gottlieb P. et al. Virucidal short wavelength ultraviolet light treatment of plasma and factor VIII concentrate: protection of proteins by antioxidants; Blood 1995; 86(11): 4331-6).

Для стерилизации множества отдельных доз КТ, полученных от доноров крови или посредством механического (машинного) афереза - с объемами до нескольких сотен мл - вышеуказанные проточные аппараты непригодны. Однако именно это необходимо в повседневной практике банков крови.

УФ-В излучение также является микробиоцидным и вируцидным, но не в такой степени, как УФ-С. Оно проникает в белоксодержащие растворы и мутные суспензии немного лучше, чем УФ-С, тем не менее глубина его проникновения, например, в плазму или КТ также остается в пределах нескольких миллиметров. Предпринимались попытки использовать облучение УФ-В для инактивации в КТ Т-лимфоцитов, которые значительно чувствительнее к УФ-излучению, чем вирусы или бактерии. За счет этого должна была быть предотвращена аллоиммунизация реципиентов препаратов против чужеродных HLA-антигенов, которая может привести к тому, что реципиенты станут устойчивыми к дальнейшим переливаниям КТ (Andreu G., Boccacio С, Lecrubier С.et al. Ultraviolet irradiation of platelet concentrates: feasibility in transfusion practice. Transfusion 1990; 30(5): 401-6, и Pamphilon D.H. The rationale and use of platelet concentrates irradiated with ultraviolet-B light. Transfus Med Rev 1999; 13(4):323-33).

Также было описано, что вирусы в суспензиях тромбоцитов могут быть инактивированы посредством облучения монохроматическим УФ-В излучением (длина волны 308 нм). Для этого был использован эксимерный лазер; объем пробы составлял несколько мл (Prodouz K.N., Fratantoni J.C., Boone R.F. Use of laser-UV for inactivation of virus in blood products. Blood 1987; 70(2):589-92). За пределы этого масштаба в данной работе явно не выходили. Фактически из литературы не известно способа, с помощью которого можно дезактивировать вирусы или бактерии в полнообъемных КТ исключительно посредством облучения УФ-излучением (т.е. УФ-В или УФ-С).

КТ получают посредством машинного тромбафереза от отдельных доноров или выделяют из донорских порций крови, при этом объединяют в единый пул тромбоциты из нескольких донорских порций крови (обычно из 4-6 порций). Объем КТ, которые можно получить таким образом, обычно лежит в диапазоне от примерно 200 до 350 мл. Однако КТ получают и из отдельных донорских порций крови, объем которых соответственно меньше (между примерно 40 и 80 мл). Как в объединенных КТ, так и в КТ, полученных посредством афереза, тромбоциты суспендированы либо в плазме крови, либо в специальных средах для хранения с остаточным содержанием плазмы от примерно 30% до 40%. КТ хранят в плоских газопроницаемых пластиковых пакетах при температуре 20-24°С.

Было бы желательно стерилизовать КТ в таких пакетах УФ-излучением. Однако при этом сохраняется вышеупомянутая проблема, состоящая в том, что препараты почти непроницаемы для УФ-излучения. Это должно стать понятным из следующего расчетного примера: если предположить, что для стерилизации используется УФ-В излучение, и принять, что объем КТ равен примерно 300 мл, глубина проникновения УФ-В излучения равна примерно 1 мм, а облучение производится с обеих сторон пакета, то подходящий пакет для облучения должен иметь площадь поверхности не менее 1500 см².

Представляется сложным, если вообще возможным, рутинно обрабатывать большие количества пакетов такого размера. Проблема еще увеличивается, если желательно стерилизовать КТ УФ-С излучением, а не УФ-В излучением, так как глубина его проникновения гораздо меньше.

Неожиданно было обнаружено, что вышеуказанная проблема решается посредством использования способа инактивации патогенных микоорганизмов и(или) лейкоцитов в концентратах тромбоцитов (КТ), включающего в себя следующие этапы:

- приготовление КТ из донорской крови и(или) посредством механического афереза;

- обработку КТ посредством облучения ультрафиолетовым излучением (УФ-излучением),

- при этом КТ состоят из множества доз, предназначенных для отдельного пользования и хранящихся раздельно; и

- каждая доза КТ находится в гибком, проницаемом для УФ-излучения, плоском пакете для облучения,

- пакет для облучения заполнен менее чем на 30% от максимальной емкости пакета для облучения, и

- пакет для облучения во время облучения УФ-излучением приводят в движение, так что содержимое пакета для облучения циркулирует, и во время движения образуются зоны с переменной толщиной слоев, причем используемое УФ-излучение является УФ-С излучением с длиной волны от 200 нм до 280 нм.

