СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ В ОБРАЗЦЕ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/04 G01N33/487 C12N13/00 C12R1/19 C12M1/34 C12M1/42 

Настоящее изобретение относится к визуализации скрытых инфекций у людей или животных путем проявления подавления обследуемым человеком или животным электромагнитных сигналов, генерируемых микроорганизмом.

Из работ доктора Жака Бенвениста (Jacques Benveniste) и заявки на патент WO 00/17637 известно, как записать и оцифровать характеристики электрического сигнала молекулы, обладающей биологической активностью, после аналого-цифрового преобразования с использованием звуковой платы компьютера. В WO 02/04958 раскрывается применение раскрытого в WO 00/17637 способа для выявления влияния людей, находящихся поблизости от вещества, на коагулирующую или антикоагулирующую активность этого принимающего вещества.

Согласно предшествующему уровню техники (документ WO 09417406) известны способ и устройство, которые используются для передачи биологической активности от исходного так называемого материала-носителя ко второму так называемому материалу - "мишени", не содержащему каких-либо следов указанного материала-носителя и физически отделенному от него, причем "мишень" первоначально не обладает указанной биологической активностью. Способ состоит в (i) воздействии на материал, обладающий интересующей биологической активностью, датчика электрических или электромагнитных сигналов, (ii) усилении испускаемых указанных электромагнитных или электрических сигналов, характеризующих проявление биологической активности, и затем (iii) воздействии на материал-"мишень" источника электрических или электромагнитных сигналов, причем указанный источник соединен с указанным датчиком посредством электрической цепи передачи и усиления, которая предназначена для передачи сигнала, характеризующего биологическую активность, к указанной "мишени".

В предыдущей заявке на французский патент 05/12686, поданной 14 декабря 2005 и пока еще не опубликованной, автор настоящего изобретения описал способ идентификации химических элементов, обладающих биологической активностью, в обычных микроорганизмах путем анализа низкочастотных электромагнитных сигналов, причем указанный способ вносит усовершенствования в предшествующий уровень техники. Указанный способ также относится к биологическому анализу, заключающемуся в записи электромагнитных или электрических "сигнатур", соответствующих известным биохимическим элементам, и в сравнении указанных предварительно записанных "сигнатур" с "сигнатурами" того биохимического элемента, который должен быть охарактеризован. Указанный способ предполагает стадии фильтрации и разбавления для удаления микроорганизмов и клеток, присутствующих в исходном образце, причем наиболее разбавленные растворы генерируют наибольшее количество электрических или электромагнитных сигналов, тогда как наименее разбавленные образцы в большинстве случаев не испускают электрические или электромагнитные сигналы. Автор изобретения также показал, что микроорганизмы различной природы, например, бактерии и вирусы, образуют "наноструктуры", которые сохраняются в водных растворах, и что эти "наноструктуры" испускают электромагнитные сигналы. Указанные "наноструктуры" ведут себя как полимеры, имеющие размер меньше 0,02 мкм для вирусов и меньше 0,1 мкм для бактерий обычного размера, и имеют плотность от 1,12 до 1,30 г/мл.

Способ, описанный в настоящей заявке, основан на удивительном наблюдении, что в отсутствие физического контакта простое воздействие закрытой пробирки, содержащей образец бактериального или вирусного фильтрата, который имеет слабое разбавление и который является отрицательным в отношении испускания электрических или электромагнитных сигналов, подавляет сигналы, генерируемые более разбавленным образцом того же самого фильтрата, первоначально положительного в отношении испускания электрических или электромагнитных сигналов. В настоящей заявке такое подавление неявно упоминается как "подавляющий эффект" или "отрицательный эффект". Аналогично, в настоящей заявке термины "подавлять" и "отрицать" используются неявно и имеют аналогичное значение. Такое наблюдение привело автора изобретения к поиску такого же явления подавления у инфицированного человека. У пациента, страдающего аутоиммунным микроваскулитом инфекционного происхождения, наблюдали, что растворенные образцы его плазмы оказывали подавляющий эффект на разбавленные фильтраты Е.coli, испускающие электромагнитные сигналы (далее ЭМС), что дает возможность предположить, что пациент страдает хронической инфекцией, вызванной этим микроорганизмом или родственным микроорганизмом. Также было показано, что пациент, страдающий микроваскулитом, упомянутым в предыдущем примере, сам подавляет ЭМС, испускаемые в его отфильтрованной и разбавленной плазме, и также подавляет ЭМС, испускаемые образцом отфильтрованной и разбавленной культуры Е.соli, находящейся в закрытой пробирке. В этом случае контакт в течение 5 минут с положительным разбавленным раствором в руке пациента или 10 минут на расстоянии до 50 см является достаточным для наблюдения подавляющего эффекта.

Таким образом, эта способность к подавлению касается обеих испускающих структур собственной плазмы, но они также касаются структур определенных бактерий, что позволяет применять последние в качестве универсальной системы идентификации.

Изобретение, таким образом, позволяет идентифицировать бактериальное или вирусное происхождение болезней, для которых эти микробы еще не были идентифицированы.

