СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ МИКРООРГАНИЗМОВ ИЗ ТЕСТИРУЕМОГО ОБРАЗЦА ГЕМОКУЛЬТУРЫ Российский патент 2015 года по МПК G01N21/65 C12M1/34 C12Q1/00 

ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА РОДСТВЕННУЮ ЗАЯВКУ

Данная заявка претендует на приоритет в отношении предварительной заявки на патент США №61/110187, озаглавленной "Method and System for Detection and/or Characterization of a Biological Particle in a Sample", поданной 31 октября 2008, которая включена в данную заявку.

ОБЛАСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение относится к способам и системам для обнаружения, изоляции и/или идентификации микроорганизмов в образце. В частности, настоящее изобретение представляет собой прямой способ быстрой характеристики и/или идентификации микроорганизма с помощью рамановских спектроскопических методов.

ПРЕДШЕСТВУЮЩИЙ УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Обнаружение патогенных микроорганизмов в биологических жидкостях следует осуществлять в кратчайшее по возможности время, в частности, в случае септицемии, для которой смертность остается высокой, несмотря на широкий спектр антибиотиков, доступных врачам. Присутствие биологически активных агентов, таких как микроорганизмы, в жидкости организма пациента, в частности в крови, обычно определяют, используя флаконы гемокультуры. Инфекции системы кровообращения связаны с высокой заболеваемостью и смертностью, кроме того, осуществление современных способов диагностики, культивирования с последующей биохимической идентификацией и тестирования на чувствительность к антибиотикам может занять несколько суток. Обычно начинают эмпирическую терапию на основании клинических симптомов, и результаты тестов влияют на клинические решения только тогда, когда первоначальная терапия неудачна. Способность охарактеризовать инфекции кровообращения в пределах первых нескольких часов, предпочтительно в пределах часа, после положительного результата гемокультуры значительно усилило бы клиническую релевантность предоставленной диагностической информации. Для восполнения данной потребности предложены способы молекулярной амплификации, но при данном подходе остаются серьезные проблемы. Сама среда положительной гемокультуры представляет собой естественно амплифицированную популяцию микроорганизмов с потенциалом использования быстрых тестов идентификации (ID).

Традиционные автоматические фенотипические ID тесты, такие как системы Vitek®, Phoenix™ и Microscan®, или ручные фенотипические тесты, такие как API, требуют, чтобы микроорганизмы находились в соответствующей фазе роста и были свободны от мешающих сред и продуктов крови с целью получения надежных результатов. Эти системы используют колонии, выращенные из положительной культуры в течение 18-24 часов на средах в чашках Петри. Однако при стремлении получить более быстрые результаты некоторые лаборатории сообщили об использовании этих систем с микроорганизмами, выделенными из флаконов с положительными гемокультурами. Эти тесты "непосредственно из флакона" пригодны не для всех микроорганизмов (например, не пригодны для грамположительных кокков), не подтверждены изготовителями тестов и, как правило, занимают 3-8 часов для получения результатов. Более быстрые и более широко специфичные тесты крайне необходимы в целях обеспечения врача клинически релевантными результатами в пределах первых нескольких часов, предпочтительно в пределах часа, после положительного результата культуры.

Рамановская спектроскопия обладает потенциалом, предоставляющим возможность идентификации микроорганизмов очень быстро, но может столкнуться с интерференцией от множества высокофлуоресцентных и поглощающих соединений, присутствующих в жидких микробиологических культуральных средах и в клинических образцах, таких как кровь, или в их сочетании. Чаще всего используемые способы выделения микроорганизмов непосредственно из положительной гемокультуры представляют собой двухступенчатое дифференциальное центрифугирование и центрифугирование в пробирке для отделения сыворотки.

Другие описанные способы разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов включают:

В патенте США №4847198 раскрыт способ идентификации микроорганизмов с помощью рамановской спектроскопии с УФ-возбуждением. В соответствии с патентом ′198 бактериальную суспензию приводят в контакт с одной длиной волны в ультрафиолетовом диапазоне. Часть использованной световой энергии поглощается, а часть световой энергии испускается. Испускаемую световую энергию, усиленное резонансом рамановское светорассеяние измеряют как обратнорассеянную энергию. Эту энергию обрабатывают с получением спектров, которые являются характеристическими для бактерий.

Патент США №5938617 автора Vo-Dinh направлен на систему, которая идентифицирует биологические патогены в образце путем возбуждения образца светом при нескольких длинах волн и синхронного снятия интенсивностей испускания. Эта система включает механизмы для воздействия на образец возбуждающим излучением и образования в результате этого испускаемого излучения. Биологические патогены могут представлять собой вирусы и бактерии.

В патенте США №6177266 раскрыт способ хемотаксономической классификации бактерий биомаркерами, специфичными для рода, вида и штамма, созданными с помощью анализа масс-спектрометрии времяпролетной ионизации лазерной десорбцией с использованием матрицы (MALDI-TOF-MS) либо клеточных белковых экстрактов, либо целых клеток.

В патенте США №7070739 представлен способ экстракции, разделения и очистки микроорганизмов, включая вирусы, путем двумерного ультрацентрифугирования непосредственно из жидкостей организма или из гомогенизированной ткани. На первой стадии центрифугирования удаляют все частицы, имеющие более высокую скорость седиментации, чем те из микроорганизмов, которые нужно идентифицировать. На второй стадии ультрацентрифугирования используют зональное центрифугирование в градиенте плотности в жидкостях, заполненных с образованием градиента плотности широкого диапазона, используя специальные рифленые центрифужные пробирки. В соответствии с этим патентом этот метод разделения можно использовать для определения сгруппированных частиц с помощью светорассеяния или флуоресценции, используя красители, специфичные для нуклеиновых кислот, и для выделения сгруппированных частиц в очень малых объемах для характеристики с помощью масс-спектрометрии субъединиц вирусных белков и интактных вирусных частиц, а также с помощью флуоресцентного проточного цитометрического определения как массы нуклеиновых кислот, так и масс фрагментов, образуемых ферментами рестрикции.

В опубликованной заявке на патент США №2007/0037135 раскрыта система для идентификации и количественного определения биологического образца, суспендированного в жидкости. Эта система включает модуль возбуждения флуоресценции по меньшей мере с одним возбуждающим источником света; модуль интерфейса образца, оптически соединенный с модулем возбуждения флуоресценции для расположения биологического образца таким образом, чтобы он получал возбуждающий свет по меньшей мере от одного источника возбуждающего света; модуль испускания флуоресценции, оптически соединенный с модулем интерфейса образца и включающий по меньшей мере одно устройство обнаружения для определения матриц возбуждения-испускания флуоресценции биологического образца; и компьютерный модуль, оперативно соединенный с модулем испускания флуоресценции. Компьютерный модуль осуществляет многофакторный анализ на матрицах возбуждения-испускания флуоресценции биологического образца, чтобы идентифицировать и количественно определить биологический образец. Однако в заявке ′135 не обсуждена идентификация и количественное определение микроорганизмов из комплексных биологических образцов, таких как кровь.

В опубликованной заявке на патент США №2007/0175278 описано использование жидкой культуральной среды для культивирования интересующего образца, включающего, например, кровь, мочу, фекалии, внутривенные катетеры и т.д., линии промышленного производства, водные системы, пищевой продукт, косметическое изделие, фармацевтический препарат и криминалистический образец. Следовательно, микроорганизмы могут быть собраны из жидкой среды способами, известными в данной области техники, например центрифугированием. Затем концентрированные микроорганизмы можно переносить на материал-носитель, необязательно после высушивания, для получения вибрационного спектра. В заявке на патент обсуждены различные способы идентификации и классификации микроорганизмов, включая вибрационную спектроскопию, такую как рамановская спектроскопия.

Однако эти способы имеют несколько недостатков при попытке разделить и охарактеризовать микроорганизмы из комплексных образцов, таких как культуральные среды, содержащие кровь. Полученные в результате препараты микроорганизмов часто содержат загрязняющие эритроциты, тромбоциты, липидные частицы, плазматические ферменты и клеточный детрит, что может вызвать плохие результаты. Эти способы также являются очень трудоемкими и небезопасными за счет стадий, которые могут привести в результате к аэрозольному воздействию потенциально опасных патогенов на пользователя. Необходимы простые, безопасные и надежные способы выделения микроорганизмов из клинических образцов (например, гемокультуры) и других комплексных образцов, которые свободны от этих интерферирующих материалов и совместимы с технологиями быстрой идентификации.

КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ

В настоящем изобретении предложены способы разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов в образце. Эти способы дают возможность характеристики и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем методы предшествующего уровня техники, приводя в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего или подозреваемого на септицемию) и идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов). Стадии, включенные в способы по изобретению, от получения образца для характеристики и/или идентификации микроорганизмов до получения клинически релевантной информации, дающей основания для действий, можно осуществлять в очень короткой временной рамке, например менее чем примерно за 120 минут. Кроме того, способы по изобретению могут быть полностью автоматизированы, уменьшая за счет этого риск обращения с инфекционными материалами и/или зараженными образцами.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма из тестируемого образца, включающий:

(a) получение тестируемого образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) селективный лизис клеток не микроорганизмов в тестируемом образце с получением лизированного образца;

(c) разделение микроорганизмов от других компонентов лизированного образца с образованием изолированного образца микроорганизмов;

(d) исследование изолированных микроорганизмов с использованием одного или более чем одного метода рамановской спектроскопии с получением спектроскопических измерений данного микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения спектроскопических измерений со снятыми спектроскопическими измерениями или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма из гемокультуры, включающий:

(a) получение образца из гемокультуры, о которой известно, что она содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) селективный лизис клеток не микроорганизмов в образце с получением лизированного образца;

(c) наслаивание лизированного образца на плотностный буфер в герметичном контейнере;

(d) центрифугирование контейнера для разделения микроорганизмов от других компонентов образца и образования осадка микроорганизмов;

(e) спектроскопическое исследование изолированных микроорганизмов in situ с использованием одного или более чем одного метода рамановской спектроскопии с получением спектроскопических измерений данного микроорганизма; и

(f) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения спектроскопических измерений со снятыми спектроскопическими измерениями или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма, включающий:

(a) получение тестируемого образца, о котором известно, что он содержит или может содержать микроорганизмы;

(b) помещение тестируемого образца в герметичный контейнер;

(c) разделение микроорганизмов in situ от других компонентов тестируемого образца с образованием изолированного образца микроорганизмов из микроорганизмов в герметичном контейнере;

(d) спектроскопическое исследование изолированных микроорганизмов in situ с использованием одного или более чем одного метода рамановской спектроскопии с получением спектроскопических измерений данного микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения спектроскопических измерений со снятыми спектроскопическими измерениями или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов.

В одной форме осуществления разделение осуществляют путем наслаивания тестируемого образца на плотностный буфер в герметичном контейнере (например, герметично закрытом контейнере) и центрифугирование контейнера для осаждения микроорганизмов, в то время как среда тестируемого образца остается сверху плотностного буфера. В другой форме осуществления контейнер имеет оптическое окно на дне и/или на стенках, так что осадок микроорганизмов может быть исследован спектроскопическим путем. Микроорганизмы можно идентифицировать путем сравнения спектра осадка со спектром или спектрами или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов. Способность идентифицировать микроорганизмы непосредственно в осадке без дополнительных манипуляций значительно улучшает безопасность идентификации микроорганизмов.

В одной форме осуществления спектроскопическое исследование основано на колебательной структуре составляющих молекул, которые содержат микроорганизмы. В других формах осуществления спектроскопическое исследование основано отчасти на сигналах, полученных от дополнительных агентов, которые добавляют в процессе способов по изобретению, и которые взаимодействуют со специфичными микроорганизмами или группами микроорганизмов.

В другой форме осуществления способы дополнительно включают стадию выделения осадка микроорганизма, ресуспендирования микроорганизма и проведения дополнительных тестов идентификации или характеристики (например, лекарственной устойчивости, факторов вирулентности, антибиограммы).

Настоящее изобретение более подробно объяснено в графических материалах данной заявки и в приведенном ниже описании.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ГРАФИЧЕСКИХ МАТЕРИАЛОВ

На фиг. 1 показаны рамановские спектры различных микроорганизмов, обработанных и выделенных из гемокультуры.

На фиг. 2 показаны рамановские спектры 13 изолятов S. aureus, выделенных непосредственно из культуральной среды гемокультуры.

На фиг. 3 показаны рамановские спектры, снятые через герметичный сепаратор, в присутствии и в отсутствие микроорганизмов.

На фиг. 4 показаны рамановские спектры осадка микроорганизма, выделенного из гемокультуры, снятые через герметичный сепаратор, фон вычтен.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Настоящее изобретение может быть осуществлено в различных формах и не должно рассматриваться как ограниченное формами осуществления, изложенными в данной заявке. Вероятнее, эти формы осуществления представлены, чтобы данное описание было более тщательным и полным и полностью передавало объем изобретения специалистам в данной области техники. Например, признаки, проиллюстрированные в отношении одной формы осуществления, могут быть включены в другие формы осуществления, а признаки, проиллюстрированные в отношении конкретной формы осуществления, могут быть удалены из этой формы осуществления. Кроме того, различные изменения и дополнения к предложенным здесь формам осуществления, которые не отклоняются от настоящего изобретения, будут очевидны специалистам в данной области техники в свете настоящего описания.

Если не определено иное, все технические и научные термины, используемые в данной заявке, имеют то же значение, которое общепринято понимают обычные специалисты в области техники, к которой принадлежит данное изобретение. Терминология, используемая в описании изобретения в данной заявке, предназначена только для целей описания конкретных форм осуществления и не предназначена для ограничения изобретения.

Определения

Как используют в данной заявке, единственное число может означать одно или более чем одно. Например, "клетка" может означать единственную клетку или множество клеток.

Как используют в данной заявке, "и/или" также относится к любой или ко всем возможным комбинациям одного или более чем одного из сопутствующих перечисленных пунктов и включает их, а также отсутствие комбинаций при интерпретации в альтернативе ("или").

Кроме того, термин "примерно", как используют в данной заявке по отношению к измеримому значению, такому как количество соединения или агента по данному изобретению, доза, время, температура и тому подобное, подразумевают как охватывающий вариации ±20%, ±10%, ±5%, ±1%, ±0,5% или даже ±0,1% указанного количества.

Как используют в данной заявке, термин "микроорганизм" предназначен для включения организмов, которые являются в целом одноклеточными, которые можно размножать и держать в лаборатории, включающие, но не ограниченные ими, грамположительные или грамотрицательные бактерии, дрожжи, плесневые грибы, паразиты и молликуты. Не ограничивающие примеры грамотрицательных бактерий по данному изобретению включают бактерии следующих родов: Pseudomonas, Escherichia, Salmonella, Shigella, Enterobacter, Klebsiella, Serratia, Proteus, Campylobacter, Haemophilus, Morganella, Vibrio, Yersinia, Acinetobacter, Stenotrophomonas, Brevundimonas, Ralstonia, Achromobacter, Fusobacterium, Prevotella, Branhamella, Neisseria, Burkholderia, Citrobacter, Hafhia, Edwardsiella, Aeromonas, Moraxella, Brucella, Pasteurella, Providencia и Legionella. He ограничивающие примеры грамположительных бактерий по данному изобретению включают бактерии следующих родов: Enterococcus, Streptococcus, Staphylococcus, Bacillus, Paenibacillus, Lactobacillus, Listeria, Peptostreptococcus, Propionibacterium, Clostridium, Bacteroides, Gardnerella, Kocuria, Lactococcus, Leuconostoc, Micrococcus, Mycobacteria и Corynebacteria. He ограничивающие примеры дрожжей и плесневых грибов по данному изобретению включают дрожжи и плесневые грибы из следующих родов: Candida, Cryptococcus, Nocardia, Penicillium, Alternaria, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium, Saccharomyces и Trichosporon. He ограничивающие примеры паразитов по данному изобретению включают паразиты из следующих родов: Trypanosoma, Babesia, Leishmania, Plasmodium, Wucheria, Brugia, Onchocerca и Naegleria. He ограничивающие примеры молликутов по данному изобретению включают молликуты из следующих родов: Mycoplasma и Ureaplasma.

В одной форме осуществления, как более подробно описано здесь, микроорганизмы из образца или из ростовой среды можно разделить и исследовать, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизм, присутствующий в образце. Как используют в данной заявке, термин "разделить" подразумевают как включающий любой образец микроорганизмов, который извлечен, сконцентрирован или иначе удален из его исходного состояния или из ростовой или культуральной среды. Например, в соответствии с данным изобретением микроорганизмы могут быть отделены (например, в виде выделенного образца) от не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, которые иначе могут мешать характеристике и/или идентификации. Этот термин может включать слой микроорганизмов, проложенный между двумя другими слоями, например микроорганизмы, собранные наверху плотностного буфера высокой плотности после центрифугирования, или слой микроорганизмов, собранный на твердой поверхности (например, на мембране фильтра). Этот термин может также включать коллекцию микроорганизмов, которая частично прошла через слой (например, плотностный буфер). Как таковой, выделенный образец микроорганизмов может включать любую коллекцию или слой микроорганизмов и/или их компонентов, которые являются более концентрированными, либо иначе отделенными от исходного образца, и могут находиться в диапазоне от тесно упакованного плотного комка микроорганизмов до диффузного слоя микроорганизмов. Компоненты микроорганизмов, которые могут содержаться в выделенной форме или в образце, включают без ограничения пили, флагеллы, фимбрии и капсулы в любой комбинации. Компоненты не микроорганизмов, которые отделяют от микроорганизмов, могут включать клетки не микроорганизмов (например, клетки крови и/или клетки другой ткани) и/или любые их компоненты.

