СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СТЕПЕНИ ЭПИДЕМИЧЕСКОЙ ОПАСНОСТИ ПАТОГЕННЫХ И ПОТЕНЦИАЛЬНО-ПАТОГЕННЫХ БАКТЕРИЙ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВОДЫ РАЗЛИЧНОГО ВИДА ВОДОПОЛЬЗОВАНИЯ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/00 C12R1/385 C12R1/19 C12R1/22 C12R1/42 C12R1/445 C12R1/39 

Предлагаемое изобретение относится к области медицины, более конкретно к определению патогенных и вирулентных свойств бактерий с применением перевиваемой клеточной культуры BGM (культура клеток почки зеленой африканской мартышки, состоящая из мелких эпителиоподобных четко ограниченных клеток с округлыми относительно крупными ядрами (по 1-2 в ядре), цитоплазма слабо зернистая).

Развитие кишечного заболевания происходит в случае, когда бактерии не только проникают в макроорганизм, размножаются в нем, но и подавляют его защитные механизмы - обладают вирулентностью. Вирулентность бактерий - признак не видовой, как, например, патогенность, а конкретного штамма. Вирулентность реализуется через ряд последовательных процессов взаимодействия бактериальных клеток с клетками и тканями макроорганизма: адгезивностью, колонизационностью, инвазивностью, токсигенностью.

Исторически вирулентность бактерий определяли на животных, а с конца 60-х годов в санитарной микробиологии для определения биологической активности патогенных бактерий, выделенных из воды различного назначения, стали использовать клеточные культуры. Впервые такое исследование было проведено Ю.Г.Талаевой в 1970 (Талаева Ю.Г. Современные критерии оценки эпидемической безопасности воды открытых водоемов (экспериментальные и натурные исследования на модели S.typi) // Депонированная рукопись. - М., 1970 г., стр.72-76; стр.123-178), в котором была показана идентичность ответа животных и культуральных моделей в выявлении вирулентности брюшнотифозных бактерий. Позднее для этой цели стали использовать клетки Hela, Help2, Vero, RH, ДККЭ, МК₂ (почек зеленой африканской обезьяны). Однако работа с этими клетками затруднена большой скоростью старения культуры, в отличие от перевиваемой линии клеток BGM.

Наиболее близких аналогов заявленному способу из уровня техники не выявлено.

Технической задачей данного изобретения является определение патогенности и вирулентности бактерий по их цитотоксическому и токсическому действию, а также адгезивной и инвазивной активности на перевиваемые клетки BGM.

Технический результат достигается тем, что в способе определения степени эпидемической опасности патогенных и потенциально-патогенных бактерии, выделенных из воды различного вида водопользования, на перевиваемых клетках культуры ткани BGM (клеток зеленой мартышки) определяют патогенные и вирулентные свойства бактерий, представляющих собой адгезивную, инвазивную и токсическую активность бактерий посредством внесения в культуральный монослой бактериального заражения дозой, содержащей 10⁷ колоний бактериальных клеток, затем через 24 часа после контакта клеток BGM с бактериями при температуре 37°С, клетки монослоя промывают физиологическим раствором рН=7,2 в количестве 8 раз по 10 мл, определяют адгезивную активность, для чего подсчитывают живые и мертвые клетки, визуально адгезированные бактериальным ростом в камере Горяева при помощи окрашивания клеток BGM 0,1% раствором трипанового синего, и вычисляют индекс адгезивной активности (коэффициент безразмерный) бактерий по формуле:

А=(Q_BGM:Q_bac)×100, где

A - индекс адгезии, Q_BGM - количество живых клеток BGM, визуально с адгезией бактерий (оценка результатов адгезивной активности бактерий проводилась по следующей шкале: неадгезивные при индексе адгезии А≤1,75; низкоадгезивные от 1,76 до 2,50; среднеадгезивные от 2,51 до 4,00 и высокоадгезивные при А>4,00); Q_bас - количество живых клеток в монослое, затем для определения инвазивной активности питательную среду во флаконах заменяют средой, содержащей антибиотик в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в термостате 1 час при 37°С, использованную питательную среду удаляют из флаконов и флаконы с клетками BGM отмывают от бактерий 8 раз физиологическим раствором по 10 мл, затем клетки BGM лизируют 0,1% Triton X-100 и из полученной суспензии делают высевы по 0,1 мл с учетом необходимых разведений на чашки со средой Эндо для получения изолированного роста бактериальных колоний и инкубируют в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С, после чего подсчитывают число выросших бактериальных клеток и определяют инвазивную активность (в %) по формуле:

I=(V_bac:Q_bac)×100, где

I - индекс инвазивной активности, V_bac - количество бактерий, устойчивых к антибиотику; Q_bac - общее количество бактерий, добавленных к монослою (оценка результатов инвазивной активности бактерий проводилась из расчета высокоинвазивных бактерий - более 50 процентов проникновения бактерий в клетки BGM), затем определяют действие бактериального токсина путем суточного инкубирования бактерий в монослое клеток BGM с последующим центрифугированием и фильтрацией суспензии через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, полученный субстрат, содержащий бактериальный токсин, помещают в чистый монослой перевиваемых клеток, а затем через сутки подсчитывают количество живых и мертвых клеток BGM и вычисляют индекс токсичности по формуле:

Т=(J_BGM:Q_BGM)×100, где

Т - индекс токсической активности бактерий (коэффициент безразмерный), J_BGM - количество живых клеток BGM после контакта с бактериями, Q_BGM - количество клеток BGM в монослое до заражения (оценка результатов индекса токсичности бактерий осуществляется по шкале: нетоксичные бактерии при индексе токсичности Т≤1,75; низкотоксичные от 1,76 до 2,50; среднетоксичные от 2,51 до 4,00 и высокотоксичные при Т>4,00). Опасными в эпидемическом отношении считаются бактерии с высоким индексом адгезивной, инвазивной и токсической активности, учет которых имеет существенное значение при расчете микробного риска.

Предлагаемый способ реализуется следующим образом.

Для проведения исследований приготавливают 1 миллиардную взвесь суточных бактериальных культур по стандартной методике. Бактериальная заражающая доза составляет - 1×10⁷ КОЕ/мл. Контрольное содержание бактерий определяют на мясо-пептонном агаре прямым посевом с разведением в физрастворе.

Перевиваемую линию клеток BGM выращивают во флаконах объемом 25 см³, в которые вносят 10 мл среды Игла с двойным набором аминокислот, содержащую 5% эмбриональную сыворотку крупного рогатого скота и добавляют 25000 ЕД пенициллина на 100 мл среды. Флаконы инкубируют в течение 3 суток при 37°С до образования монослоя, при этом среднее количество живых клеток BGM в монослое находится в пределах 10⁷. Далее флаконы с клетками BGM заражали 1 мл бактериальной суспензии в концентрации 10⁷ КОЕ/мл, и инкубируют в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С.

Для определения адгезивной активности бактерий культуру клеток BGM выращивают на поверхности покровных стекол, помещенных во флаконы со средой Игла, и на поверхности флаконов; для определения цитотоксического и токсического действия бактерий - клетки BGM выращивают на поверхности флаконов.

Через 6, 24, 48, 72 часа и 4 суток после контакта клеток BGM с бактериями стекла извлекают и промывают физиологическим раствором рН=7,2, фиксируют раствором Буэна и далее окрашивают азур-эозином, оценивая при этом визуально способность бактерий проникать и размножаться внутри или на поверхности клеток микроскопированием при увеличении 10×40, 10×100 (масляная иммерсия).

Для выявления адгезивной активности флаконы с клетками BGM после заражения бактериальной суспензией и последующей инкубации в термостате в течение 24 часов при 37°С отмывают 8 раз физиологическим раствором (10 мл). Затем проводят подсчет живых и мертвых клеток в камере Горяева с использованием витального красителя Трипанового синего, оценивая при этом адгезию бактерий визуально на живых клетках BGM по стандартной методике и вычисляя индекс адгезивной активности.