Первый объект изобретения относится к способу получения реагентов, предназначенных для проведения теста на выявление микроорганизмов и конкретнее для обнаружения инфекций у людей или животных. В своем самом широком значении способ включает следующие стадии:

а) центрифугирование биологической или искусственной жидкой среды, содержащей выбранный определенный микроорганизм;

б) фильтрация надосадочной жидкости, полученной на стадии (а);

в) получение серии разбавленных образцов, соответствующих увеличению разбавления фильтрата, полученного на стадии (б), до разбавления фильтрата по меньшей мере до 10^-15;

г) воздействие на разбавленные образцы, полученные на стадии (в), электрического, магнитного и/или электромагнитного поля возбуждения;

д) анализ электрических сигналов, обнаруженных с помощью соленоида, и цифровая запись указанного электрического сигнала после аналого-цифрового преобразования указанного сигнала;

е) выбор разбавленных образцов, для которых на стадии (д) получены характеристические электрические сигналы, то есть сигналы, имеющие амплитуду, по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, испускаемые водой и/или имеющие сдвиг частоты к более высоким значениям;

ж) размещение разбавленных образцов, выбранных на стадии (е), в защитных оболочках, которые защищают разбавленные растворы от внешних электромагнитных полей;

з) размещение одинаковых объемов одного из указанных разбавленных образцов со стадии (ж) в двух пробирках: одна пробирка Т1, остающаяся в защитной оболочке, защищающей указанные разбавленные образцы от помех, создаваемых внешними электромагнитными полями, используется в качестве эталонного раствора; и другая пробирка Т2, также помещенная в защитную оболочку, где затем эта пробирка размещается в непосредственной близости от образца или находится в контакте с образцом, который предположительно содержит указанный выбранный определенный микроорганизм.

"Образец, анализируемый на наличие или отсутствие указанного выбранного определенного микроорганизма" означает (i) человека или животное, которые предположительно инфицированы указанным выбранным определенным микроорганизмом, или (ii) биологический образец или биологическую или искусственную жидкость, которые предположительно содержат указанный выбранный определенный микроорганизм, или (iii) пищевую, косметическую или фармацевтическую композицию, которые вероятно содержат указанный выбранный определенный микроорганизм.

Термин "биологическая жидкость" означает любую жидкость, полученную из организма человека или животного, например, кровь, мочу или различные выделения. Термин "искусственная жидкость" означает любую реконструированную жидкость, позволяющую вырастить микроорганизмы, например, различные культуральные среды для бактерий, дрожжей и почв и культуральные среды клеток, инфицированных вирусом.

Другой объект изобретения относится к системе выявления микроорганизмов в образце. Эта система включает:

а) пробирку Т1, которая содержит эталонный образец, испускающий характеристические электромагнитные сигналы. Термин "характеристические сигналы" означает сигналы, амплитуда которых по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, испускаемые водой и/или имеющие сдвиг частоты к более высоким значениям;

б) пробирку Т2, которая содержит образец, испускающий характеристические электромагнитные сигналы, причем указанный образец идентичен образцу, содержащемуся в пробирке Т1;

в) защитную оболочку, защищающую пробирки Т1 и Т2 от очень низкочастотных внешних электромагнитных полей;

г) пробирку Т3, содержащую контрольный раствор, который не испускает электромагнитные сигналы;

д) аппаратуру для приема электромагнитного сигнала.

При обнаружении пробирку Т2 помещают в непосредственной близости от образца X или приводят в контакт с образцом X, который анализируют на наличие или отсутствие выбранного определенного микроорганизма.

Другой объект изобретения относится к способу выявления микроорганизма в образце, который характеризуется тем, что указанный способ включает следующие стадии:

а) образец X, в котором предполагается присутствие микроорганизма, например, Е.coli, помещают в непосредственной близости от образца, например, полученного после стадии (е) способом по любому из пунктов 1-3, причем указанный образец, полученный после стадии (е), представляет собой разбавленный раствор, полученный из фильтрата культуры или биологической среды, которая содержала указанный микроорганизм, который предположительно присутствует в образце X;

б) сравнение электромагнитного сигнала, испускаемого образцом X, помещенным в непосредственной близости от образца, например, определенного после стадии (е), полученного на стадии (а), с электромагнитным сигналом, испускаемым аликвотой того же самого образца, полученного после стадии (е), не подвергавшегося воздействию образца X.

Термин "образец X" означает (i) человека или животное, которые предположительно инфицированы указанным выбранным определенным микроорганизмом, или (ii) биологический образец или биологическую или искусственную жидкость, которая предположительно содержит указанный выбранный определенный микроорганизм, или (iii) пищевую, косметическую или фармацевтическую композицию, которые могут содержать указанный выбранный определенный микроорганизм.

Способы по изобретению позволяют (i) получить реагенты, предназначенные для проведения теста на выявление микроорганизмов, связанных с хроническими заболеваниями, и/или предназначенные для выявления системных скрытых инфекций в условиях, когда требуется быстрый и неинвазивный ответ, например, при обнаружении вируса птичьего гриппа, (ii) идентифицировать одну инфекцию в организме человека или животного.

Когда соответствующий микроорганизм идентифицирован, можно подтвердить присутствие возбудителя путем проведения сверхчувствительных ПЦР (полимеразных цепных реакций) с использованием определенных олигонуклеотидных праймеров такого микроорганизма.

Изобретение будет лучше истолковано после прочтения следующего описания, которое приводит примеры воплощения способов по изобретению, но не ограничивается ими.

Прилагаемые рисунки соответствуют неограничивающему примеру воплощения.

ПРИМЕР 1, СЛАБО РАЗБАВЛЕННАЯ БАКТЕРИАЛЬНАЯ КУЛЬТУРА, НЕ ИСПУСКАЮЩАЯ ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ СИГНАЛЫ И "ОТРИЦАТЕЛЬНАЯ"; ЭЛЕКТРОМАГНИТНЫЕ СИГНАЛЫ, ИСПУСКАЕМЫЕ СИЛЬНО РАЗБАВЛЕННЫМ РАСТВОРОМ ТОЙ ЖЕ САМОЙ КУЛЬТУРЫ

1) Приготовление образцов

Культуру бактерий Escherichia coli (E.coli) в среде LB (бульон Лурия) центрифугируют при 8000 оборотов в минуту в течение 15 минут для удаления клеток. Бактериальную надосадочную жидкость затем отфильтровывают через фильтр PEVD Millipore, имеющий пористость 0,45 мкм, затем фильтрат опять отфильтровывают через фильтр Millipore, имеющий пористость 0,1 мкм.

