СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИВНЫХ СВОЙСТВ БАКТЕРИЙ РОДА ENTEROCOCCUS С ПОМОЩЬЮ КЛЕТОЧНОЙ ЛИНИИ СаСо-2 Российский патент 2013 года по МПК C12Q1/02 G01N33/53 C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и может быть использовано в пищевой биотехнологии. Метод используется для определения адгезивных свойств бактерий с помощью линии клеток СаСо-2 (эпителеподобные клетки аденокарценомы ободочной кишки человека) в монослое.

Известен метод определения адгезии микробов к эпителиальным клеткам кишечника крыс или мышей, описанный в МУК 4.2.2602-10. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Система предрегистрационного доклинического изучения безопасности препаратов. Отбор, проверка и хранение производственных штаммов, используемых при производстве пробиотиков. Методические указания. Для постановки методики адгезии используют суточные культуры штаммов. Суточную культуру штамма, выращенную на скошенной адекватной питательной среде, смывают забуференным фосфатным физиологическим раствором (ЗФР) и затем дважды отмывают ЗФР с рН 7,2 центрифугированием (1500 об/мин, 10 мин). Кроме того, культуры можно выращивать на плотной среде, покрытой целлофаном, при 37°С в течение 16-18 ч. Готовят суспензию, содержащую 2×10⁹ КОЕ/мл. Адгезивность штаммов изучают в системе in vitro на эпителиальных клетках тонкой и толстой кишки крыс линии Фишер. Крыс или мышей забивают углекислым газом, из кишечника выделяют кусочки размером 5×5 мм, тщательно отмывают от слизи и содержимого в ЗФР. Эпителиальные клетки получают из кусков слизистой кишечника на вибраторе модели ВПП.

Клетки дважды отмывают охлажденным ЗФР (рН 7,2) центрифугированием при 800 об/мин по 10 мин. После определения концентрации взвеси клеток с помощью камеры Горяева под световым микроскопом ее доводят до 2×10⁶ клеток/мл. Готовят суспензию испытуемой культуры концентрацией 2×10⁹ КОЕ/мл. На 0,5 мл взвеси эпителиальных клеток наносят 0,5 мл взвеси бактериальной культуры. Клеточно-бактериальную смесь инкубируют в термостате при (37±1)°С в течение 30 мин, периодически встряхивая. Затем смесь трехкратно отмывают ЗФР от неприлипших бактерий при 600 об/мин по 10 мин. Все манипуляции осуществляют на холоде. К осадку добавляют 1-2 капли ЗФР и готовят мазки на стекле. Препараты фиксируют 96° спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе. Под световым микроскопом подсчитывают среднее количество бактерий, прилипших к 25 энтероцитам или колоноцитам. При оценке адгезии каждого штамма микроорганизма опыт повторяют не менее 3 раз. Подсчитывают средний показатель адгезии (СПА), число микробов на 1 клетку - микроб/клетка в 10 полях зрения, учитывая результаты всех опытов.

Уровень адгезии отдельных штаммов бактерий условно дифференцирован на четыре степени:

- неадгезивную (СПА = 0);

- слабоадгезивную (СПА = 1-5);

- среднеадгезивную (СПА = 5-10);

- высокоадгезивную (СПА выше 10).

Описанный метод является прототипом.

Недостатком вышеуказанного метода является то, что данный метод использует животные клетки (клетки крыс и мышей). Тестирование на животных, которое применялось для пищевых патогенов, давно известно. Но в настоящее время развитие клеточной науки позволяется проводить исследования непосредственно на эпителиальных клетках человека. Это играет важную роль, особенно в области пищевой биотехнологии.

Техническим результатом является повышение точности выявления адгезивной активности пробиотических бактерий рода Enterococcus разработанным способом определения на эпителиальных клетках ободочной кишки человека линии СаСо-2 в монослое.

Задача предлагаемого изобретения направлена на разработку способа определения адгезивных свойств пробиотических бактерий рода

Enterococus. Метод использует клеточную линию СаСо-2 в монослое, которую получают из ободочной кишки человека.