Указанный способ применим преимущественно в отношении патогенных микроорганизмов, являющихся вирусами и(или) бактериями.

В указанном способе во время движения в облучаемой зоне время от времени возникают области, которые имеют толщину слоя менее 1 мм.

Движение, в частности амплитуду движения, выбирают таким образом, что внутри КТ время от времени возникают облучаемые области, которые имеют толщину слоя менее 0,5 мм.

Целесообразно, когда в указанном способе пакеты для облучения имеют нижнюю сторону и верхнюю сторону, и сумма площадей нижней и верхней сторон, которые контактируют или могут контактировать с содержимым пакета, составляет более 90 процентов, предпочтительно более 99 процентов от общей площади поверхности содержимого пакета.

В одном из вариантов воплощения указанного способа излучение УФ-С состоит исключительно из излучения с длинами волн от 200 нм до менее чем 280 нм.

Согласно указанному способу каждая доза предпочтительно состоит из образцов, полученных максимум от 8 доноров, более предпочтительно максимум от 6 доноров, еще более предпочтительно каждая доза происходит от одного донора.

Предпочтительно, когда КТ содержит не менее 1×10⁸ тромбоцитов в мл, более предпочтительно не менее 5×10⁸ тромбоцитов в мл.

В одном из воплощений в указанном способе дополнительно осуществляют облучение УФ-В излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,3 до 5 Дж/см², предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 2,5 Дж/см².

Целесообразно, когда в указанном способе облучение осуществляется УФ-С излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,01 до 2 Дж/см², предпочтительно в диапазоне от 0,1 до 1 Дж/см².

Согласно одному из воплощения указанного способа, КТ содержат плазму и, возможно, подходящую среду для хранения, причем содержание плазмы предпочтительно составляет более 20 весовых %, предпочтительно 30-40%.

Возможно, КТ содержат забуференную водную среду для хранения.

Предпочтительно, когда согласно предложенному способу инактивируются вирусы, бактерии и/или лейкоциты, а функция тромбоцитов по существу остается неизмененной.

Целесообразно, когда пакеты для облучения имеют объем до 5000 мл.

Целесообразно, когда пакеты для облучения подвижно закреплены в аппаратуре, в которой они перемещаются и облучаются, в частности они не зажаты между двумя плоскостями, например пластинами из проницаемых для УФ-излучения стекла или пластмассы.

Целесообразно, когда во время как минимум трех четвертей всего времени облучения пакеты для облучения находятся в движении.

Пакеты для облучения могут приводиться в движение посредством встряхивания, раскачивания или вращения.

Целесообразно, когда встряхивание осуществляют с помощью орбитального встряхивателя, платформенного встряхивателя, вертикально качающегося встряхивателя или встряхивателя, качающегося в горизонтальной плоскости.

Целесообразно, когда пакеты для облучения укладывают на одну из боковых сторон, так что во время и в результате движения или встряхивания высота пакетов для облучения, выражаемая как расстояние вдоль перпендикуляра к поверхностям между поверхностью, на которую уложены пакеты для облучения, и наивысшей точкой пересечения с верхней поверхностью пакета для облучения по всей верхней поверхности пакета для облучения, контактирующей с содержимым пакета, постоянно изменяется.

Целесообразно, когда пакеты для облучения имеют среднюю высоту наполнения, равную 10 мм, предпочтительно 5 мм, и в результате движения в них постоянно возникают волны с впадинами, где толщина слоя составляет менее половины от средней высоты наполнения, предпочтительно толщина слоя составляет менее 1 мм или даже менее 0,1 мм.

Целесообразно, когда пакеты для облучения во время облучения постоянно приводятся в движение с амплитудой в диапазоне от 0,2 до 8 см как минимум по оси «х» и при желании по оси «y» (ось «y» перпендикулярна оси «х»), и независимо от этого частота изменения направления колебательного движения составляет от 0,5 до 10 Гц.