Из фильтрата полученной культуры Е. coli, который полностью стерилен, получают серию разбавленных образцов путем разбавления фильтрата в 10 раз в воде до получения инъецируемой концентрации 10^-15. Промежуточные разбавленные растворы интенсивно перемешивают с помощью прибора для перемешивания в течение 15 секунд между каждым разбавлением.

Разбавленные образцы помещают в конические пластмассовые пробирки типа «Эппендорф» емкостью 1,5 миллилитра. Объем жидкости, как правило, равен 1 миллилитру.

2) Выбор разбавленных образцов, генерирующих электромагнитные сигналы.

Каждый разбавленный образец анализируют на испускание низкочастотных электромагнитных сигналов.

Способ обнаружения ЭМС включает стадию, которая направлена на преобразование электромагнитного поля от различных разбавленных образцов в сигнал, конкретнее, электрический сигнал, с использованием соленоида, обнаруживающего указанный электромагнитный сигнал.

Преобразование электромагнитного поля от анализируемого разбавленного образца в электрический сигнал достигается следующим образом:

(i) Воздействие на разбавленный образец в процессе проверки поля возбуждения электрической, магнитной и/или электромагнитной природы.

(ii) Анализ обнаруженных электрических сигналов с использованием соленоида и цифровой записи электрического сигнала после аналого-цифрового преобразования указанного сигнала.

(iii) Выбор разбавленных образцов, генерирующих характеристические электрические сигналы; термин "характеристические" означает сигналы, амплитуда которых по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем фоновый шум, испускаемый водой, и/или имеющие сдвиг частоты к более высоким значениям; которые помещают в защитные оболочки, выполненные из материала mumétal®, защищающие указанные разбавленные образцы от помех, которые создаются внешними электромагнитными полями.

Обнаружение сигналов проводят с использованием оборудования, показанного на схеме Фиг.1. Оборудование включает считывающую ячейку 1 с чувствительным соленоидом от 0 до 20000 Гц, размещенную на столе, который изготовлен из изолирующего материала. Указанный соленоид, применяемый на стадии (ii), включает катушку, имеющую сердечник из мягкой стали. Эта катушка имеет сопротивление 300 Ом, внутренний диаметр 6 мм, внешний диаметр 16 мм и длину 6 мм. Магнитный сердечник, изготовленный из мягкой стали, приводят в контакт с внешними стенками пробирки, содержащей анализируемый разбавленный раствор.

Разбавленные образцы, подлежащие считыванию, помещают в конические пластмассовые пробирки 2 типа Эппендорф (торговая марка) емкостью 1,5 миллилитра. Объем жидкости, как правило, равен 1 миллилитру.

Обнаружение характеристического электрического сигнала проводят в течение определенного времени, например, от 1 до 60 с. В настоящем примере каждый образец считывают в течение 6 секунд.

Электрические сигналы, поступающие от соленоида, усиливаются и преобразуются в аналого-цифровые сигналы с использованием интегрированной в компьютер 3 платы захвата сигнала (звуковой карты) 4, включающей аналого-цифровой преобразователь. Аналого-цифровой преобразователь имеет частоту дискретизации, которая в два раза больше максимальной частоты, которую нужно оцифровать, например, 44 кГц.

Цифровой файл, соответствующий электрическому преобразованному сигналу, записывается в память большого объема в виде звукового файла, например, в формате WAV.

Что касается обработки характеристического электрического сигнала, применяют, например, программные средства Matlab и SigView (Торговые марки). Записанный цифровой файл можно подвергнуть цифровой обработке, например, цифровому усилению для калибровки уровня сигнала, фильтрации для устранения нежелательных частот, вычислению спектральной плотности распределения мощности (PSD), затем спектральную плотность распределения мощности обрезают и сохраняют только полосу частот от 140 Гц до 20 кГц (Matlab) или преобразуют в частотные компоненты через Фурье-преобразование (SigView).

3) Оценка подавляющей активности не испускающего слабо разбавленного раствора в отношении испускания электромагнитных сигналов, генерируемых активным разбавленным раствором.

Разбавленные образцы, имеющие характеристические электрические сигналы, представляют собой образцы, разбавленные до 10^-8, 10^-9, 10^-10. Растворы, разбавленные до 10^-2-10^-6, являются отрицательными (Фиг.2).

Закрытую пробирку, содержащую аликвоту раствора Е.coli, разбавленного до 10^-3, и закрытую пробирку, содержащую аликвоту образца Е.coli, разбавленного до 10^-8, в оболочке, окруженной магнитным экраном, изготовленным из материала mumétal®, и оставленную на 24 часа при комнатной температуре, размещают рядом. Параллельно подготавливают контрольную серию. Эта контрольная серия состоит из закрытой пробирки, содержащей аликвоту образца Е.coli, разбавленного до 10^-3, и другой пробирки, содержащей аликвоту образца Е.coli, разбавленного до 10^-8, которые обрабатывают таким же образом, но в отдельных оболочках из материала mumétal®, вдали друг от друга. Нахождение в оболочках из материала mumétal® подавляет возбуждения очень низких (5-100 Гц) частот, но не подавляет возбуждения более высоких частот, которые могут возникать из окружающего электромагнитного шума.