Поставленная задача решается разработанным способом определения адгезивных свойств бактерий рода Enterococus с помощью клеточной линии СаСо-2, включающим подготовку бактериальной суспензии: выращивание штаммов бактерий на соответствующей жидкой среде в течение 18 ч; отделение полученной биомассы от культуральной среды центрифугированием, для этого 20 мл культуральной суспензии каждого штамма центрифугируют при минус 4°С с частотой 4000 об/мин в течение 15 мин; разведение полученной биомассы в физиологическом растворе до концентрации 4×10⁷ КОЕ/см³; подготовку монослоя клеток СаСо-2: выращивание монослоя клеток СаСо-2 на питательной среде DMEM, включающей 15% сыворотки эмбриональной бычьей, 5% антибиотика пенициллин-стрептомицина, в 6-луночном планшете в течение 5 суток; удаление со сформировавшегося монослоя питательной среды лабораторным аспиратором; промывка монослоя клеток дважды физраствором; определение адгезивных свойств бактерий: в каждую лунку планшета со сформировавшимся монослоем клеток СаСо-2 вносят 0,5 мл бактериальной культуры и 2 мл среды DMEM, включающей 15% сыворотки эмбриональной бычьей; культивируют в течение 1 ч при температуре 37°С; удаляют питательную среду лабораторным аспиратором и промывают монослой клеток дважды физраствором, снятие монослоя со связанными бактериальными клетками осуществляют раствором Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1, для этого в каждую лунку 6-луночного планшета добавляют 1 мл раствора, для подсчета связанных бактериальных клеток используют метод разведений при выращивании клеток на соответствующей плотной среде, адгезивные свойства микроорганизмов определяют по числу бактерий, связавшихся с 1000 клетками СаСо-2: от 1010 до 3000 бактериальных клеток - высокоадгезивный штамм; от 210 до 1000 - среднеадгезивный; от 0 до 200 - низкоадгезивный.

Способ определения адгезивных свойств пробиотических штаммов бактерий рода Enterococus с помощью линии эпителиальных клеток человека основан на взаимодействии бактерий с клеточной стенкой эпителиальных клеток колоноректальной карциномы кишечника человека СаСо-2 в монослое, и подсчете связавшихся бактерий с монослоем.

Преимущества предлагаемого способа заключаются в том, что способ использует непосредственно человеческую клетку СаСо-2 для определения адгезивных свойств бактерий, которые являются одним из важных свойств пробиотических штаммов, применяемых в пищевой промышленности.

Способ позволяет изучить исследуемые свойства непосредственно на эпителиальных клетках человека, что дает основание экстраполяции результатов на организм человека в целом. При данном способе клетки используются в виде монослоя, это позволяет определить количество адгезивных бактерий с большей точностью.

Для подсчета связанных бактериальных клеток использовался метод разведений при выращивании клеток на плотной среде MRS. Адгезивные свойства микроорганизмов определяются по числу бактерий, связывающихся с 1000 клетками СаСо-2: от 1010 до 3000 бактериальных клеток - высокоадгезивный штамм; от 210 до 1000 - среднеадгезивный; от 0 до 200 - низкоадгезивный. Промежуток между результатами дан на погрешность при подсчете.

Пример конкретного выполнения предлагаемого способа

Определение адгезивных свойств штаммов Enterococcus thailandicus КПБ-2 (ВКПМ В-10684) и Enterococcus faecalis 55 (ВКПМ В-8652).