Целесообразно, когда пакеты для облучения во время облучения заполнены не более чем на 20% от максимальной емкости пакета.

Согласно настоящему изобретению КТ в пакетах для облучения приводят в движение подходящим способом. При этом приведение в движение осуществляется настолько энергично, что внутри КТ образуются локальные слои, настолько тонкие, что сквозь них может проникать УФ-излучение. Одновременно движение должно быть таким, чтобы КТ-суспензии эффективно перемешивались в пакетах. Оба этих условия можно осуществить при наличии следующих предпосылок:

1. Пакеты для облучения являются очень гибкими, и во время облучения их не фиксируют, например не зажимают между кварцевыми пластинками. Поэтому они приспосабливаются к любому изменению формы КТ-суспензии, которое возникает во время движения пакета.

2. Движение пакета осуществляется либо по горизонтали (линейно возвратно-поступательно, по круговой или эллипсоидальной траектории), либо по вертикали (раскачивание).

3. Пакеты для облучения заполнены не более чем на 30%, предпочтительно не более чем на 20% от максимального объема заполнения.

В любом случае изменение направления движения на противоположное должно происходить настолько резко, чтобы большая часть КТ-суспензии вследствие своей инерции продолжала двигаться в первоначальном направлении, а отставшая часть могла образовать тонкий слой, проницаемый для УФ-излучения. В сочетании с постоянным перемешиванием за счет движения пакета во время облучения в конечном итоге весь КТ (и содержащиеся в нем вирусы и/или бактерии) подвергается воздействию УФ-излучения. За счет этого КТ стерилизуются.

Пакеты для облучения изготовлены из полимерного материала, прозрачного для УФ-излучения. Подходящими полимерными материалам являются, например, этиленвинилацетат и полиолефины с толщиной пленки от 1 мм и менее, предпочтительно с толщиной пленки менее 0,5 мм. Пакеты для облучения являются плоскими и предпочтительно не имеют максимумов поглощения в диапазоне длин волн от 200 до 320 нм. Пакеты для облучения в лежачем заполненном состоянии имеют толщину, равную всего нескольким миллиметрам, например толщину менее 10 мм и, в частности, менее 5 мм, предпочтительно менее 3 мм, и предназначены для того, чтобы вмещать объем проб, например, до 200 или до 300 мл. Однако максимальная вместимость (объем) пакета для облучения по меньшей мере в 3 раза больше, как правило, в 5 раз больше, предпочтительно по меньшей мере в 10 или даже 20 раз больше, чем фактический содержащийся в нем объем пробы, подлежащей обработке.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Описанные ниже опыты иллюстрируют эффективность способа и не ограничены инактивацией указанных ниже бактерий и/или вирусов. Также нет ограничения в виде КТ от «случайных доноров», которые были использованы в описанных опытах, и способ согласно настоящему изобретению применим также к препаратам тромбоцитов, полученным посредством афереза. Все опыты были проведены от трех до шести раз. Приведенные результаты представляют собой средние значения ± стандартные отклонения.

Концентраты тромбоцитов

КТ были получены из пулов, каждый из которых содержал по 5 светлых слоев кровяного сгустка, которые, в свою очередь, были получены из регулярных донорских порций крови. КТ имели объем от примерно 300 до 350 мл; концентрация тромбоцитов составляла примерно 10⁹/мл. Тромбоциты были суспендированы в среде для хранения тромбоцитов SSP+(продукция фирмы MacoPharma). Остаточное содержание плазмы составляло примерно 30-40%.

Бактериологические исследования

В опытах по инактивации были использованы следующие штаммы бактерий:

Staphylococcus (S.) epidermis

Sraphylococcus (S.) aureus

Bacillus (B.) cereus

Klebsiella (K.) pneumoniae.

Концентрации бактерий определяли посредством анализа с образованием колоний и выражали как число колониеобразующих единиц (КОЕ)/мл. В опытах по инактивации бактерий полнообъемные КТ или аликвоты КТ заражали бактериями определенного вида до концентрации от 10⁴ до 10⁵ КОЕ/мл, после чего облучали их УФ-излучением.