Еще в одной другой форме осуществления, как более подробно описано здесь, микроорганизмы из образца или из ростовой среды могут быть изолированы и исследованы, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизм, присутствующий в образце. Как используют в данной заявке, термин "изолированный" предназначен для включения любого образца микроорганизмов, который по меньшей мере частично очищен от его исходного состояния или от ростовой или культуральной среды и любых не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, содержащихся в ней. Например, в соответствии с данным изобретением микроорганизмы могут быть изолированы (например, в виде изолированного образца) от не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, которые иначе могут мешать характеристике и/или идентификации. Компоненты не микроорганизмов, которые отделяют от микроорганизмов, могут включать клетки не микроорганизмов (например, клетки крови и/или клетки другой ткани) и/или любые их компоненты.

Еще в одной другой форме осуществления, как более подробно описано здесь, микроорганизмы из образца или из ростовой среды могут быть осаждены и исследованы, чтобы охарактеризовать и/или идентифицировать микроорганизм, присутствующий в образце. Как используют в данной заявке, термин "осадок" предназначен для включения любого образца микроорганизмов, который спрессован или депонирован в массе микроорганизмов. Например, микроорганизмы из образца можно спрессовать или депонировать в массе на дне пробирки центрифугированием или другими способами, известными в данной области техники. Этот термин включает коллекцию микроорганизмов (и/или их компонентов) на дне и/или стенках контейнера после центрифугирования. Компоненты микроорганизмов, которые могут содержаться в осадке, включают без ограничения пили, флагеллы, фимбрии и капсулы в любой комбинации. В соответствии с данным изобретением микроорганизмы могут быть осаждены (например, в виде, по существу, очищенного осадка микроорганизмов) из не микроорганизмов или компонентов не микроорганизмов, которые иначе могут мешать характеристике и/или идентификации. Компоненты не микроорганизмов, которые отделяют от микроорганизмов, могут включать клетки не микроорганизмов (например, клетки крови и/или клетки другой ткани) и/или любые их компоненты.

Как используют в данной заявке, термин "плотностный буфер" относится к раствору, имеющему однородную плотность по всему раствору.

В настоящем изобретении предложены способы изоляции, характеристики и/или идентификации микроорганизмов в образце. Кроме того, этот способ может быть, в частности, полезен для разделения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов из комплексных образцов, таких как культуральная среда, содержащая кровь. Быстрые способы также дают возможность для характеристики и/или идентификации микроорганизмов быстрее, чем методы предшествующего уровня техники, что приводит в результате к более быстрым диагнозам (например, у субъекта, страдающего или подозреваемого на септицемию) и характеристике/идентификации зараженных материалов (например, пищевых продуктов и фармацевтических препаратов). Стадии, вовлеченные в способы по изобретению, от получения образца до характеристики/идентификации микроорганизмов, можно осуществлять в очень короткой временной рамке с получением клинически релевантной информации, дающей основания для действий. В некоторых формах осуществления способы по изобретению можно осуществлять менее чем примерно за 120 минут, например менее чем примерно за 110, 100, 90, 80, 70, 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 минуту. Огромная скорость способов по изобретению представляет усовершенствование по сравнению со способами предшествующего уровня техники. Эти способы можно применять для характеристики и/или идентификации любого микроорганизма, как описано в данной заявке. В одной форме осуществления микроорганизм представляет собой бактерию. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой дрожжи. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой плесневый гриб. В следующей форме осуществления микроорганизм представляет собой паразит. В другой форме осуществления микроорганизм представляет собой молликут. Кроме того, способы по изобретению могут быть полностью автоматизированы, уменьшая за счет этого риск обращения с инфекционными материалами и/или заражения образцов.

В одном аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма из тестируемого образца, включающий:

(a) получение тестируемого образца, известного как содержащий, или который может содержать микроорганизмы;

(b) селективный лизис клеток не микроорганизмов в тестируемом образце с получением лизированного образца;

(c) разделение микроорганизмов от других компонентов тестируемого образца с образованием изолированного образца микроорганизмов;

(d) исследование изолированных микроорганизмов с использованием одного или более чем одного метода рамановской спектроскопии с получением спектроскопических измерений данного микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения спектроскопических измерений со снятыми спектроскопическими измерениями или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов.

В другом аспекте настоящее изобретение направлено на способ характеристики и/или идентификации микроорганизма, включающий:

(a) получение тестируемого образца, известного как содержащий, или который может содержать микроорганизмы;

(b) помещение тестируемого образца в герметичный контейнер;

(c) разделение микроорганизмов in situ от других компонентов тестируемого образца с образованием изолированного образца микроорганизмов из микроорганизмов в герметичном контейнере;

(d) спектроскопическое исследование изолированных микроорганизмов in situ с использованием одного или более чем одного метода рамановской спектроскопии с получением спектроскопических измерений данного микроорганизма; и

(e) характеристику и/или идентификацию данного микроорганизма в изолированном образце путем сравнения спектроскопических измерений со снятыми спектроскопическими измерениями или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов.

В другой форме осуществления изобретения способы включают выделение осадка микроорганизмов, образованного во время стадии отделения, или их части из разделительного контейнера перед исследованием микроорганизмов. Например, после образования осадка жидкости можно отсосать от осадка, а осадок ресуспендировать в подходящей среде (например, в среде, в которой микроорганизмы жизнеспособны). Ресуспендированные микроорганизмы можно извлечь из разделительного контейнера. Затем микроорганизмы можно исследовать для характеристики и/или идентификации, например, в суспензии или после того, как они повторно осаждены. В других формах осуществления ресуспендированные микроорганизмы можно исследовать в разделительном контейнере, например, в суспензии или после того, как они повторно осаждены. В следующей форме осуществления микроорганизмы, выделенные из осадка, можно использовать непосредственно для дальнейшего исследования (например, рамановской спектроскопией, масс-спектроскопией) без ресуспендирования.

Образцы

Образцы, которые можно тестировать (то есть тестируемый образец) способами по изобретению, включают как клинические, так и неклинические образцы, в которых присутствие и/или рост микроорганизма существует, либо его можно подозревать, а также образцы материалов, которые обычно или время от времени тестируют на присутствие микроорганизмов. Количество используемого образца может значительно варьировать в зависимости от универсальности и/или чувствительности способа. Получение образца можно осуществить с помощью любого набора методик, известных специалистам в данной области техники, хотя одно из преимуществ настоящего изобретения состоит в том, что комплексные типы образцов, такие как, например, кровь, жидкости организма и/или другие непрозрачные вещества, можно тестировать непосредственно, используя систему небольшой обработки или без обширной обработки. В одной форме осуществления образец берут из культуры. В другой форме осуществления образец берут из микробиологической культуры (например, гемокультуры). В другой форме осуществления образец подозревают на наличие в нем микроорганизмов, либо оно известно.

Клинические образцы, которые можно тестировать, включают любой тип образца, типично тестируемого в клинических или исследовательских лабораториях, включая, но не ограничиваясь ими, кровь, сыворотку, плазму, фракции крови, суставную жидкость, мочу, семенную жидкость, слюну, фекалии, цереброспинальную жидкость, содержимое желудка, вагинальные секреции, гомогенаты тканей, пунктаты костного мозга, костные гомогенаты, мокроту, пунктаты, мазки и промывные воды мазков, другие жидкости организма и тому подобное. В другой форме осуществления клинический образец можно культивировать и использовать образец культуры.

Настоящее изобретение находит применение как в исследованиях, так и в ветеринарных и медицинских областях применения. Подходящими субъектами, от которых могут быть получены клинические образцы, обычно являются субъекты млекопитающих, но может быть и любое животное. Термин "млекопитающее", как используют в данной заявке, включает, но не ограничен ими, людей, приматов, не являющихся человеком, крупный рогатый скот, овец, коз, свиней, лошадей, кошек, собак, кроликов, грызунов (например, крыс или мышей) и т.д. Субъекты-люди включают новорожденных, детей, подростков, взрослых и пожилых субъектов. Субъекты, от которых могут быть получены образцы, включают без ограничения млекопитающих, птиц, рептилий, амфибий и рыб.

Неклинические образцы, которые можно тестировать, также включают вещества, охватывающие, но не ограниченные ими, пищевые продукты, напитки, фармацевтические препараты, косметические изделия, воду (например, питьевую воду, не питьевую воду и сточные воды), балласты морской воды, воздух, почву, бытовые стоки, растительный материал (например, семена, листья, стебли, корни, цветы, плоды), препараты крови (например, тромбоциты, сыворотку, плазму, фракции лейкоцитов и т.д.), образцы донорских органов или тканей, образцы биологического оружия и тому подобное. Способ также особенно хорошо пригоден для тестирования в реальном времени для мониторинга уровней заражения, контроля процесса, контроля качества и тому подобного в промышленных условиях. В другой форме осуществления неклинический образец можно культивировать и использовать образец культуры.