Проводят подготовку бактериальной суспензии: для этого выращивают штаммы Enterococcus thailandicus КПБ-2 и Enterococcus faecalis 55 на соответствующей жидкой среде в течение 18 ч; отделяют полученную биомассу от культуральной среды центрифугированием, для этого 20 мл культуральной суспензии каждого штамма центрифугируют при минус 4°С с частотой 4000 об/мин в течение 15 мин, разводят полученную биомассу в физиологическом растворе до концентрации 4×10⁷ КОЕ/см³. Выращивают монослой клеток СаСо-2 на питательной среде DMEM, включающей 15% сыворотки эмбриональной бычьей, 5% антибиотика пенициллин-стрептомицин, в 6-луночном планшете в течение 5 суток; после чего удаляют со сформировавшегося монослоя питательную среду лабораторным аспиратором; промывают монослой клеток дважды физраствором. Для определения адгезивных свойств бактерий в каждую лунку планшета со сформировавшимся монослоем клеток СаСо-2 вносят 0,5 мл бактериальной суспензии и 2 мл среды DMEM, включающей 15% сыворотки эмбриональной бычьей; культивируют в течение 1 ч при температуре 37°С; удаляют питательную среду лабораторным аспиратором и промывают монослой клеток дважды физраствором. Снятие монослоя со связанными бактериальными клетками осуществляют раствором Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1, для этого в каждую лунку 6-луночного планшета добавляют 1 мл раствора.

Для подсчета связанных бактериальных клеток используют метод разведений при выращивании клеток на соответствующей плотной среде, адгезивные свойства микроорганизмов определяют по числу бактерий, связавшихся с 1000 клетками СаСо-2: от 1010 до 3000 бактериальных клеток - высокоадгезивный штамм; от 210 до 1000 - среднеадгезивный; от 0 до 200 - низкоадгезивный.

Результаты показали, что с 1000 клетками СаСо-2 связывается 2×10³ клеток Е. thailandicus КПБ-2, 109×10³ клеток Е. faecalis 55. Из этого исследует, что Е. thailandicus КПБ-2 и Е. faecalis 55 характеризуются высокоадгезивными свойствами.

Выращенный на планшетах монослой клеток СаСо-2 можно считать моделью кишечного эпителия, поэтому использование данного способа повышает точность выявления адгезивной активности пробиотических микроорганизмов, которые используются в области пищевой промышленности.

Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии и касается способа определения адгезивных свойств бактерий рода Enterococcus. Представленный способ включает подготовку бактериальной суспензии, отделение полученной биомассы бактерий центрифугированием, разведение полученной биомассы в физиологическом растворе, подготовку монослоя клеток СаСо-2, внесение бактериальной культуры, культивирование клеток, промывку физраствором, снятие монослоя с бактериальными клетками и подсчитывание количества связанных с 1000 клетками СаСо-2 бактериальных клеток, при этом бактерии относят к высокоадгезивным, если количество связавшихся клеток составляет от 1010 до 3000, к среднеадгезивным - от 210 до 1000, к низкоадгезивным - от 0 до 200. Изобретение может быть использовано в пищевой биотехнологии.

Способ определения адгезивных свойств бактерий рода Enterococcus с помощью клеточной линии СаСо-2, включающий подготовку бактериальной суспензии, отделение полученной биомассы при 4000 об/мин в течение 15 мин, разведение полученной биомассы в физиологическом растворе до концентрации 4×10⁷ КОЕ/см³, выращивание монослоя клеток СаСо-2, удаление со сформировавшегося монослоя питательной среды лабораторным аспиратором, промывку монослоя клеток дважды физраствором и определение адгезивных свойств бактерий, для чего в каждую лунку планшета со сформировавшимся монослоем клеток СаСо-2 вносят 0,5 мл бактериальной культуры и 2 мл среды DMEM, включающей 15% сыворотки эмбриональной бычьей, культивируют в течение 1 ч при температуре 37°С, удаляют питательную среду лабораторным аспиратором и промывают монослой клеток дважды физраствором, снятие монослоя со связанными бактериальными клетками осуществляют раствором Версена 0,02% и трипсина 0,25% в соотношении 3:1, для подсчета связанных бактериальных клеток используют метод разведений при выращивании клеток на соответствующей плотной среде MRS, адгезивные свойства бактерий определяют по числу бактерий, связавшихся с 1000 клетками СаСо-2: от 0-200 - низкоадгезивный штамм, от 210 до 1000 - среднеадгезивный, от 1010 до 3000 бактериальных клеток - высокоадгезивный.