Через 24 часа повторно проводят вышеописанный анализ пробирок, содержащих разбавленные образцы, который показывает, что пробирка, содержащая аликвоту образца, разбавленного до 10^-8, помещенная рядом с пробиркой, содержащей аликвоту образца, разбавленного до 10^-3, больше не испускает электромагнитный сигнал или он гораздо слабее. Напротив, пробирки контрольной серии оставались идентичными; пробирка, содержащая аликвоту образца, разбавленного до 10^-8, которая "защищена" от контакта с пробиркой, содержащей аликвоту образца, разбавленного до 10^-3, остается положительной в отношении испускания электромагнитных сигналов.

Особенно важным аспектом изобретения является то, что наблюдаемый отрицательный эффект является специфическим, что означает, что не испускающий сигнал слабо разбавленный образец и сильно разбавленный образец, испускающий электромагнитный сигнал, должны происходить от одних и тех же разновидностей микроорганизмов.

Таким образом, испускающие разбавленные образцы Е.coli "становятся отрицательными" под действием только не испускающих слабо разбавленных образцов Е.coli и не "становятся отрицательными" под действием не испускающих слабо разбавленных образцов Streptococcus или Staphylococcus. Аналогичным образом, испускающие разбавленные образцы Staphylococcus "становятся отрицательными" под действием только не испускающих слабо разбавленных образцов Staphylococcus и не "становятся отрицательными" под действием не испускающих слабо разбавленных образцов Streptococcus или Е.coli.

ПРИМЕР 2: БЫСТРЫЙ И НЕИНВАЗИВНЫЙ СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ИНФЕКЦИЙ У ЛЮДЕЙ ИЛИ ЖИВОТНЫХ

1) Получение биологических и искусственных жидких образцов, содержащих микроорганизмы.

Препарат крови отбирают, когда пациент, страдающий неврологическими расстройствами после бактериальной инфекции, принимает антикоагулянт, предпочтительно гепарин; культуру, суспендированную в среде LB (бульон Лурия) бактерий Escherichia coli K1 (Е.coli), центрифугируют для удаления клеток. Затем отобранную бактериальную надосадочную жидкость и/или плазму разбавляют до 10^-2 в среде RPMI. Растворы отфильтровывают через фильтр PEVD Millipore 0,45 мкм, затем фильтрат повторно отфильтровывают через фильтр Whatman 0,02 мкм или фильтр Millipore 0,1 мкм.

Из фильтратов плазмы инфицированного человека или животного и культуры Е.coli K1 в ламинарном вытяжном шкафу получают серию разбавленных образцов, которые соответствуют увеличению разбавления среды до 10^-15 путем разбавления в 10 раз в воде с получением инъецируемой концентрации. Промежуточные разбавленные растворы перемешивают интенсивно с помощью перемешивающего устройства в течение 15 секунд между каждым разбавлением.

Затем разбавленные образцы помещают в конические пластмассовые пробирки типа Эппендорф емкостью 1.5 миллилитра. Объем жидкости, как правило, равен 1 миллилитру.

2) Выбор разбавленных образцов, генерирующих электромагнитные сигналы.

Выбор разбавленных образцов, испускающих характеристические сигналы, амплитуда которых по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, и/или которые имеют частоту выше, чем фоновый шум, производят аналогично тому, как описано выше в Примере 1, Раздел 2. Описанный способ, а также материал идентичны описанному выше. Таким образом, способ включает стадию, направленную на преобразование электромагнитного поля, испускаемого различными разбавленными растворами, в сигнал и, конкретнее, в электрический сигнал с использованием соленоида, обнаруживающего указанное электромагнитное поле.

Преобразование электромагнитного поля, испускаемого анализируемым разбавленным раствором, в электрический сигнал выполняют в следующей последовательности:

(i) воздействие на разбавленный анализируемый образец полем возбуждения электрической, магнитной и/или электромагнитной природы;

(ii) анализ обнаруженных электрических сигналов с использованием соленоида и цифровая запись указанного электрического сигнала после аналого-цифрового преобразования указанного сигнала;

(iii) выбор разбавленных образцов, имеющих характеристические электрические поля, где термин "характеристические" означает сигналы, амплитуда которых по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, испускаемые водой и/или имеющие сдвиг частоты к более высоким значениям, которые помещают в защитные оболочки, защищающие указанные разбавленные образцы от помех, создаваемых внешними электромагнитными полями.

3) Оценка подавляющей активности инфицированного человека в отношении испускания электромагнитных сигналов, генерируемых микроорганизмом.

Разбавленные образцы, выбранные на предыдущей стадии (пункт (iii)), полученные после фильтрации плазмы инфицированного человека, среды культуры Е.coli, то есть разбавленные растворы отфильтрованного образца, имеющего характеристический электрический сигнал, помещают в пластмассовые пробирки типа Эппендорф, по 1 мл на пробирку, и хранят при +4°С. Таким образом, разбавленные образцы, испускающие ЭМС, разделены на аликвоты, которые защищены от внешних воздействий путем их размещения в оболочку, защищенную от электромагнитных полей. Предпочтительно, оболочка окружена магнитным экраном, выполненным из материала mumétal®, изолирующим оболочку от полей помех, имеющих очень низкие частоты, испускаемые окружающей средой.

Один из разбавленных образцов, испускающих ЭМС, полученный после фильтрации плазмы инфицированного человека, фильтрат культуры Е.coli, помещают в равных объемах в две пробирки, одну Т1, остающуюся в защитной оболочке, защищающей указанные разбавленные образцы от помех, создаваемых электромагнитными полями, пробирку, которая будет использоваться как эталонный раствор. Другая пробирка Т2 также будет подвергаться воздействию пациента и будет помещена в защитную оболочку, при этом указанная защитная оболочка предпочтительно окружена экраном из материала mumétal®.