В одной форме осуществления изобретения образцы получают от субъекта (например, пациента), страдающего или подозреваемого на инфекцию микроорганизмов. В одной форме осуществления субъект страдает или подозреваем на септицемию, например, бактериемию или фунгемию. Образец может представлять собой образец крови непосредственно от субъекта. Образец может быть взят из гемокультуры, выращенной из образца крови пациента, например, гемокультуры BacT/ALERT®. Образец гемокультуры может быть взят из положительной гемокультуры, например, гемокультуры, которая показывает присутствие микроорганизма. В некоторых формах осуществления образец берут из положительной гемокультуры в пределах короткого времени после того, как она оказывается положительной, например в пределах примерно 6 часов, например в пределах примерно 5, 4, 3 или 2 часов или в пределах примерно 60 минут, например примерно 55, 50, 45, 40, 35, 30, 25, 20, 15, 10, 5, 4, 3, 2 или 1 минуты. В одной форме осуществления образец берут из культуры, в которой микроорганизмы находятся в log фазе роста. В другой форме осуществления образец берут из культуры, в которой микроорганизмы находятся в стационарной фазе.

Настоящее изобретение обеспечивает высокую чувствительность обнаружения, характеристики и/или идентификации микроорганизмов. Это дает возможность обнаружения, характеристики и/или идентификации без первоначальной необходимости в прохождении стадий изоляции микроорганизмов путем выращивания их на твердой или полутвердой среде и отбора выросших колоний. Таким образом, в одной форме осуществления изобретения образец не является образцом из колонии микроорганизма (например, бактерии, дрожжей или плесневого гриба), выращенной на твердой или полутвердой поверхности.

Объем образца должен быть достаточно большим, чтобы получить изолированный образец микроорганизмов или осадок микроорганизмов, который можно исследовать после осуществления стадии отделения/изоляции способов по изобретению. Соответствующие объемы будут зависеть от источника образца и предполагаемого уровня микроорганизмов в образце. Например, положительная гемокультура будет содержать более высокий уровень микроорганизмов на объем, чем образец питьевой воды, подлежащий тестированию на заражение, поэтому меньший объем среды гемокультуры может быть необходим по сравнению с образцом питьевой воды. Как правило, размер образца может составлять менее чем примерно 50 мл, например, менее чем примерно 40, 30, 20, 15, 10, 5, 4, 3 или 2 мл. В некоторых формах осуществления размер образца может составлять примерно 1 мл, например, примерно 0,75, 0,5 или 0,25 мл. В некоторых формах осуществления, в которых разделение осуществляют в микромасштабе, размер образца может составлять менее чем примерно 200 мкл, например менее чем примерно 150, 100, 50, 25, 20, 15, 10 или 5 мкл. В некоторых формах осуществления (например, когда ожидают, что образец содержит малое число микроорганизмов) размер образца может составлять примерно 100 мл или более, например примерно 250, 500, 750 или 1000 мл или более.

Необязательная стадия лизиса

В некоторых формах осуществления после получения образца следующая стадия в способе по настоящему изобретению состоит в селективном лизисе нежелательных клеток, которые могут присутствовать в образце, например клеток крови и/или клеток ткани. Клетки можно подвергать лизису, чтобы дать возможность отделить микроорганизмы от других компонентов образца. Отделение микроорганизмов от других компонентов предотвращает интерференцию во время стадии исследования. Если не ожидают, что клетки не микроорганизмов присутствуют в образце, или не ожидают, что они интерферируют на стадии исследования, нет необходимости проводить стадию лизиса. В одной форме осуществления клетками, подлежащими лизису, являются клетки не микроорганизмов, которые присутствуют в образце, но клетки микроорганизмов, которые могут присутствовать в образце, не подвергаются лизису. Однако в некоторых формах осуществления селективный лизис определенных классов микроорганизмов может быть желателен и, следовательно, его можно осуществлять в соответствии со способами, как описанными в данной заявке, так и хорошо известными в данной области техники. Например, класс нежелательных микроорганизмов можно подвергать селективному лизису, например, дрожжи подвергаются лизису, тогда как бактерии не подвергаются, или наоборот. В другой форме осуществления желательные микроорганизмы подвергают лизису с целью отделения конкретного субклеточного компонента микроорганизмов, например клеточных мембран или органелл. В одной форме осуществления все клетки не микроорганизмов подвергают лизису. В других формах осуществления часть клеток не микроорганизмов подвергают лизису, например, достаточное количество клеток, чтобы предотвратить интерференцию на стадии исследования. Лизис клеток можно осуществлять любым способом, известным в данной области техники как эффективный для селективного лизиса клеток без лизиса или с лизисом микроорганизмов, включающим без ограничения добавление раствора для лизиса, разрушение ультразвуком, осмотический шок, химическую обработку и/или их комбинацию.

Раствор для лизиса является таким, чтобы обладать способностью к лизису клеток, например клеток не микроорганизмов (например, путем солюбилизации мембран эукариотических клеток) и/или клеток микроорганизмов. В одной форме осуществления раствор для лизиса может содержать один или более чем один детергент, один или более чем один фермент или комбинацию одного или более чем одного детергента и одного или более чем одного фермента, и может, кроме того, включать дополнительные агенты. В одной форме осуществления детергент может представлять собой не денатурирующий литический детергент, такой как Тритон® Х-100, Тритон® X-100-R, Тритон® Х-114, NP-40, Genapol® C-100, Genapol® Х-100, Igepal® СА 630, Arlasolve™ 200, Brij® 96/97, CHAPS (3-[(3-холанидопропил)диметиламмоний]-1-пропансульфонат), октил-пара-D-глюкопиранозид, сапонин и нонаэтиленгликоля монододециловый эфир (C₁₂E₉, полидоценол). Необязательно можно включать денатурирующие литические реагенты, такие как додецилсульфат натрия, N-лаурилсаркозин, деоксихолат натрия, желчные соли, гексадецилтриметиламмония бромид, SB3-10, SB3-12, амидосульфобетаин-14 и C7BzO. Необязательно можно также включать солюбилизаторы, такие как Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Твин® 80, Твин® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, не детергентные сульфобетаины (NDSB 201), амфиполы (PMAL-C8) и метил-β-циклодекстрин. Типично не денатурирующие детергенты и солюбилизаторы используют при концентрациях выше их критической концентрации мицеллообразования (ККМ), тогда как денатурирующие детергенты можно добавлять при концентрациях ниже их ККМ. Например, не денатурирующие литические детергенты можно использовать при концентрации от примерно 0,010% до примерно 10%, например, от примерно 0,015% до примерно 1,0%, например от примерно 0,05% до примерно 0,5%, например, от примерно 0,10% до примерно 0,30% (конечная концентрация после разведения образцом). В другой форме осуществления могут быть предпочтительны детергенты, представляющие собой полиоксиэтиленовый детергент. Полиоксиэтиленовый детергент может содержать структуру C_12-18/E_9-10, где C_12-18 обозначает длину углеродной цепи от 12 до 18 атомов углерода, а E_9-10 означает от 9 до 10 оксиэтиленовых гидрофильных концевых групп. Например, полиоксиэтиленовый детергент может быть выбран из группы, состоящей из Brij 97, Bnj 96V, Genapol® C-100, Genapol® X-100, нонаэтиленгликоля монододецилового эфира (полидоценола) или их комбинации.

Ферменты, которые можно использовать в растворах для лизиса, включают без ограничения ферменты, которые расщепляют нуклеиновые кислоты и другие вещества, загрязняющие мембрану (например, протеиназу XXIII, ДНКазу, нейраминидазу, полисахаридазу, Glucanex® и Pectinex®). Другие добавки, которые можно использовать, включают без ограничения восстанавливающие агенты, такие как 2-меркаптоэтанол (2-Ме) или дитиотрейтол (DTT), и стабилизирующие агенты, такие как магний, пируват, а также увлажнители. Раствор для лизиса может быть забуферен при любом pH, который пригоден для лизиса желаемых клеток и зависит от множества факторов, включающих без ограничения тип образца, клетки, подлежащие лизису, и используемый детергент. В некоторых формах осуществления pH может находиться в диапазоне от примерно 2 до примерно 13, например от примерно 6 до примерно 13, например, от примерно 8 до примерно 13, например, от примерно 10 до примерно 13. Буферы с подходящим pH включают любой буфер, способный к поддержанию pH в желаемом диапазоне, например, от примерно 0,05 М до примерно 1,0 М CAPS.