Вирусологические исследования

Аликвоты КТ заражали вирусом герпеса свиней (SHV-1, вирус ложного бешенства, штамм Ауески) или вирусом везикулярного стоматита (VSV, штамм Индиана). Титры вирусов определяли посредством CPE-анализа (СРЕ = цитопатический эффект). Их выражали в виде TCID₅₀ (TCID = инфицирующая доза для культур тканей). Индикаторными клетками служили Vero-клетки (клетки почки зеленой мартышки). Начальная концентрация вируса в проведенных опытах составляла примерно 10⁵-10⁷ TCID₅₀.

Установки для облучения

Одна из двух использованных установок для облучения была оборудована трубками, которые испускали УФ-В излучение. Облучение осуществлялось с обеих сторон помещенного в установку пакета для облучения, то есть сверху и снизу. Установка для облучения была снабжена встряхивающим механизмом, который обеспечивал возвратно-поступательное движение по горизонтали с частотой 60 изменений направления движения в минуту. Вторая установка для облучения также была оборудована трубками, которые испускали УФ-В излучение. Облучение также осуществлялось с обеих сторон. Третья установка (такой же конструкции, как вторая) была оборудована трубками, испускавшими УФ-С излучение (длина волны: 254 нм). Обе установки могли быть дополнены 2 различными встряхивающими механизмами: горизонтальным встряхивателем, который осуществлял эллипсоидные возвратно-поступательные движения, и качающимся встряхивателем.

Пакет для облучения

Использованные пакеты для облучения состояли из этилвинилацетата (EVA), который проницаем для УФ-излучения. Были использованы пакеты двух размеров:

1. 14,5×18,5 см (площадь наружной поверхности примерно 268 см²),

2. 22,5×38 см (площадь наружной поверхности примерно 855 см²).

В опытах с малыми EVA-пакетами объем пробы составлял 80 мл, в опытах с большими пакетами - примерно 300-350 мл (обрабатывали полнообъемные КТ).

Пример эксперимента 1:

Инактивация S.epidermidis УФ-В со свободным движением суспензии тромбоцитов во время встряхивания и без свободного движения

В данном опыте объем пробы составлял 80 мл. Свободную подвижность суспензии тромбоцитов в пробе во время встряхивания и образование тонкого слоя устраняли в пробе за счет того, что пакет для облучения прочно зажимали между двумя кварцевыми пластинами. Результирующая толщина слоя составляла примерно 3 мм. При обработке второй пробы расстояние между кварцевыми пластинами увеличивали так, что суспензия тромбоцитов во время встряхивания могла свободно двигаться. Обе пробы облучали дозой излучения, равной 1 Дж/см².

Как показывает Таблица 1, титр бактерий в зафиксированной пробе снижался примерно на 2 log₁₀, в свободно размещенной - более чем на 4 log₁₀.

Таблица 1 Обозначение пробы Титр бактерий (loq₁₀ KOE/мл) Необработанный контроль 4,1±0,03 Прочно зафиксированная проба 1,4±1,29 Свободно размещенная проба -0,40±0,35

Пример эксперимента 2:

Инактивация S.epidermidis УФ-В в полнообъемных КТ в свободно или жестко зафиксированном пакете для облучения при встряхивании

Объем КТ в данном эксперименте составлял 330 мл, средняя толщина слоя в больших EVA-пакетах - соответственно, примерно 3,9 мм. КТ облучали тремя дозами УФ-В (0,8, 1,0 и 1,2 Дж/см²) при следующих условиях:

1. без встряхивания, пакет свободно размещен между кварцевыми пластинами;

2. с встряхиванием, пакет зажат между кварцевыми пластинами.

Как показывают результаты опытов (Таблица 2), в КТ, плотно зафиксированных во время встряхивания, в результате облучения УФ-В излучением титр бактерий снижался примерно на 2 log₁₀, тогда как в свободно размещенных пробах - от примерно 3,4 до более чем 4 log₁₀, в зависимости от дозы.