На Фиг.2 представлено схематическое изображение стадий, которые следует выполнить при определении подавляющего эффекта. Определение подавляющего эффекта осуществляют следующим образом:

а) пробирку Т1, содержащую эталонный раствор, хранят в оболочке (3), окруженной магнитным экраном, изготовленным из материала mumétal®, таким образом, пробирка Т1 защищена от потенциальных изменений, вызываемых обследуемым человеком (4), тогда как пробирку Т2 подвергают воздействию обследуемого инфицированного человека или животного (4), плазма которого присутствует в пробирках Т1 и Т2, при этом указанный человек держит пробирку Т2 в своей руке (5) в течение определенного промежутка времени, например, 5 минут;

б) пробирку Т2 помещают в оборудование для приема электромагнитных сигналов, предпочтительно, считывающую соленоидную ячейку, как описано ранее в Разделе 2 настоящего примера;

в) электрические сигналы затем усиливают, обрабатывают, преобразуют в аналого-цифровые сигналы, как описано ранее в Разделе 2;

г) указанные аналого-цифровые сигналы возможно делят на гармоники с использованием Фурье-преобразования.

Сравнивают сигналы, соответствующие пробирке Т1, и сигналы, соответствующие пробирке Т2, а также сигналы, соответствующие пробирке Т3, содержащей воду (фоновый шум).

на следующих фигурах показаны результаты, полученные в том случае, когда активный разбавленный раствор получен из плазмы обследуемого инфицированного человека:

- на Фиг.3 показана трехмерная (Matlab) гистограмма электрических сигналов, обнаруженных соленоидом в присутствии пробирки Т3 (фоновый шум);

- на Фиг.4 показана трехмерная гистограмма частотного спектра, обнаруженного соленоидом в присутствии пробирки 1;

- на Фиг.5 показана трехмерная гистограмма частотного спектра, обнаруженного соленоидом в присутствии пробирки 2;

- на Фиг.6 представлен Фурье-анализ (SigView) того же фонового шума (неотфильтрованные гармоники подаваемого электрического тока);

- на Фиг.7 представлен Фурье-анализ сигнала, обнаруженного соленоидом в присутствии пробирки 1;

- На Фиг.8 представлен Фурье-анализ спектра частот, обнаруженного соленоидом в присутствии пробирки 2, которую держит в руках обследуемый человек.

Анализ трехмерной гистограммы соответственно фонового шума (Фиг.3) и сигнала, полученного в присутствии пробирки Т1, содержащей эталонный раствор (Фиг.4), испускающий ЭМС, показывает сдвиг к самым высоким частотам. Напротив, когда анализируют пробирку Т2, содержащую раствор, подвергавшийся воздействию человека (Фиг.5), сдвиг к самым высоким частотам не наблюдается; трехмерная гистограмма, которая показывает сигналы пробирки Т2, аналогична гистограмме, полученной для фонового шума.

Фурье-анализ позитивных частот, генерируемых пробиркой 1 (Фиг.7), показал пики для различных частот. Следующие сигналы имеют следующие частоты в порядке уменьшения интенсивности сигнала: 1000, 2000, 3000, 4100, 5100 и 5500. Напротив, Фурье-анализ в пробирке Т2 показывает результаты, которые аналогичны результатам, полученным для анализа фонового шума, не было отмечено какого-либо значительного пика ни для фонового шума, ни для пробирки Т2.

В заключение отметим, что такой анализ позволяет сделать вывод о том, что обследуемый человек способен подавлять электромагнитные сигналы, испускаемые разбавленным раствором его собственной плазмы.

Аналогичные результаты были получены с эталонным раствором, который является производным Е.coli K1.

Следовательно, такая подавляющая способность касается как испускающих структур его собственной плазмы, так и структур Е.coli, что позволяет предположить, что человек инфицирован возбудителем, производящим наноструктуры, близкие к структурам Е.coli.

ПРИМЕР 3

Осуществили характеристику электромагнитных сигналов (ЭМС) и их основополагающих наноструктур, образуемых некоторыми очищенными бактериями. Mycoplasma pirum, а также наиболее классическая бактерия, E.coli, были использованы в целях анализа. M.pirum представляет собой маленькую бактериальную клетку грушевидной формы, схожей с M.pneumoniae, которую можно вырастить в синтетической обогащенной среде (SP4) (Tully et al., 1977), а также которая размножается на поверхности Т-лимфоцитов человека. Штамм (Вег), использованный в наших экспериментах, был выделен из культуры Т-лимфоцитов, имеющей происхождение из крови явно здорового пациента (Grau et al., 1993). Сильная адгезия микоплазмы к лимфоцитам опосредована специфичным адгезином, ген которого был ранее клонирован и секвенирован авторами (Tham et al., 1994). В качестве первичного источника микоплазм мы использовали надосадочные жидкости культур Т-лимфоцитов инфицированных людей или культур линии Т-клеток опухоли СЕМ. До начала экспериментов все клеточные культуры были сперва протестированы на отсутствие загрязнения M.pirum с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и гнездовой ПЦР. Титры в 10-107 инфекционных единиц/мл M.pirum были быстро получены после 5-6 дней инкубации после преднамеренного заражения обоих типов культур. Фильтрование очищаемой надосадочной жидкости сначала выполняли на 0,45 мкм (450 нм) фильтрах Millipore для удаления остатков и затем на 0,1 мкм (100 нм) фильтрах Millipore or на 0,02 мкм (20 нм) фильтрах Whatman для удаления клеток микоплазмы. Действительно, два 100 нм и 20 нм фильтрата были гарантированно стерильными, когда аликвоты инкубировали несколько недель в среде SP4. Повторный поиск следов ДНК микоплазмы с помощью ПЦР и гнездовой ПЦР с использованием праймеров, специфичных для гена адгезина или для гена рибосомальной 16S, давал неизменно отрицательный результат. Однако, когда фильтраты инкубировали две недели (100 нм фильтрат) или три недели (20 нм фильтрат) с культурой активированных Т-лимфоцитов человека, микоплазма снова появлялась в среде со всеми ее первоначальными характеристиками, наблюдаемыми ранее.