В одной форме осуществления образец и раствор для лизиса смешивают, а затем инкубируют в течение достаточного времени для того, чтобы произошла солюбилизация клеточных мембран, например, в течение 1, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 или 60 секунд или примерно 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 или 20 минут или дольше, например, от примерно 1 секунды до примерно 20 минут, от примерно 1 секунды до примерно 5 минут или от примерно 1 секунды до примерно 2 минут. Время инкубации зависит от силы раствора для лизиса, например, от концентрации детергента и/или ферментов. Как правило, более мягкие буферы для лизиса потребуют больше времени и большего разведения образца, чтобы полностью солюбилизировать клетки не микроорганизмов. Сила раствора для лизиса может быть выбрана на основе микроорганизмов, известных или подозреваемых на нахождение в образце. Для микроорганизмов, которые более чувствительны к лизису, можно использовать мягкий раствор для лизиса. Лизис может происходить при температуре от примерно 2°C до примерно 45°C, например, от примерно 15°C до примерно 40°C, например, от примерно 30°C до примерно 40°C. В одной форме осуществления раствор для лизиса можно набрать в шприц, а затем образец можно засасывать в шприц, так чтобы смешивание и инкубация происходили в шприце.

В некоторых формах осуществления как условия лизиса (например, раствор или время инкубации), так и стадии разделения и/или исследования могут быть достаточны для уничтожения некоторых или всех микроорганизмов в образце. Способы по настоящему изобретению в высокой степени универсальны и не требуют, чтобы все микроорганизмы были живыми, чтобы происходило выделение и идентификация. В некоторых формах осуществления некоторые или все микроорганизмы могут быть мертвыми, где их гибель произошла до, во время и/или после осуществления стадий способов.

Дополнительные подробности и описание буферов для лизиса, рассматриваемых в практике данного изобретения, раскрыты в совместно поданной заявке на патент США, серийный №12/589,929, поданной 30 октября 2009, озаглавленной "Methods for Isolation and Identification of Microorganisms", содержание которой включено в данную заявку посредством ссылки.

Стадия разделения

Следующей стадией в способе по настоящему изобретению (например, стадией после того, как образец лизирован, если проводят стадию лизиса) является стадия разделения. Стадию разделения можно осуществлять, чтобы разделить микроорганизмы от других компонентов образца (например, не микроорганизмов или их компонентов) и сконцентрировать микроорганизмы в осадке, который можно исследовать в целях идентификации и характеристики. Разделение не обязательно должно быть полным, то есть не требуется, чтобы произошло 100% разделение. Требуется только то, чтобы разделение микроорганизмов от других компонентов образца было достаточным, чтобы дать возможность исследовать микроорганизмы без значительной интерференции со стороны других компонентов. Например, разделение может привести в результате к осадку микроорганизмов, который является чистым по меньшей мере на 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 95, 96, 97, 98 или 99% или выше.

В одной форме осуществления разделение осуществляют посредством стадии центрифугирования, на которой образец (например, лизированный образец) помещают сверху на плотностный буфер в разделительном контейнере, и контейнер центрифугируют в условиях, которые дают возможность изолировать микроорганизмы (например, микроорганизмы могут образовать осадок на дне и/или на стенках контейнера). В соответствии с данной формой осуществления другие компоненты образца (например, не микроорганизмы или их компоненты, которые могут присутствовать в среде образца) остаются сверху на плотностном буфере или внутри верхней части плотностного буфера. Обычно для стадии разделения можно использовать любой известный контейнер. В одной форме осуществления разделительный контейнер представляет собой сепаратор, раскрытый в родственной заявке на патент, серийный №12/589,969, поданной 30 октября 2009, озаглавленной "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms". Данная стадия разделения изолирует микроорганизмы от материалов в образце, таких как среда, клеточный детрит и/или другие компоненты, которые могли бы интерферировать при исследовании микроорганизмов (например, за счет собственной флуоресценции). В одной форме осуществления плотностный буфер также служит для разделения живых микроорганизмов и мертвых микроорганизмов (которые не проходят через плотностный буфер). В другой форме осуществления плотностный буфер не содержит плотностного градиента ни до, ни после центрифугирования. Иными словами, разделительный контейнер не центрифугируют в течение достаточного количества времени и/или с достаточным ускорением для материала, образующего плотностный буфер, чтобы создать плотностной градиент.

Плотность плотностного буфера выбрана таким образом, чтобы микроорганизмы в образце проходили через этот плотностный буфер, тогда как другие компоненты образца (например, культуральная среда гемокультуры, клеточный детрит) оставались сверху на плотностном буфере или не проходили весь путь через плотностный буфер. Плотностный буфер может быть также выбран таким образом, чтобы разделить живые микроорганизмы (которые проходят через плотностный буфер) и мертвые микроорганизмы (которые не проходят через плотностный буфер). Подходящие плотности будут зависеть от материала, используемого в плотностном буфере, и от образца, подлежащего разделению. В одной форме осуществления плотность плотностного буфера находится в интервале от примерно 1,025 до примерно 1,120 г/мл, например от примерно 1,030 до примерно 1,070 г/мл, от примерно 1,040 до примерно 1,060 г/мл или в любом интервале от примерно 1,025 до примерно 1,120 г/мл. В другой форме осуществления плотность плотностного буфера составляет примерно 1,025, 1,030, 1,035, 1,040, 1,045, 1,050, 1,055, 1,060, 1,065, 1,070, 1,075, 1,080, 1,085, 1,090, 1,095, 1,100, 1,105, 1,110, 1,115 или 1,120 г/мл.

Материал для плотностного буфера может представлять собой любой материал, который имеет соответствующий диапазон плотности для способов по данному изобретению. В одной форме осуществления этот материал представляет собой коллоидный кремнезем. Коллоидный кремнезем может быть без покрытия (например, Ludox® (W.R. Grace, СТ)) или с покрытием, например, силаном (например, PureSperm® (Nidacon Int′l, Швеция) или Isolate® (Irvine Scientific, Santa Ana, CA)) или поливинилпирролидоном (например, Percoll™, Percoll Plus™ (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО)). В одной форме осуществления выбран коллоидный кремнезем, проявляющий наименьшую интерференцию при спектроскопическом исследовании, например материал с самой низкой собственной флуоресценцией. Коллоидный кремнезем может быть разведен в любой подходящей среде с образованием соответствующей плотности, например, в сбалансированных солевых растворах, в физиологическом растворе и/или в 0,25 М сахарозе. Соответствующие плотности могут быть получены с коллоидным кремнеземом при концентрации от примерно 15% до примерно 80% об./об., например от примерно 20% до примерно 65% об./об.. Другим подходящим материалом для плотностного буфера является йодированный контрастный агент, например йогексол (Omnipaque™, NycoPrep™ или Nycodenz®) и йодиксанол (Visipaque™ или OptiPrep™). Соответствующие плотности могут быть получены с йогексолом или йодиксанолом при концентрации от примерно 10% до примерно 25% масс./об., например от примерно 14% до примерно 18% масс./об., для образцов гемокультуры. Сахарозу можно использовать в качестве плотностного буфера при концентрации от примерно 10% до примерно 30% масс./об., например от примерно 15% до примерно 20% масс./об., для образцов гемокультуры. Другие подходящие материалы, которые можно использовать для получения плотностного буфера, включают масла низкой вязкости, высокой плотности, такие как иммерсионное масло для микроскопа (например, Type DF; Cargille Labs, Нью-Йорк), минеральное масло (например, Drakeol®5, Draketex 50, Peneteck®; Penreco Co., Пенсильвания), силиконовое масло (полидиметилсилоксан), фторсиликоновое масло, силиконовый гель, метризоат-Фиколл® (LymphoPrep™), например при концентрации от примерно 75% до примерно 100% для образцов гемокультуры, диатризоат-декстран (PolymorphoPrep™), например при концентрации от примерно 25% до примерно 50% для образцов гемокультуры, карбоксиметилцеллюлозу, гидроксипропилметилцеллюлозу, полиэтиленоксид (высокой молекулярной массы), Pluronic® F127, Pluronic® F68, смеси соединений Pluronic®, полиакриловую кислоту, сшитый поливиниловый спирт, сшитый поливинилпирролидин, сополимер ПЭГ метилового эфира и метакрилата, пектин, агарозу, ксантан, геллан, Phytagel®, сорбит, Фиколл® (например, Фиколл® 400 при концентрации от примерно 10% до примерно 15% для образцов гемокультуры), глицерин, декстран (например, при концентрации от примерно 10% до примерно 15% для образцов гемокультуры), гликоген, хлорид цезия (например, при концентрации от примерно 15% до примерно 25% для образцов гемокультуры), перфторуглеродные жидкости (например, перфтор-н-октан), гидрофторуглеродные жидкости (например, Vertrel XF) и тому подобное, которые хорошо известны в данной области техники. В одной форме осуществления плотностный буфер выбран из одного или более чем одного из коллоидного кремнезема, йодиксанола, йогексола, хлорида цезия, метризоат-Фиколла®, диатризоат-декстрана, сахарозы, Фиколла® 400 и/или декстрана в любой комбинации. Плотностный буфер может также состоять из комбинации материалов, например комбинации коллоидного кремнезема и масла. Некоторые комбинации вышеописанных соединений могут быть полезны для стадий разделения и считывания по настоящему изобретению, например комбинации соединений с различными свойствами гашения УФ света, такие как хлорид цезия и йогексол.