Для определения инвазивной активности бактерий через сутки после заражения питательную среду во флаконах заменяют средой, содержащей антибиотик в концентрации 50 мкг/мл, и инкубируют 1 час при 37°С в термостате. В работе используют антибактериальные препараты, не оказывающие ингибирующего действия на клетки BGM, - ампицилин, гентамицин, ципрофлаксацин. Использованную питательную среду удаляют из флаконов, делая предварительно контрольный высев на среду Эндо методом прямого посева. Посевы инкубируют в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С. Флаконы с клетками BGM отмывают от бактерий 8 раз физиологическим раствором (10 мл), затем клетки BGM лизируют 0,1% Triton X-100 и делалают высевы по 0,1 мл с учетом необходимых разведений на чашки со средой Эндо для получения изолированного роста колоний и инкубируют в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С, затем подсчитывают выросшие колонии и вычисляют процент инвазии.

Изучение влияние токсина, выделяемого бактериями, проводят путем внесения 1 мл испытуемой бактериальной культуры в концентрации 10⁷ КОЕ/мл во флаконы емкостью 25 см³ с монослоем клеток BGM. Через 24 часа контакта полученную суспензию центрифугируют и фильтруют через мембранный фильтр из нитроцеллюлозы (диаметр 0,22 мкм) с последующим наложением на плотную дифференциальную среду в зависимости от вида микроорганизма (Эндо, ЖСА, МПА) для установления жизнеспособности бактериальных культур. Параллельно производят прямой высев фильтрата на указанные среды для выявления жизнеспособных бактерий (бактериальный рост должен отсутствовать). Фильтрат вносят во флакон с культурой ткани. Через 24 часа подсчитывали живые и мертвые клетки BGM в камере Горяева, и вычисляют индекс токсичности.

Пример 1. Изученные штаммы, выращенные нами на покровных стеклах, обладали адгезивной активностью. Под действием Е. coli 1257 и некоторых «диких» (выделенных из воды поверхностных водоемов) бактерий семейства Enterobacteriaceae через 17 часов были отмечены морфологические изменения в клетках BGM: размеры отдельных клеток значительно увеличились, и более крупные кластеры, не разделенные на отдельные клетки, включающие 2-3 ядра. Через 48 часов наблюдалась дегенерация клеток, которая начиналась с агрегации ядер и ретракции цитоплазмы в центральной части многоядерной клетки, после чего крупные клетки деформировались. При воздействии музейной культурой St. aureus 906 получены аналогичные изменения в морфологии клеток BGM, которые наблюдались в более поздние сроки (через 72 часа) по сравнению с бактериями семейства Enterobacteriaceae и неферментирующими.

Пример 2. При проведении натурных исследований воды различных водоисточников адгезивную активность определяли у 45 штаммов патогенных и потенциально-патогенных бактерий. Индекс адгезивной активности на 100 клеток BGM находился в пределах от 0,2 (у низкоагезивных штаммов) до 19 (у высокоадгезивных). Из 45 штаммов высокая адгезия выявлена у 69,5%. Результаты оценки адгезивной активности показали, что практически все изучаемые бактерии обладали высокой адгезией, причем в экспериментальных исследованиях было установлено, что после воздействия физических и химических факторов, направленных на обеззараживание воды с последующим их восстановлением в более питательной среде, их адгезивная активность увеличивалась с 3 до 19 КОЕ на 100 клеток BGM.

Адгезивная активность у бактерий: Е.соli 1257 и Klebsiella pneumonia 59, которые предварительно подращивали в мясо-пептонном бульоне и мясо-пептонном бульоне с 0,5% глюкозой, снижалась; у Klebsiella oxsitoka 52 напротив усиливалась; у музейной культуры Ps. aeruginosa 10145 в присутствии в ростовой среде глюкозы усиливалась; у штамма Ps. aeruginosa 9 (был выделен из ливневого колодца после внесения дезсредства) присутствие глюкозы в ростовой среде ингибировало адгезивную активность (таблица 1). Оценка результатов проводилась по следующей шкале: неадгезивными считали штаммы при среднем числе бактерий на одной клетке BGM≤1,75; низкоадгезивными - от 1,76 до 2,50; среднеадгезивными от 2,51 до 4,00 и высокоадгезивными при среднем числе бактерий на одной клетке BGM>4,00.

