СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АДГЕЗИИ STAPHYLOCOCCUS SPP. К ГЕМОПРОТЕИНАМ Российский патент 2010 года по МПК C12Q1/14 C12R1/44 

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано в медицинской бактериологии для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков, выделенных от человека и объектов окружающей среды при его бактериологической идентификации, для характеристики его вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к биополимерным молекулам.

Стафилококк, в частности патогенный вид S.aureus, дифференцирует источники экзогенного железа. Гемовое железо является предпочтительным источником для патогенных видов стафилококка, именно его они предпочитают негемовому при росте и размножении в тканях организма человека или животных (Skaar E.P. Humayun M., Вае Т., DeBord К.L., Schneewind О. Iron-source preference of Staphylococcus aureus infections. Science. 2004, 305:1626-8). Молекулярные основы предпочтительного захвата гемового железа патогенными видами стафилококка обусловлены наличием у них регулируемой ионами железа Isd системой, кодирующей механизм утилизации гема, который состоит из трех поверхностных мембранных белков стафилококковой клетки (IsdA, IsdB, IsdH) (Skaar E.P., Schneewind O. Iron-regulated surface determinants (Isd) of Staphylococcus aureus: stealing iron from heme. Microbes Infect. 2004, 6(4):390-7). Ключевая роль в связывании с гемопротеинами у вида S.aureus принадлежит IsdB белку, который активно экспрессируется на поверхности клетки, как рецептор к таким гемопротеинам, как гемоглобин и миоглобин у наиболее вирулентных штаммов (Torres V.J., Pishchany G., Humayun M., Schneewind O., Skaar E.P. Staphylococcus aureus IsdB is a hemoglobin receptor required for heme iron utilization. J.Bacteriol. 2006, 188 (24):8421-8429).

Известна методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов (Брилис В.И., Брилене Т.А., Ленцнер Х.П. и др. Методика изучения адгезивного процесса микроорганизмов. Лаб. дело 1986; 4:210-212.). Наиболее близким к заявленному изобретению относится способ определения адгезии Streptococcus pneumoniae путем контакта срезов легких мышей с пневмококком (RU (21) 96100972, МПК C12Q 1/14, 1/20 (22) 1996.01.16 (54). Способ определения адгезии streptococcus pneumoniae и ее блокирования).

Его недостатками являются низкая чувствительность и воспроизводимость, а также более высокие экономические затраты, необходимые для работы с культурой тканей.

Целью заявленного изобретения является разработка стандартизуемого способа, позволяющего количественно определять показатель адгезии стафилококков к гемопротеинам (гемоглобин, миоглобин) для характеристики их вирулентного потенциала.

Сущность изобретения состоит в том, что исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с иммобилизованными гемопротеинами (миоглобин, гемоглобин) в питательной среде 199 в течение 60±15 минут, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют адгезированные стафилококки:

1) путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды, или

2) путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или

3) путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа количественной оценки адгезивности, характеризующегося хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, удобством проведения реакции непосредственно в лунках планшета и возможностью проведения экспресс-оценки адгезивной способности штаммов.

Преимуществом заявленного к патентованию способа определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам является детекция уровня адгезии у вирулентных видов стафилококков к гемопротеинам, высокая чувствительность способа за счет регистрации ферментативной активности адгезированных бактерий и возможность проведения экспресс-оценки величины адгезии.

Способ осуществляется следующим образом. Суспензию культуры стафилококка в концентрации 1 млн м.т./мл инкубируют в лунках полистиролового планшета с иммобилизованными гемопротеинами (миоглобин, гемоглобин) в питательной среде 199 в течение 1 часа, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и последующим определением количества адгезированных стафилококков путем учета выросших клеток в питательной среде или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Адгезивная активность выражается в условных единицах.

На базе лаборатории иммунологии и микробиологии ФГУН «КНИИЭМ» Роспотребнадзора проведен анализ адгезивности клинических изолятов стафилококков и музейного штамма S.aureus ATCC №25923 патентуемым способом, который показал, что клинические штаммы золотистого стафилококка, выделенные со слизистой носа пациентов с сезонным аллергическим ринитом (CAP) и с кожи пациентов атопическим дерматитом (АтД) по показателям адгезии, характеризуются большей адгезивностью к гемопротеину, что коррелирует с клинической активностью этих штаммов, музейный штамм S.aureus ATCC №25923, длительно пассируемый на твердых агаровых средах (МПА), характеризовался меньшей адгезивностью, чем клинические штаммы этого вида. С помощью патентуемого способа выявлена различная адгезивная активность между видами стафилококков, так коагулазоотрицательный стафилококк вида S.epidermidis в норме, колонизирующий кожу и слизистые здоровых лиц, характеризовался значительно меньшими показателями адгезии к гемоглобину, чем патогенные штамы вида S.aureus.