Объем/высота плотностного буфера должна быть достаточна, чтобы достичь разделения микроорганизмов от других компонентов образца. Объем будет зависеть от размера и формы разделительного контейнера. Как правило, можно использовать объем от примерно 0,1 до примерно 5 мл, например, от примерно 0,2 до примерно 1 мл, например, от примерно 0,2 мл до примерно 0,5 мл. Если разделение осуществляют в микромасштабе, объем плотностного буфера может составлять от примерно 1 мкл до примерно 100 мкл, например от примерно 5 мкл до примерно 50 мкл. Объем образца, нанесенного или наслоенного сверху на плотностный буфер, должен быть достаточным, чтобы обеспечить достаточное количество микроорганизмов для получения осадка, пригодного для исследования. Обычно можно использовать любой объем, который входит в контейнер. Например, можно использовать объем от примерно 0,1 мл до примерно 5 мл, например от примерно 0,2 мл до примерно 1 мл, например, от примерно 0,2 мл до примерно 0,5 мл. Если разделение осуществляют в микромасштабе, объем образца может составлять от примерно 1 мкл до примерно 100 мкл, например, от примерно 5 мкл до примерно 50 мкл. Доступное пространство в контейнере для образца будет зависеть от размера и формы контейнера. В некоторых формах осуществления сверху на плотностный буфер можно поместить промежуточный слой (жидкости или твердого вещества) перед тем, как наносить или наслаивать образец сверху, чтобы предотвратить какое-либо смешивание плотностного буфера и образца. В одной форме осуществления промежуточный слой может представлять собой полиэтиленовые гранулы. В другой форме осуществления маленький пузырек воздуха можно расположить между плотностным буфером и образцом, чтобы предотвратить смешивание. В следующей форме осуществления плотностный буфер можно наслаивать сверху на материал высокой плотности (например, перфторуглеродную жидкость), так чтобы микроорганизмы проходили через плотностный буфер во время разделения и собирались на границе между плотностным буфером и материалом высокой плотности.

В одной форме осуществления изобретения разделительный контейнер центрифугируют в колебательном роторе, так что микроорганизмы образуют осадок непосредственно на дне контейнера. Контейнер центрифугируют при достаточном ускорении и в течение достаточного времени, чтобы разделить микроорганизмы (например, образовавшийся осадок) от других компонентов образца. Ускорение центрифугирования может составлять от примерно 1000 × g до примерно 20000 × g, например, от примерно 2500 × g до примерно 15000 × g, например от примерно 7500 × g до примерно 12500 × g и т.д. Время центрифугирования может составлять от примерно 30 секунд до примерно 30 минут, например, от примерно 1 минуты до примерно 15 минут, например от примерно 1 минуты до примерно 5 минут. Центрифугирование можно осуществлять при температуре от примерно 2°C до примерно 45°C, например, от примерно 15°C до примерно 40°C, например, от примерно 20°C до примерно 30°C. В одной форме осуществления разделительный контейнер содержит крышку, и крышку накладывают на контейнер с образованием герметичного закрытия перед центрифугированием. Наличие крышки уменьшает риск в результате обращения с микроорганизмами, которые являются или могут быть инфекционными и/или опасными, а также риск контаминации образца. Одним из преимуществ способов по изобретению является способность осуществлять одну или более чем одну из стадий этих способов (например, лизис, разделение, исследование и/или идентификацию) с микроорганизмами в герметичном контейнере (например, в герметично закрытом контейнере). Настоящие способы, включающие использование автоматизированных систем, позволяют избежать риска для здоровья и безопасности, связанного с обращением с высоковирулентными микроорганизмами, который встречается при выделении микроорганизмов из образцов для непосредственного тестирования. В одной форме осуществления контейнер не центрифугируют в течение достаточного времени и/или не подвергают достаточному ускорению, чтобы плотностной градиент образовался внутри плотностного буфера. Настоящее изобретение не включает ультрацентрифугирование образцов, например, центрифугирование при ускорениях выше, чем примерно 100000 × g. Кроме того, настоящее изобретение не включает изопикническую (равновесную) седиментацию или бэндинг.

Разделительный контейнер может представлять собой любой контейнер достаточного объема, чтобы удерживать плотностный буфер и образец. Как отмечено в данной заявке, сепаратор, раскрытый в родственной заявке на патент США, серийный №12/589969, поданной 30 октября 2009, озаглавленной "Separation Device for Use in the Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms", можно использовать в практике данного изобретения. В одной форме осуществления контейнер приспособлен или может быть приспособлен к центрифужному ротору. Объем контейнера может составлять от примерно 0,1 мл до примерно 25 мл, например от примерно 1 мл до примерно 10 мл, например, от примерно 2 мл до примерно 8 мл. Если разделение осуществляют в микромасштабе, объем контейнера может составлять от примерно 2 мкл до примерно 100 мкл, например от примерно 5 мкл до примерно 50 мкл. В одной форме осуществления контейнер имеет широкий внутренний диаметр в верхней части для удержания образца и основной части плотностного буфера и более узкий внутренний диаметр в нижней части, где собирается осадок микроорганизмов. Узкая часть может иметь внутренний диаметр от примерно 0,04 (1,02 мм) до примерно 0,12 (3,05 мм) дюймов, например, от примерно 0,06 (1,52) до примерно 0,10 (2,54 мм) дюймов, например примерно 0,08 (2,03 мм) дюймов. Широкая часть может иметь внутренний диаметр от примерно 0,32 (8,13 мм) до примерно 0,40 (10,16 мм) дюймов, например от примерно 0,34 (8,64 мм) до примерно 0,38 (9,65 мм) дюймов, например, примерно 0,36 (9,14 мм) дюймов. Для разделений в микромасштабе внутренние диаметры могут быть даже меньше. Например, внутренний диаметр узкой части может составлять от примерно 0,001 (0,03 мм) до примерно 0,04 (1,02 мм) дюймов, например, от примерно 0,002 (0,05 мм) до примерно 0,01 (0,254 мм) дюймов. Коническая часть внутреннего диаметра может соединять верхнюю и нижнюю часть. Коническая часть может иметь угол от примерно 20 до примерно 70 градусов, например от примерно 30 до примерно 60 градусов. В одной форме осуществления нижняя узкая часть составляет менее половины от общей высоты контейнера, например менее чем примерно 40%, 30%, 20% или 10% от общей высоты контейнера. Контейнер может иметь устройство для закрывания, которое присоединено или может быть снабжено резьбой для присоединения устройства для закрывания (например, колпачка), так что контейнер может быть герметично закрыт во время центрифугирования. В некоторых формах осуществления контейнер сконструирован так, чтобы образец или осадок микроорганизмов можно было легко выделить, либо иначе получить или извлечь из контейнера после разделения, либо вручную, либо автоматизированным способом (так, чтобы лаборанты не подвергались воздействию содержимого контейнера). Например, контейнер может содержать отъемную часть или отделяемую часть, которая содержит осадок и которая может быть отделена от остальной части контейнера. В другой форме осуществления контейнер содержит средства для доступа к осадку после разделения, такие как одно или более чем одно отверстие или одна или более чем одна проницаемая поверхность для вставки шприца или другого дозатора или для вытягивания осадка. В одной форме осуществления контейнер может представлять собой пробирку, например центрифужную пробирку. В другой форме осуществления контейнер может представлять собой чип или плату. В одной форме осуществления контейнер представляет собой отдельно стоящий контейнер, то есть устройство для разделения одного образца. В других формах осуществления контейнер является частью устройства, которое включает два или более чем два разделительных контейнера, так что множественные образцы можно разделять одновременно. В одной форме осуществления устройство включает 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 36, 42, 48, 60, 72, 84, 96 или большее число разделительных контейнеров.