Пример 3. Все изученные нами штаммы бактерий, выделенные из вод различного вида водопользования, обладали высокой степенью токсичности, которая была выявлена при определении факторов патогенности на культуральных перевиваемых клетках как у лактозоположительных, так и лактозоотрицательных микроорганизмов семейства Enterobacteriaceae. Изучение действия бактериального токсина на клетки BGM показало, что токсическое действие бактерий намного больше по сравнению с действием самих бактерий. Это касается как музейных бактериальных культур, так и бактериальных культур, выделенных из вод различного вида водопользования (таблица 3).

Пример 4. Инвазивной активностью обладали практически все «дикие» штаммы, выделенные из воды различных водоисточников, за исключением лактозоположительной Klebsiella oxytoca (p. Пахра), инвазивная активность которой восстановилась после суточной инкубации в МПБ, содержащем 0,5% глюкозы. Музейные штаммы E.coli 1257 и Salmonella enteritidis 5765 не обладали инвазивной активностью, но после пассажа через питательную среду с усиленными ростовыми свойствами - МПБ, содержащий 0,5% глюкозы, позволило увеличить их инвазивную активность (вирулентность) до 2% и 5,63% соответственно.

Инвазивная активность бактерий семейства Enterobacteriaceae в клетки BGM увеличивалась - 0,01-100 КОЕ на 100 клеток BGM. Установлено, что при подращивании этих бактерий в более питательной среде их инвазивная активность увеличивается, что свидетельствует о потенциальной патогенности изученных штаммов. Инвазивная активность неферментирующих бактерий, выделенных из различных водоисточников, составляла 100 КОЕ на 100 клеток BGM независимо от условий культивирования (таблица 2). Также было выявлено, что бактерии обладали инвазивной активностью независимо от чувствительности или резистентности бактерий к использованному антибиотику. При воздействии химических и физических методов воздействий на изученные бактерии, направленные на обеззараживание воды, их инвазивная активность увеличивалась.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет на клетках BGM в одной постановке оценить степень опасности патогенных и потенциально патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования, и может быть использован в оценке микробного риска.

Таблица 1 Исследование адгезивной активности бактерий на клетках BGM¹ № п/п Бактериальные культуры МПА² МПБ³ МПБ + 0,5% Г⁴ Адгезия 1 E.coli 1257 5,9 5,4 1,7 ↓ 2 Ps. aeruginosa 9 spp. 5,4 3,4 1,2 ↓ 3 Klebsiella pneumonia 59 spp. 5,0 4,9 4,3 ↓ 4 Ps. aeruginosa ATCC 10145 5,2 6,1 9,5 ↑ 5 Klebsiella oxsitoka 52 spp. 5,4 9,1 9,7 ↑ ¹ - КОЕ/мл на 100 клеток BGM ² - мясо-пептонный агар ³ - мясо-пептонный бульон ⁴ - мясо-пептонный бульон + 0,5% глюкозы

Таблица 3 Исследование действия бактериального токсина на клетки BGM¹ Действие на клетки BGM Ps. fluorescens N57 spp. Ps.aeruginosa АТСС 10145 E.coli 1257 St.aureus 906 К1.oxsitoca N52 spp. Yersinia rohdei spp. Адгезия 5,6 1,25 10,9 23,75 10,63 15,88 Токсигенность 11,71 15 13,6 17,71 13,13 18,94 ¹ - КОЕ/мл на 100 клеток BGM