Те же самые фильтраты анализировали сразу после фильтрования для получения электромагнитных волн низкой частоты. Для этого использовали устройство, ранее сконструированное Benveniste и др. (1996; 2003), для обнаружения сигналов, образуемых выделенными молекулами, обладающими биологической активностью. Устройство для захвата и анализа электромагнитных сигналов (ЭМС) включает:

(1) спираль: катушка медной проволоки, сопротивление 300 Ом;

(2) пластиковую закрытую пробирку, содержащую 1 мл раствора для анализа;

(3) усилитель;

(4) компьютер с программным обеспечением.

Кратко, 100 нм или 20 нм фильтраты последовательно разводили 1 в 10 (0,1+0,9) в стерильной воде (для медицинских целей).

Первые два разведения (1/10 и 1/100) сделаны в не содержащей сыворотку среде RPMI для того, чтобы избежать возможного осаждения белков в деионизированной воде.

Каждое разведение делали в 1,5-мл пластиковой пробирке Eppendorf, которую затем плотно закрывали и сильно трясли на аппарате Vortex 15 секунд. Обнаружено, что эта стадия является критической для генерации сигналов. После того как все разведения были сделаны (всего 15-20 десятикратных разведений), закрытые пробирки анализировали одну за одной на электромагнитной спирали, связанной со звуковой картой, которая сама связана с портативным компьютером, предпочтительно питаемым его 12-вольтовой батареей. Каждое излучение регистрировали дважды в течение 6 секунд, усиливали в 500 раз и обрабатывали в различных программах для визуализации сигналов на экране компьютера.

Основные гармонические колебания сложных сигналов анализировали путем использования нескольких программ с преобразованием Фурье.

В каждом эксперименте внутренний шум, образуемый различными частями системы анализа, сначала регистрировали (спираль по отдельности, спираль с пробиркой, заполненной водой). Анализ Фурье показал (Фиг.2(с, d)), что шум преимущественно имел очень низкие частоты, возможно образованные, по меньшей мере, частично, 50/60 Гц электрическим током среды. Использование 12-вольтовой батареи для электропитания компьютера снижало, но не устраняло этот шум, который, как было обнаружено, был необходим для индукции резонансных сигналов от конкретных наноструктур.

Когда разведения фильтрата M.pirum анализировали на излучение волн, первый наблюдаемый очевидный феномен заключался в увеличении общей амплитуды сигналов в определенных разведениях над фоновым шумом (Фиг.2(а)), а также в увеличении частот (Фиг.2(b)). Это изменение устранялось, если анализируемую пробирку помещали внутрь бокса, закрытого листами меди и мю-металла (David, 1998).

Анализ Фурье сигналов M.pirum показал сдвиг в сторону более высоких частот около 1000 Гц и его коэффициент. Профили были идентичны для всех разведений, показывая увеличение амплитуды (Фиг.2(с) и 2(d)). Первые низкие разведения обычно были отрицательными, демонстрируя только фоновый шум. Положительные сигналы обычно получали в разведениях в диапазоне от 10⁵ до 10⁸ или 10¹². Более высокие разведения снова были отрицательными (Фиг.3). Положительные разведения различались в соответствии с типом фильтрования, при этом 20 нм фильтрат был, как правило, положительным в разведениях выше, чем таковые 100 нм фильтрата.

Первоначальная нефильтрованная суспензия была отрицательной во всех разведениях - феномен, наблюдаемый для всех изученных микроорганизмов.

Размер и плотность структур, образующих сигналы в водных разведениях: аликвоту 20 нм фильтрата наносили слоем сверху на градиент сахарозы в воде 5-20% (м/об.) и центрифугировали 2 часа при 35000 об/мин в бакет-роторе. Эти условия были ранее использованы для получения равновесной концентрации интактных клеток микоплазмы, которые давали крутой скачок при плотности 1,21. Фракции собирали со дна пробирок, объединяли 2 к 2 и анализировали на излучение сигнала.

На Фиг.4 показано, что испускающие сигнал структуры были распределены в большом диапазоне плотностей от 1,15 до 1,25 и также имели высокий коэффициент осаждения.

Собранные фракции объединяли 2 к 2, разводили вплоть до D^-15 и анализировали на ЭМС. Полосы показывают фракции, положительные в отношении ЭМС.

Затем проводили исследования с более классической бактерией, E.coli, используя лабораторный штамм К.1.

Культура E.coli в условиях перемешивания (насыщения кислородом) давала 10⁹ бактериальных единиц/мл (измерено спектрометрией). Суспензию затем центрифугировали при 10000 об/мин в течение 15 мин, надосадочную жидкость фильтровали через 450 нм фильтр и получаемый фильтрат снова фильтровали через 100 нм фильтр. Обнаружили, что конечный фильтрат был стерильным при нанесении на питательную агаровую среду и его анализировали на излучение электромагнитных волн, как описано выше для M.pirum.