Таблица 2 Размещение пробы Доза УФ-В (Дж/см²) Титр бактерий (log₁₀ KOE/мл) Встряхивание, прочно зафиксированная проба 0 4,11±0,00 Встряхивание, прочно зафиксированная проба 0,8 2,14±0,48 Встряхивание, прочно зафиксированная проба 1.0 1,95±0,03 Встряхивание, прочно зафиксированная проба 1,2 1,99±0,03 Встряхивание, свободно размещенная проба 0 4,19±0,11 Встряхивание, свободно размещенная проба 0,8 0,77±0,69 Встряхивание, свободно размещенная проба 1,0 -0,14±0,05 Встряхивание, свободно размещенная проба 1,2 -0,40±0,05

Пример эксперимента 3:

Инактивация других бактерий в свободно подвижных или жестко зафиксированных аликвотах КТ посредством облучения УФ-В

Из обоих первых примеров следует, что S.epidermidis эффективно инактивируется в КТ при условии, что суспензия КТ во время облучения УФ-излучением может свободно перемещаться. В описанном ниже опыте были исследованы следующие дополнительные штаммы бактерий: S.aureus, В.cereus и К.pneumoniae.

Условия были такими же, как описанные в Примере эксперимента 1. Во всех трех случаях был получен тот же результат, что и в случае S.epidermidis: в свободно размещенных пробах КТ бактерии были инактивированы примерно на 3,9-4,25 log₁₀, тогда как в прочно зафиксированных пробах титры были снижены лишь примерно на 2-3,4 log₁₀ (Таблица 3).

Таблица 3 Штамм бактерий Обозначение пробы Титр бактерий (log₁₀ КОЕ/мл) S.aureus Необработанный контроль 4,88±0,00 S.aureus Прочно зафиксированная проба, встряхивание 1,49±1,30

S.aureus Свободно размещенная проба, встряхивание 0,97±0,86 В.cereus Необработанный контроль 4,99±0,09 В.cereus Прочно зафиксированная проба, встряхивание 2,99±0,13 В.cereus Свободно размещенная проба, встряхивание 0,74±0,68 К.pneumoniae Необработанный контроль 4,94±0,08 К.pneumoniae Прочно зафиксированная проба, встряхивание 2,34±0,24 К.pneumoniae Свободно размещенная проба, встряхивание 1,00±0,89

Пример эксперимента 4:

Инактивация S.epidermidis в аликвотах КТ посредством облучения УФ-В в различных условиях встряхивания

Было исследовано, будет ли повышаться инактивация S.epidermidis в свободно размещенных аликвотах КТ и в тех случаях, когда будут использованы встряхиватели, отличающиеся от использованного в экспериментах 1-3 горизонтального встряхивателя, который, как уже было упомянуто, совершает возвратно-поступательные движения. В последующих экспериментах был использован орбитальный встряхиватель, который осуществлял круговое движение (радиус: 3 см, число оборотов: 50/мин), затем - качалка, совершавшая 50 движений вверх и вниз в минуту. И в этом случае одну из двух проб (80 мл) прочно зажимали между кварцевыми пластинами, а другую размещали свободно. Как видно из результатов, приведенных в Таблице 4, в этом случае уровень инактивации бактерий в случае свободно размещенных проб был на 3-4 log₁₀ выше, чем в случае прочно зафиксированных проб.

Таблица 4 Встряхиватель Обозначение пробы Титр бактерий (log₁₀ KOE/мл) --- Необработанный контроль 4,94±0,16 Орбитальный Прочно зафиксированная проба 4,23±0,00 Орбитальный Свободно размещенная 0,50±0,39

  проба   Качалка Прочно зафиксированная проба 4,02±0,17 Качалка Свободно размещенная проба 0,87±0,78

Пример эксперимента 5:

Инактивация вируса герпеса свиней посредством облучения УФ-В без свободного движения КТ-аликвот или при свободном движении в процессе встряхивания

Для того чтобы проверить, относится ли повышение уровня инактивации патогенных микроорганизмов в КТ, не зафиксированных во время облучения УФ-излучением, не только к бактериям, но и к вирусам, был проведен следующий опыт: аликвоты КТ объемом 80 мл заражали вирусами герпеса свиней (SHV-1) и облучали УФ-В, как описано в Примере эксперимента 1. В свободно размещенных пробах титр вируса снижался почти на 4 log₁₀, в прочно зафиксированных - всего примерно на 3 log₁₀. Это означает, что в указанных условиях заметно повышается и инактивация вирусов.