Контейнер может содержать оптическое окно, через которое можно осуществлять исследование. Оптическое окно может находиться на дне, сверху и/или на стенках контейнера. Это окно может состоять из любого материала, обладающего колебательной структурой, которую можно отличить от спектров микроорганизма. Другие методы дискриминации, такие как конфокальная рамановская спектроскопия, можно использовать для снятия колебательных спектров микроорганизма при отклонении спектров материала окна; этот метод хорошо известен специалистам в данной области техники. Дополнительным методом является рамановская спектроскопия с пространственным смещением, при которой возбуждающее волокно отклоняется от испускания вдоль окна (рэлеевкий и рамановский спектры). Этот метод также известен специалистам в данной области техники как средство дискриминации между материалом окна и количеством, которое должно быть измерено ниже окна. Чтобы обеспечить исследование осадка микроорганизмов дополнительными спектроскопическими методами, окно также должно состоять из любого материала, который является прозрачным для света (например, по меньшей мере части ближнего инфракрасного (БИК; 700 нм - 1400 нм), ультрафиолетового (УФ; 190 нм - 400 нм) и/или видимого (ВИД; 400 нм - 700 нм) светового спектра). В одной форме осуществления оптическое окно является достаточно тонким, чтобы давать возможность спектроскопического исследования, которое будет зависеть от материала окна и от способа, используемого для исследования. В другой форме осуществления является тонким насколько возможно, чтобы уменьшить интерференцию при спектроскопическом исследовании. Например, окно может иметь толщину менее чем примерно 0,20 (5,08 мм) дюймов, например, менее чем примерно 0,15 (3,8 мм), 0,10 (2,54 мм) или 0,05 (1,27 мм) дюймов.

В другой форме осуществления разделение осуществляют посредством стадии фильтрования, на которой образец (например, лизированный образец) помещают в устройство, оборудованное селективным фильтром или набором фильтров с размерами пор, которые задерживают микроорганизмы. Задержанные микроорганизмы можно вымыть путем осторожного пропускания подходящего буфера через фильтр. Затем вымытые микроорганизмы можно исследовать непосредственно на фильтре и/или выделить для исследования путем прямого отбора образца с поверхности фильтра или путем обратной промывки фильтра подходящим водным буфером.

Стадия исследования

Как только микроорганизмы разделены, изолированы и/или осаждены, разделенный образец, изолированный образец или осадок можно исследовать, чтобы идентифицировать и/или охарактеризовать микроорганизмы в образце или в осадке. В одной форме осуществления исследование проводят неинвазивным способом, то есть осадок исследуют, в то время как он остается в разделительном контейнере. В другой форме осуществления разделительный контейнер остается герметичным на протяжении исследования. Способность идентифицировать микроорганизмы неинвазивным способом, необязательно в сочетании с содержанием контейнера герметичным на протяжении всего процесса разделения и идентификации/характеристики и полная или частичная автоматизация метода позволяет избежать постоянного обращения с зараженными и/или инфекционными образцами и значительно повышает безопасность всего процесса. Кроме того, способность идентифицировать микроорганизмы путем прямого исследования без дополнительной обработки осадка (например, ресуспендирования, высева на чашки и выращивания колоний) значительно увеличивает скорость, с которой можно осуществить идентификацию. В одной форме осуществления осадок выделяют и/или ресуспендируют и необязательно извлекают из разделительного контейнера перед исследованием. В другой форме осуществления осадок выделяют и/или ресуспендируют после исследования in situ, а затем проводят дополнительное исследование. Например, методики, такие как реакции латекс-агглютинации или автоматизированные тесты фенотипической идентификации, которые можно применять к изолированным микроорганизмам, но не к осадку микроорганизмов, можно осуществлять на выделенных и/или ресуспендированных микроорганизмах.

В некоторых формах осуществления изолированный образец или осадок можно исследовать спектроскопическим путем. Спектроскопию можно использовать для анализа одного или более чем одного внутреннего свойства микроорганизмов, например свойства, присутствующего внутри микроорганизма в отсутствие дополнительных агентов, таких как красители, контрастные вещества, связывающие агенты и т.д. В других формах осуществления спектроскопию можно использовать для анализа одного или более чем одного внешнего свойства микроорганизмов, например свойства, которое может быть обнаружено только с помощью дополнительных агентов. Исследование можно проводить, используя, например, инфракрасную спектроскопию, рамановскую спектроскопию, включая рамановскую спектроскопию, усиленную поверхностью (SERS), рамановскую спектроскопию с пространственным смещением (SORS), трансмиссионную рамановскую спектроскопию и/или резонансную рамановскую спектроскопию. Для усиления рамановских (SERS) сигналов микроорганизмы могут быть покрыты наночастицами золота и/или серебра перед центрифугированием, и/или внутренняя оптическая поверхность может быть предварительно покрыта коллоидами металлов определенного размера и формы (Efrima et al, J. Phys. Chem. B. (Letter) 102:5947 (1998) для SERS). В другой форме осуществления наночастицы присутствуют в плотностном буфере перед центрифугированием и связываются с микроорганизмами, когда микроорганизмы проходят через плотностный буфер. В одной форме осуществления изолированный образец или осадок исследуют, когда он остается в разделительном контейнере. Контейнер можно исследовать через оптическое окно в этом контейнере. Оптическое окно может находиться на дне и/или на любой стенке или стенках и/или наверху контейнера. В одной форме осуществления разделительный контейнер подобран или может быть подобран к держателю в спектрометре в подходящем положении для исследования. Спектроскопическое исследование можно осуществлять любым методом, известным специалистам в данной области техники, который должен быть эффективен для определения и/или идентификации одного или более чем одного внутреннего или внешнего свойства микроорганизмов. В другой форме осуществления, как описано в данной заявке, изолированный образец или осадок можно извлечь для исследования (например, изолированный образец или осадок можно извлечь и подготовить для исследования с помощью масс-спектрометрии, как хорошо известно в данной области техники). В следующих формах осуществления изолированный образец или осадок можно исследовать с использованием более чем одного способа. Например, изолированный образец или осадок можно исследовать с использованием флуоресцентной спектроскопии и рамановской спектроскопии. В соответствии с данной формой осуществления эти стадии исследования можно проводить последовательно или одновременно.

Источник возбуждения образца может быть выбран из любого числа подходящих источников света, как известно специалистам в данной области техники. Можно использовать любую часть электромагнитного спектра, которая дает применимые данные. Источники света, способные к испусканию в ультрафиолетовом, видимом и/или ближнем инфракрасном спектре, а также в других частях электромагнитного спектра, могут быть использованы и известны специалистам в данной области техники. Поскольку генерирование рамановских спектров обычно является неэффективным процессом (например, 1 рамановский фотон, генерируемый на каждый 1 миллион случайных фотонов), рамановская спектроскопия требует источников света с большим потоком фотонов. С момента изобретения лазера в 1960 (Maiman, Nature) в рамановских системах используют лазерный источник света для получения рамановских спектров. Лазерный свет проходит через высоко селективный (узкополосный режекторный фильтр), что дает возможность узкой полосе длин волн лазерного испускания проходить через фильтр, в то же время блокируя другие артефакты, генерируемые лазером (например, амплифицированное спонтанное испускание, флуоресценцию, плазменные линии и т.д.).

Свет от лазера направляют в образец, используя разнообразие оптических систем, которые могут быть созданы с использованием оборачивающих линзовых систем, оптических волокон или их комбинаций. Лазерный свет фокусируют на образце, используя линзы (такие как объектив микроскопа), так что получают малое пятно концентрированной оптической энергии на образце.

Рамановский обратнорассеянный свет и обратнорассеянный возбуждающий свет собирают и коллимируют одним и тем же объективом микроскопа. Рассеянный свет проходит через оптический фильтр, который разделяет рамановский рассеянный свет от возбуждающего света. Затем рамановский рассеянный свет распространяется, используя линзы и/или оптоволоконную систему, на спектрометр, который диспергирует рамановский рассеянный свет таким образом, что он сталкивается с ПЗС матрицей детекторов.

Пространственная дисперсия рамановского рассеянного света генерирует спектры (например, рассеянной длины волны против интенсивности), которые можно сохранить и сравнить с референсными спектрами для характеристики.

Испускание от образца можно измерить с помощью любых подходящих средств спектрального выделения, наиболее предпочтительно с использованием спектрометра. Спектрометр может представлять собой монохроматор со сканированием, который определяет специфичные длины волн испускания, где выход монохроматора определяется фотоэлектронным умножителем, и/или спектрометр может иметь конфигурацию в виде спектрографа визуализации, где выход определяется матрицей детекторов визуализации, такой как матрица детекторов с зарядовой связью (ПЗС матрица). В одной форме осуществления дискриминатор дает возможность наблюдения сигнала флуоресценции и/или рассеяния с помощью средств фотодетектирования (таких как фотоэлектронный умножитель, лавинный фотодиод, ПЗС матрица детекторов и/или электронная умножительная матрица детекторов с зарядовой связью (ЭУПЗС)).