Разведения, дающие сигнал, обычно находятся в диапазоне от 10^-8 до 10^-12, с профилями для трансформации Фурье сходными с профилями M.pirum (Фиг.5). В одном эксперименте несколько очень высоких разведений были положительными и лежали в диапазоне от 10^-9 до 10^-18. Аликвота неотфильтрованного супернатанта не показала никакого сигнала выше фонового вплоть до 10^-38 разведения, снова показав особую важность стадии фильтрации для генерирования конкретных сигналов. Единственное отличие M.pirum заключалось в том, что никакого сигнала не появлялось после фильтрования через 20 нМ фильтр, предполагая, что структуры, отвечающие за сигнал, удерживались этими фильтрами и, следовательно, имели размер, больший 20 нМ и меньше 100 нМ. Мы задались вопросом, почему низкие разведения, которые с точки зрения логики должны содержать большое число структур, производящих сигнал, оказались «молчащими». Когда мы добавили 0,1 мл негативных низких разведений (например, 10^-3) к 0,4 мл или 0,9 мл положительного разведения (10^-8), последнее стало негативным. Это показало, что «молчащие» низкие разведения являются самоингибиторами, возможно за счет интерференции множественных источников, испускающих ту же длину волны или с незначительным смещением фазы, как радиопомехи. Альтернативно, множество наноструктур может образовывать гель в воде и, тем самым, предотвращать вибрацию. Очевидность гомологичных «взаимных помех»

Затем авторы задались вопросом, возможно ли было генерировать новые испускающие сигнал структуры от пробирки к пробирке, используя перенесение волн. Следующий эксперимент, который повторяли несколько раз, показал, что дело было действительно в этом.

Пробирку-«донор» низкого «молчащего» разведения E.coli (10^-3) помещали бок о бок с пробиркой-получателем положительного «громкого» самого высокого разведения того же раствора (10^-9). Обе пробирки помещали в мю-металловую коробку на 24 часа при комнатной температуре, чтобы пробирки не были подвержены воздействию внешних электромагнитных шумов, и подвергались только воздействию сигналов, генерируемых структурами, присутствующими собственно в пробирках. Пробирки считывали снова с помощью устройства, детектирующего сигнал: пробирка-донор по-прежнему оставалась молчащей, тогда как пробирка-получатель также стала «молчащей».

Более того, когда из пробирки-получателя приготовили дальнейшие разведения (10^-10, 10^-11, 10^-12), эти разведения стали положительными. Эти результаты показывают, что пробирка-получатель стала молчащей вследствие образования избытка новых наноструктур, которые могут испускать сигналы при дальнейшем разведении. Указанный эффект подавляли путем вставки листа мю-металла между двумя пробирками в течение 24-часового периода контакта, что указывало на роль волн низкой частоты в этом явлении.

Испускание схожих электромагнитных сигналов наблюдали также у некоторых других видов бактерий, таких как: Streptococcus В, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeroginosa, Proteus mirabilis, Bacillus subtilis, Salmonella, Clostridium perfringens, все в том же диапазоне разведений, который наблюдали для E.coli, только после фильтрования при 100 нМ (а не при 20 нМ).

Важно, что эффект переноса между двумя пробирками, одной молчащей, другой громкой, наблюдался только если обе содержали разведения одного и того же вида бактерий. Другими словами, пробирка-донор со Staphylococcus могла «говорить» только с пробиркой-получателем, содержащей разведение Staphylococcus и не могла с пробиркой Streptococcus или E.coli, и взаимно.

Указанные результаты показывают, что эффект переноса опосредован видоспецифичными сигналами, частоты которых еще предстоит анализировать. Наконец, в системе E.coli исследовали две другие проблемы. Первая заключается в роли исходного числа бактериальных клеток в индукции фильтруемых продуцирующих сигнал структур. Для этого культуру E.coli в стационарной фазе роста подсчитывали и доводили до 10⁹ клеток/мл и серийные разведения от 100 до 100 разводили до 1 клетки/мл. Каждое разведение фильтровали при 100 нМ и затем анализировали на предмет испускания сигнала.

Неожиданно, диапазон положительных разведений не зависел строго от исходной концентрации клеток E.coli и был при грубом приближении таким же от 10 клеток при разведении вниз до 10 клеток, из чего следует, что одинаковое число наноструктур достигалось при всех концентрациях. Так, парадоксально 10 клеток давали такие же сигналы, что и 109 клеток.

Обработка РНКаз (Promega, 1 мкг/мл, 37 1 час), ДНКаза I (Invitrogen, 10 Ед/мкг ДНК, 37 18 час), лизоцим (Fisher, 1 мг/мл, 37 10 мин), протеаза К (Promega, 0,12 мг/мл, в 1% додецилсульфате натрия, 56 1 час) не подавляет продуцирующую ЭМС активность «громких» разведений и не активирует «молчащие» разведения. ДМСО (10%) и формамид эффекта не давали. Обработка катионами лития, известная как влияющая на водородное связывание молекул воды, была способна уменьшить интенсивность сигналов, тогда как диапазон позитивных разведений остался неизменным.

Изобретение относится к области микробиологии. Центрифугируют биологическую или искусственную жидкую среду, содержащую выбранный определенный микроорганизм. Проводят фильтрацию надосадочной жидкости. Получают серию разбавленных образцов, соответствующих увеличению разбавления фильтрата до 10^-15. Воздействуют на образцы электрическим, магнитным и/или электромагнитным полем возбуждения. Анализируют электрические сигналы, обнаруженные с помощью соленоида, и цифровую запись указанного электрического сигнала после его аналого-цифрового преобразования. Выбирают разбавленные образцы, для которых получены характеристические электрические сигналы, имеющие амплитуду в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, испускаемые водой. Размещают пробирки с разбавленными образцами одинаковых объемов в защитных оболочках для защиты разбавленных растворов от внешних электромагнитных полей. Раствор, содержащийся в пробирке Т1, используют в качестве эталонного раствора. Пробирку Т2 размещают в непосредственной близости от образца или приводят в контакт с образцом X, который предположительно содержит указанный выбранный определенный микроорганизм (например, E.coli). Сравнивают полученные электромагнитные сигналы: подавление сигнала указывает на присутствие микроорганизма в образце X. Группа изобретений позволяет получить реагенты, систему, предназначенные для проведения теста на выявление микроорганизмов в образце, и обнаружить инфекции у людей или животных. 3 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 пр., 8 ил.