Примеры осуществления способа определения адгезии staphylococcus spp. к гемопротеинам

Пример 1. Определение адгезивной способности стафилококков, выделенных со слизистых и кожи различных групп лиц. Были исследованы изоляты стафилококков, выделенных со слизистой носа пациентов с сезонным аллергическим ринитом (CAP), с кожи пациентов атопическим дерматитом, со слизистой носа носителей золотистого стафилококка. Исследуемую живую культуру стафилококка разводили до концентрации 1 млн м.т. на 1 мл 199 средой и вносили в объеме 200 мкл в лунки полистиролового 96-луночного планшета с иммобилизованным гемоглобином, инкубировали в термостате при 37°С в течение 1 часа, далее удаляли содержимое лунок и отмывали трехкратно 199 средой, содержащей 0,05% твин-20, и физиологическим раствором, лунки осушали и в каждую лунку вносили по 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор Н₂О₂), через 10 минут вносили 50 мкл 4% раствора молибдата аммония и исследовали фотометрически при 414 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан», определяли показатель ОП_исслед образца. Паралельно определяли ОП_{фоновая}, для этого в контрольные лунки 96-луночного планшета (лунки, в которые живые культуры стафилококка не вносились) добавляли 150 мкл субстратного раствора (0,03% раствор H₂O₂) и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония, фотометрировали при 414 нм. Установка на ноль фотометра проводилась по лункам, содержащим 150 мкл дистилированной воды и 50 мкл 4% раствора молибдата аммония. Расчет показателя адгезии штаммов проводили по формуле:

ПА=ОП_{фоновая}-ОП_исслед

Результаты испытания адгезии клинических штаммов стафилококков и музейного штамма S.aureus ATCC №25923 (из коллекции лаборатории микробиологии ФГУН «Казанский НИИЭМ») данным способом представлены в таблице 1.

Пример 2. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации лунки фотометрировали при 595 нм на малогабаритном фотометре для иммуноферментного анализа АИФР-01 «Униплан». Определяли показатель оптической плотности в исследуемых лунках (ОП_исслед) и оптическую плотность контроля (ОП_{контроль}) в нулевой лунке (т.е. в лунке, в которую клеточная культура не вносилась). Показатель адгезии (ПА) рассчитывали по формуле:

ПА=ОП_исслед-ОП_{контроль}

Результаты представлены в таблице 2.

Пример 3. Определение адгезивной способности стафилококков проводили аналогично примеру 1, но для определения количества адгезированных клеток после этапа отмывки средой 199 с твином-20 в каждую лунку планшета вносили эту же среду с глюкозой, инкубировали в течение 5 часов в термостате при 37°С. После инкубации в термостате из лунки отбирали по 50 мкл питательной среды, готовили десятикратные разведения на стерильном физиологическом растворе и из каждого разведения высеивали методом газона на кровяной агар. Через 12 часов подсчитывают количество колоний на чашках и рассчитывают количество КОЕ/мл в соответствии с разведением. Результаты исследования адгезии изолятов стафилококка представлены в таблице 3.

Таблица 1 Показатели адгезии штаммов стафилококка к примеру 1 Вид микроорганизма ПА, М±m S.aureus (со слизистой носа носителей) 0,71±0,07 S.aureus (кожа пациентов с АтД) 0,6±0,06 S.aureus (со слизистой пациентов с CAP) 0,63±0,05 S.aureus (кожа здоровых лиц) 0,54±0,09 S.aureus ATCC N 25923 0,48±0,07 S.epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц) 0,38±0,07 S.epidermidis (кожа здоровых лиц) 0,32±0,05

Таблица 2 Показатели адгезии штаммов стафилококка к примеру 2 Вид микроорганизма ПА, М±m S.aureus (со слизистой носа носителей) 0,37+0,07 S.aureus (кожа пациентов с АтД) 0,35±0,06 S.aureus (со слизистой пациентов с CAP) 0,32±0,05 S.aureus (кожа здоровых лиц) 0,28±0,09 S.aureus АТСС N 25923 0,25±0,04 S.epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц) 0,15±0,07 S.epidermidis (кожа здоровых лиц) 0,12±0,05

Таблица 3 Показатели адгезии штаммов стафилококка к примеру 3 Вид микроорганизма ПА (КОЕ/на мл) S.aureus (со слизистой носа носителей) 1,3×10⁶ S.aureus (кожа пациентов с АтД) 2,3×10⁵ S.aureus (со слизистой пациентов с CAP) 2×10⁵ S.aureus (кожа здоровых лиц) 6×10⁴ S.aureus ATCCN 25923 4×10⁴ S.epidermidis (со слизистой носа здоровых лиц) 2×10² S.epidermidis (кожа здоровых лиц) 1,1×10²

Изобретение предназначено для количественной оценки адгезивных свойств стафилококков, выделенных от человека и объектов окружающей среды, при его бактериологической идентификации и для характеристики его вирулентных свойств in vitro по уровню адгезии к биополимерным молекулам. Исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с иммобилизованными гемопротеинами (миоглобин, гемоглобин) в питательной среде 199 в течение 1 часа, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют количество адгезированных стафилококков путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов. Способ характеризуется хорошей воспроизводимостью результатов, высокой чувствительностью, удобством проведения реакции непосредственно в лунках 96-луночного полистиролового планшета и возможностью проведения экспресс-оценки адгезивной способности штаммов. 3 табл.

Способ определения адгезии Staphylococcus spp. к гемопротеинам, заключающийся в том, что исследуемую культуру стафилококка инкубируют в лунках полистиролового планшета с иммобилизованными гемопротеинами в питательной среде 199 в течение (60±15) мин, далее удаляют неадгезированные бактерии трехкратной отмывкой средой 199 с твин-20 и определяют адгезированные стафилококки путем учета выросших клеток в питательной среде по оптической плотности среды или путем подсчета клеток, высеянных на плотную питательную среду из серии десятикратных разведений, или путем определения активности бактериальных ферментов у адгезированных штаммов.