На перевиваемых клетках культуры ткани клеток почки зеленой африканской мартышки BGM определяют индекс адгезивной активности (А), индекс инвазивной активности (I) и индекс токсической активности (Т) патогенных бактерий. Вносят в культуральный монослой клеток BGM дозу, содержащую 10⁷ колоний бактериальных клеток, и выдерживают при 37°С в течение 24 ч. Промывают клетки монослоя физиологическим раствором рН=7,2 в количестве 10 мл 8 раз. Определяют индекс (А) по формуле, предварительно подсчитав визуально в камере Горяева живые и мертвые клетки, адгезированные бактериальным ростом и окрашенные 0,1% раствором трипанового синего. Определяют индекс (I) по формуле, предварительно питательную среду во флаконах заменяют средой, содержащей антибиотик в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в термостате 1 ч при 37°С. Отмывают клетки BGM от бактерий 8 раз физиологическим раствором по 10 мл, лизируют их 0,1% Triton X-100. Из полученной суспензии делают высевы по 0,1 мл с учетом необходимых разведений на чашки со средой Эндо. Инкубируют в течение 24 ч в термостате при 37°С и подсчитывают число выросших бактериальных клеток. Определяют индекс (Т) по формуле, предварительно 1 сут. инкубируют бактерии в монослое клеток BGM. Центрифугируют и фильтруют суспензию через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм. Помещают полученный субстрат в чистый монослой перевиваемых клеток и через 1 сут. подсчитывают количество живых и мертвых клеток BGM. Изобретение позволяет определить степень эпидемической опасности патогенных бактерий, выделенных из воды: она считается высокой при значениях: А>4,00, I>50%, Т>4,00. 3 табл., 4 пр.

Способ определения степени эпидемической опасности патогенных и потенциально-патогенных бактерий, выделенных из воды различного вида водопользования, в котором на перевиваемых клетках культуры ткани клеток почки зеленой африканской мартышки BGM определяют патогенные и вирулентные свойства бактерий, представляющие собой их адгезивную, инвазивную и токсическую активность, посредством внесения в культуральный монослой бактериального заражения дозой, содержащей 10⁷ колоний бактериальных клеток, затем через 24 часа после контакта клеток BGM с бактериями при температуре 37°С, клетки монослоя промывают физиологическим раствором рН=7,2 в количестве 8 раз по 10 мл, определяют адгезивную активность, для чего подсчитывают живые и мертвые клетки визуально, адгезированные бактериальным ростом в камере Горяева, при помощи окрашивания клеток BGM 0,1% раствором трипанового синего и определяют индекс адгезивной активности бактерий по формуле:
А=(q_bgm:Q_bас)×100, где
А - индекс адгезии, q_bgm - количество живых клеток BGM, визуально с адгезией бактерий (клет.); Q_bac - количество живых клеток в монослое до заражения (клет.), степень эпидемической опасности считается высокой при значениях А>4,00, средней при значении А от 2,51 до 4,00, низкой при значении А от 1,76 до 2,50, затем для определения инвазивной активности питательную среду во флаконах заменяют средой, содержащей антибиотик в концентрации 50 мкг/мл и инкубируют в термостате 1 час при 37°С, использованную питательную среду удаляют из флаконов и флаконы с клетками BGM отмывают от бактерий 8 раз физиологическим раствором по 10 мл, затем клетки BGM лизируют 0,1% Triton X-100 и из полученной суспензии делают высевы по 0,1 мл с учетом необходимых разведении на чашки со средой Эндо для получения изолированного роста бактериальных колоний и инкубируют в течение 24 часов в термостате при температуре 37°С, после чего подсчитывают число выросших бактериальных клеток и определяют индекс инвазивной активности по формуле:
I=(V_bac:Q_bac)×100, где
I - индекс инвазивной активности (%), V_bac - количество бактерий, устойчивых к антибиотику (клет.); Q_bac - общее количество бактерий, добавленных к монослою (клет.), степень эпидемической опасности считается высокой при значениях I>50%, затем определяют действие бактериального токсина путем суточного инкубирования бактерий в монослое клеток BGM с последующим центрифугированием и фильтрацией суспензии через мембранные фильтры с диаметром пор 0,22 мкм, полученный субстрат, содержащий бактериальный токсин помещают в чистый монослой перевиваемых клеток, а затем через сутки подсчитывают количество живых и мертвых клеток BGM и определяют индекс токсичности по формуле:
T=(j_bgm:Q_bgm)×100, где
Т - индекс токсической активности бактерий, j_bgm - количество живых клеток BGM после контакта с бактериями (клет.), Q_bgm - количество клеток BGM в монослое до заражения (клет.), степень эпидемической опасности считается высокой при значениях Т>4,00, очень низкая при Т≤1,75, низкая при Т от 1,76 до 2,50, средняя при Т от 2,51 до 4,00.