1. Способ получения реагентов, предназначенных для проведения теста на выявление микроорганизмов и, особенно, для обнаружения инфекций у людей или животных, характеризующийся тем, что он включает следующие стадии:
а) центрифугирование биологической или искусственной жидкой среды, содержащей выбранный определенный микроорганизм;
б) фильтрация надосадочной жидкости, полученной на стадии (а);
в) получение серии разбавленных образцов, соответствующих увеличению разбавления фильтрата, полученного на стадии (б), до разбавления фильтрата по меньшей мере до 10^-15;
г) воздействие на разбавленные образцы, полученные на стадии (в), электрического, магнитного и/или электромагнитного поля возбуждения;
д) анализ электрических сигналов, обнаруженных с помощью соленоида, и цифровая запись указанного электрического сигнала после аналого-цифрового преобразования указанного сигнала;
е) выбор разбавленных образцов, для которых на стадии (д) получены характеристические электрические сигналы, то есть сигналы, имеющие амплитуду, по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, испускаемые водой и/или имеющие сдвиг частоты к более высоким значениям;
ж) размещение разбавленных образцов, выбранных на стадии (е), в защитных оболочках, которые защищают разбавленные растворы от внешних электромагнитных полей;
з) размещение одинаковых объемов одного из указанных разбавленных образцов со стадии (ж) в двух пробирках: одна пробирка Т1, остающаяся в защитной оболочке, защищающей указанные разбавленные образцы от помех, создаваемых внешними электромагнитными полями, где образец, размещенный в пробирке Т1, используется в качестве эталонного раствора; и другая пробирка Т2, также помещенная в защитную оболочку, где затем эта пробирка размещается в непосредственной близости от образца или находится в контакте с образцом, который предположительно содержит указанный выбранный определенный микроорганизм.

2. Способ по п.1, характеризующийся тем, что указанная биологическая жидкость представляет собой жидкость, полученную из организма человека или животного.

3. Способ по п.1, характеризующийся тем, что искусственная жидкость представляет собой культуральную среду микроорганизма.

4. Способ выявления микроорганизмов в образце, характеризующийся тем, что указанный способ включает следующие стадии:
а) образец X, в котором предполагается присутствие микроорганизма, например, Е.coli, помещают в непосредственной близости от образца, например, полученного на стадии (е) способом по любому из пп.1-3, причем указанный образец, полученный после стадии (е), представляет собой разбавленный раствор, полученный из фильтрата культуры или биологической среды, содержащей указанный микроорганизм, который предположительно присутствует в образце X;
б) сравнение электромагнитного сигнала, испускаемого образцом, определенным на стадии (е) способа по любому из пп.1-3, после того, как он был приведен в контакт с образцом X, как определено на стадии (а), с электромагнитным сигналом, испускаемым аликвотой того же самого образца, полученного после стадии (е) способа по любому из пп.1-3, не подвергавшегося воздействию образца X, где подавление электромагнитного сигнала, испускаемого указанным образцом, который был помещен в присутствие образца X, указывает на присутствие микроорганизма в образце X.

5. Способ по п.4, характеризующийся тем, что указанный образец X представляет собой человека или животное.

6. Способ по п.4, характеризующийся тем, что указанный образец X представляет собой биологический образец.

7. Способ по п.4, характеризующийся тем, что указанный образец X представляет собой пищевую, косметическую или фармацевтическую композицию.

8. Система для выявления микроорганизмов в образце, которая включает в себя:
а) пробирку Т1, содержащую эталонный образец, приготовленный согласно способу по любому из пп.1-3, испускающий характеристические электромагнитные сигналы, амплитуда которых по меньшей мере в 1,5 раза больше, чем сигналы фонового шума, испускаемые водой и/или имеющие сдвиг частоты к более высоким значениям;
б) пробирку Т2, содержащую образец, приготовленный согласно способу по любому из пп.1-3, испускающий характеристические электромагнитные сигналы, причем указанный образец идентичен образцу, содержащемуся в пробирке Т1;
в) защитную оболочку, которая защищает пробирки Т1 и Т2 от внешних электромагнитных полей;
г) пробирку Т3, содержащую контрольный раствор, не испускающий электромагнитные сигналы;
д) оборудование для приема электромагнитных сигналов.

9. Система по п.8, характеризующаяся тем, что оборудование для приема электромагнитных сигналов (д) включает:
- считывающую соленоидную ячейку;
- компьютер, снабженный платой захвата сигнала (звуковой картой), причем указанный компьютер включает по меньшей мере одно программное средство обработки сигналов.

10. Система по п.9, характеризующаяся тем, что считывающая соленоидная ячейка с чувствительностью от 0 до 20000 Гц включает катушку, имеющую сердечник из мягкой стали, при этом указанная катушка имеет сопротивление 300 Ом, диаметр 6 мм, внешний диаметр 16 мм и длину 6 мм.

11. Система по п.8, характеризующаяся тем, что отрицательный контрольный раствор, содержащийся в пробирке ТЗ, представляет собой раствор, используемый для разбавления образцов, что приводит к получению реагентов, содержащихся в пробирках Т1 и Т2.