Таблица 5 Обозначение пробы Титр вируса (log₁₀ TCID₅₀) Необработанный контроль 4,4±0,2 Прочно зафиксированная проба 1,41±0,18 Свободно размещенная проба 0,56±0,15

Пример эксперимента 6:

Инактивация вирусов везикулярного стоматита посредством облучения УФ-В без свободного движения КТ-аликвот или при свободном движении в процессе встряхивания

Опыт был проведен, как описано в Примере эксперимента 5, только аликвоты КТ вместо SHV-1 были заражены VSV. И в этом случае уровень инактивации вирусов в свободно размещенных пробах при значении более 6,46 log₁₀ был выше, чем в пробах сравнения, которые во время облучения были зафиксированы между кварцевыми пластинами (Таблица 6). Также примечательно, что в этом случае титр вируса снижался относительно сильно (примерно на 5,4 log₁₀). Очевидно, что VSV более чувствителен к УФ-излучению, чем SHV-1.

Таблица 6 Обозначение пробы Титр вируса (Loq₁₀ TCID₅₀) Необработанный контроль 6,7±1,05 Прочно зафиксированная проба 1,29±1,05 Свободно размещенная проба ≤0,24±0,00

Пример эксперимента 7:

Инактивация S.epidermidis посредством облучения УФ-С без свободного движения КТ-аликвот или при свободном движении в процессе встряхивания

В этом опыте осуществляли облучение УФ-С излучением вместо УФ-В излучения. Доза УФ-излучения составляла 0,3 Дж/см² (время облучения: 60 с). В остальном условия были такими, как описано в Примере эксперимента 1. Как видно из Таблицы 7, титр бактерий в фиксированных пробах снижался всего примерно на 1 log₁₀. Это явно отражает малую глубину проникновения УФ-С в суспензию тромбоцитов. В свободно размещенных пробах, напротив, больше не обнаруживалось бактерий, уровень инактивации превышал 4 log₁₀.

Таблица 7 Обозначение пробы Титр бактерий (loq₁₀ KOE/мл) Необработанный контроль 4,08±0,04 Прочно зафиксированная проба 2,99±0,13 Свободно размещенная проба ≤0,24

Пример эксперимента 8:

Инактивация VSV посредством облучения УФ-С без свободного движения КТ-аликвот или при свободном движении в процессе встряхивания

Как и в Примере эксперимента 6, в качестве тест-вируса был использован VSV. Условия были такими же, как в Примере эксперимента 7. Приведенные в Таблице 8 результаты показывают, что и в этом случае уровень инактивации патогенного микроорганизма в свободно размещенных пробах был намного больше, чем в фиксированных: в то время, как титр вируса в фиксированных пробах снижался только примерно на 1,5 log₁₀, в незафиксированных пробах снижение составляло примерно 6,2 log₁₀.

Таблица 8 Обозначение пробы Титр вируса (log₁₀ TCID₅₀) Необработанный контроль 6,92±0,22 Прочно зафиксированная проба 5,47±0,21 Свободно размещенная проба 0,74±0,76

Изобретение относится к области медицины. Способ включает приготовление концентратов тромбоцитов (КТ) и облучение ультрафиолетовым излучением с длиной волны от 200 нм до 280 нм (УФ-С излучение) с энергией излучения в диапазоне 0,01 до 2 Дж/см². Каждая доза КТ находится в гибком, проницаемом для УФ-излучения, плоском пакете для облучения объемом до 5000 мл, который заполнен менее чем на 30% от максимальной емкости. Пакет во время облучения приводят в движение посредством встряхивания, раскачивания, вращения, так что содержимое циркулирует, и во время движения образуются зоны с переменной толщиной слоев. Дополнительно осуществляют облучение УФ-В излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,3 до 5 Дж/см². Содержание плазмы в КТ составляет более 20 весовых %. Способ эффективно инактивирует патогенные микроорганизмы и лейкоциты, причем функция тромбоцитов остается неизмененной. 24 з.п.ф-лы, 8 табл.

1. Способ инактивации патогенных микоорганизмов и(или) лейкоцитов в концентратах тромбоцитов (КТ), включающий в себя следующие этапы:
- приготовление КТ из донорской крови и(или) посредством механического афереза;
- обработку КТ посредством облучения ультрафиолетовым излучением (УФ-излучением),
- при этом КТ состоят из множества доз, предназначенных для отдельного пользования и хранящихся раздельно; и
- каждая доза КТ находится в гибком, проницаемом для УФ-излучения, плоском пакете для облучения, отличающийся тем, что
- пакет для облучения заполнен менее чем на 30% от максимальной емкости пакета для облучения, и
- пакет для облучения во время облучения УФ-излучением приводят в движение, так что содержимое пакета для облучения циркулирует, и во время движения образуются зоны с переменной толщиной слоев, причем используемое УФ-излучение является УФ-С излучением с длиной волны от 200 нм до 280 нм.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что патогенными микроорганизмами являются вирусы и(или) бактерии.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что во время движения в облучаемой зоне время от времени возникают области, которые имеют толщину слоя менее 1 мм.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что движение, в частности амплитуду движения, выбирают таким образом, что внутри КТ время от времени возникают облучаемые области, которые имеют толщину слоя менее 0,5 мм.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения имеют нижнюю сторону и верхнюю сторону, и сумма площадей нижней и верхней сторон, которые контактируют или могут контактировать с содержимым пакета, составляет более 90%, предпочтительно более 99%, от общей площади поверхности содержимого пакета.

6. Способ по п.1, отличающийся тем, что излучение УФ-С состоит исключительно из излучения с длинами волн от 200 нм до менее чем 280 нм.

7. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждая доза состоит из образцов, полученных максимум от 8 доноров, предпочтительно максимум от 6 доноров.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что каждая доза происходит от одного донора.

9. Способ по п.1, отличающийся тем, что КТ содержит не менее 1·10⁸ тромбоцитов в мл, предпочтительно не менее 5·10⁸ тромбоцитов в мл.

10. Способ по п.1, отличающийся тем, что дополнительно осуществляют облучение УФ-В излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,3 до 5 Дж/см², предпочтительно в диапазоне от 0,5 до 2,5 Дж/см².

11. Способ по п.1, отличающийся тем, что облучение осуществляется УФ-С излучением с энергией излучения в диапазоне от 0,01 до 2 Дж/см², предпочтительно - в диапазоне от 0,1 до 1 Дж/см².

12. Способ по п.1, отличающийся тем, что КТ содержат плазму и, возможно, подходящую среду для хранения, причем содержание плазмы предпочтительно составляет более 20 вес.%.

13. Способ по п.1, отличающийся тем, что КТ содержат забуференную водную среду для хранения.

14. Способ по п.1, отличающийся тем, что инактивируются вирусы, бактерии и/или лейкоциты, а функция тромбоцитов по существу остается неизмененной.

15. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения имеют объем до 5000 мл.

16. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения подвижно закреплены в аппаратуре, в которой они перемещаются и облучаются, в частности они не зажаты между двумя плоскостями, например пластинами из проницаемых для УФ-излучения стекла или пластмассы.

17. Способ по п.1, отличающийся тем, что во время как минимум трех четвертей всего времени облучения пакеты для облучения находятся в движении.

18. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения приводят в движение посредством встряхивания.

19. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения приводят в движение посредством раскачивания.

20. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения приводят в движение посредством вращения.

21. Способ по п.1, отличающийся тем, что встряхивание осуществляют с помощью орбитального встряхивателя, платформенного встряхивателя, вертикально качающегося встряхивателя или встряхивателя, качающегося в горизонтальной плоскости.

22. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения укладывают на одну из боковых сторон, так что во время и в результате движения или встряхивания высота пакетов для облучения, выражаемая как расстояние вдоль перпендикуляра к поверхностям между поверхностью, на которую уложены пакеты для облучения, и наивысшей точкой пересечения с верхней поверхностью пакета для облучения по всей верхней поверхности пакета для облучения, контактирующей с содержимым пакета, постоянно изменяется.

23. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения имеют среднюю высоту наполнения, равную 10 мм, предпочтительно 5 мм, и в результате движения в них постоянно возникают волны с впадинами, где толщина слоя составляет менее половины от средней высоты наполнения, предпочтительно толщина слоя составляет менее 1 мм или даже менее 0,1 мм.

24. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения во время облучения постоянно приводятся в движение с амплитудой в диапазоне от 0,2 до 8 см как минимум по оси «х» и при желании по оси «y» (ось «y» перпендикулярна оси «х»), и независимо от этого частота изменения направления колебательного движения составляет от 0,5 до 10 Гц.

25. Способ по п.1, отличающийся тем, что пакеты для облучения во время облучения заполнены не более чем на 20% от максимальной емкости пакета.