В соответствии с изобретением контрольные измерения снимают с известных микроорганизмов, что, таким образом дает возможность корреляции измеренных тестируемых данных с характеистикой интересующих микроорганизмов, используя различные математические методы, известные специалистам в данной области техники. Например, данные от образцов можно сравнивать с базовым уровнем или с контрольными измерениями, используя системы программного обеспечения, известные специалистам в данной области техники. Более конкретно данные можно анализировать с помощью ряда методов многофакторного анализа, такого как, например, общий дискриминационный анализ (GDA), частичный дискриминационный анализ наименьших квадратов (PLSDA), частичная регрессия наименьших квадратов, анализ главных компонентов (РСА), параллельный факторный анализ (PARAFAC), анализ нейронных сетей (NNA) и/или метод опорных векторов (SVM). Эти методы можно использовать, чтобы классифицировать неизвестные, представляющие интерес микроорганизмы на релевантные группы на основе существующей номенклатуры и/или на встречающиеся в природе группы на основе метаболизма, патогенности и/или вирулентности организма, при разработке системы мониторинга, определения и/или характеристики организма, как описано выше.

Еще в одной другой форме осуществления не спектроскопические измерения системой обнаружения, такие как периоды времени обнаружения и скорости роста, можно использовать, чтобы способствовать характеристике и/или идентификации микроорганизмов из изолированного образца или осадка. Кроме того, измерения, снятые с фотографического изображения нижней части сепаратора, могут обеспечить ценную информацию по идентичности изолята, такую как размер, форма, цвет и плотность осадка.

В некоторых формах осуществления изобретения характеристика и/или идентификация микроорганизмов в изолированном образце или осадке необязательно включает идентификацию точного вида. Характеристика охватывает как широкую категоризацию или классификацию биологических частиц, так и действительную идентификацию отдельного вида. Классификация микроорганизма из изолированного образца или осадка может включать определение фенотипических и/или морфологических характеристик микроорганизма. Например, характеристика биологических частиц может быть выполнена на основании наблюдаемых различий, таких как состав, форма, размер, кластеризация и/или метаболизм. В некоторых формах осуществления классификация интересующих биологических частиц может не требовать предшествующих знаний характеристик данной биологической частицы, но требует только соответствующих корреляций с эмпирическими измерениями, что таким образом делает этот способ более универсальным и легко приспосабливаемым, чем способы, основанные на событиях специфичного связывания или метаболических реакциях. Как используют в данной заявке, "идентификация" означает определение, к какому семейству, роду, виду и/или штамму принадлежит ранее неизвестный микроорганизм, например, идентификацию ранее неизвестного микроорганизма на уровне семейства, рода, вида и/или штамма.

В некоторых случаях характеристика охватывает модели классификации, которые обеспечивают достаточно полезную информацию для действия, которое нужно предпринять. Как используют в данной заявке, предпочтительные модели классификации включают группировку в одно или более чем одно из приведенного ниже: (1) группы по Граму; (2) клинические группы по Граму; (3) терапевтические группы и (4) функциональные группы.

(1) Группы по Граму: В пределах классификации групп по Граму микроорганизмы могут быть помещены в одну из трех широких категорий классификации на основе их реакции окрашивания по Граму и общего размера, где эти группы выбраны из одной или более чем одной из приведенных ниже: (а) грамположительные микроорганизмы, которые окрашиваются в темно-синий цвет при окрашивании по Граму; (б) грамотрицательные микроорганизмы, которые окрашиваются в красный цвет при окрашивании по Граму; и (в) дрожжевые клетки, которые окрашиваются в темно-синий цвет при окрашивании по Граму, но представляют собой очень большие округлые клетки, которые отличаются от бактерий по их морфологическим характеристикам и размеру.

(2) Клинические группы по Граму: Группы по Граму можно дополнительно разделить на несколько подкатегорий, представляющих различающиеся морфологические признаки. Эти подкатегории включают всю релевантную клиническую информацию, сообщаемую квалифицированным клиническим лаборантом, и таким образом дают более высокий уровень идентификации, чем положительная или отрицательная реакция по Граму. Эта конкретная классификация очень полезна, поскольку она исключает проблемы, основанные на качестве штамма по Граму и/или на уровне квалификации лаборанта, исследующего мазок, за счет предоставления эквивалентной клинически релевантной информации автоматизированной системой. Более конкретно подкатегории микроорганизмов, основанные на этой модели классификации, могут быть выбраны из одной или более чем одной из приведенных ниже: (а) кокки, которые представляют собой маленькие округлые клетки; (б) диплококки, которые представляют собой две маленькие округлые клетки, соединенные вместе; (в) палочки, которые имеют прямоугольную форму; и (г) бациллы, которые имеют палочковидную форму. Примеры этих подкатегорий, которые могут быть подтверждены дополнительной морфологической информацией, включают: (i) грамположительные кокки; (ii) грамположительные кокки в цепочках; (iii) грамположительные кокки в кластерах (то есть кластеров в форме "виноградной грозди"); (iv) грамположительные диплококки; (v) грамположительные палочки; (vi) грамположительные палочки с эндоспорами; (vii) грамотрицательные палочки; (viii) грамотрицательные коккобациллы; (ix) грамотрицательные диплококки; (x) дрожжи и (xi) мицелиальные грибы.

(3) Терапевтические группы: терапевтические группы включают множество видов микроорганизмов, которые при выделении из конкретных типов образцов лечат одним и тем же классом антибиотиков или смесью антибиотиков (например, как описано в "Sanford Guide to Antimicrobial Therapy 2008"). Во многих случаях идентичность на видовом уровне не требуется врачу, чтобы обеспечить переход от первоначальной эмпирической терапии к более направленной терапии, поскольку более чем один вид можно лечить одним и тем же антибиотиком(ами) выбора. Этот уровень классификации корректно помещает эти микроорганизмы "одного и того же лечения" в единые терапевтические категории. Примеры данного уровня характеристики включают способность отличать высокорезистентные виды Enterobacteriacae (EB) от чувствительных видов EB (Enterobacter spp. от E. coli) или резистентные к флуконазолу виды Candida (С. glabrata и С. kruzei) от чувствительных видов Candida (С. albicans и С. parapsilosis) и т.д.

(4) Функциональные группы: В соответствии с изобретением микроорганизмы могут быть также помещены в несколько групп на основе сочетания метаболических, вирулентных и/или фенотипических характеристик. Не ферментативные организмы можно четко отличить от ферментативных. Кроме того, виды микроорганизмов, которые продуцируют гемолизины, можно группировать отдельно от не гемолитических видов. В некоторых случаях эти группы представляют более широкие категории, чем уровень рода (например, бактерии группы кишечной палочки, грамотрицательные не ферментативные палочки), в некоторых случаях на уровне рода (например, Enterococcus, Candida), и в некоторых случаях ближе к дискриминации видового уровня (например, коагулаза-отрицательные стафилококки, альфа-гемолитические стрептококки, бета-гемолитические стрептококки, коагулаза-положительные стафилококки, то есть S. aureus).

В дополнение к измерению внутренних свойств микроорганизмов в целях идентификации способы по настоящему изобретению могут дополнительно включать использование дополнительных идентификаторов, чтобы способствовать процессу разделения и/или идентификации. Агенты, которые связываются со специфичными микроорганизмами, такие как аффинные лиганды, можно использовать для разделения микроорганизмов, для идентификации класса или вида микроорганизма (например, посредством связывания с уникальным поверхностным белком или рецептором) и/или для идентификации характеристики микроорганизма (например, устойчивости к антибиотикам). Полезные идентификаторы включают без ограничения моноклональные и поликлональные антитела и их фрагменты (например, анти-Еар для идентификации S. aureus), нуклеиново-кислотные зонды, антибиотики (например, пенициллин, ванкомицин, полимиксин B), аптамеры, пептидные миметики, связывающие белки фагового происхождения, лектины, биомаркеры врожденного иммунитета хозяина (белки острой фазы, LPS-связывающий белок, CD 14, маннозосвязывающий лектин, Toll-подобные рецепторы), белки иммунной защиты (например, дефензины, кателицидины, протеогрины, магаинины), бактериоцины (например, лантибиотики, такие как низин, мерсацидин, эпидермин, галлидермин и плантарицин C, и пептиды класса II), бактериофаги и красители, избирательные для нуклеиновых кислот, липидов, углеводов, полисахаридов, капсул/слизи или белков, или любую их комбинацию. Если сам агент не дает обнаружимого рамановского сигнала, этот агент может быть меченым, чтобы давать обнаружимый сигнал, например, путем конъюгации агента с рамановским активным индикатором, таким как диметиламиноазобензол (DAB) и 4,4′′-дипиридил (DPY) (см., например, патенты США №5376556 и 7518721). Агент можно добавлять к микроорганизмам на любой стадии в способах по изобретению, например, когда получают образец, во время лизиса и/или во время разделения. В некоторых формах осуществления присутствие агента в осадке можно определить во время исследования осадка. Как должно быть легко понятно специалистам в данной области техники, чувствительность конкретного микроорганизма к какому-либо соединению, влияющему на его физическое состояние или метаболизм, такому как антибиотик, можно легко выявить путем добавления этого соединения в образец, буфер для лизиса, плотностный буфер или любую их смесь.

В одном аспекте изобретения способ может дополнительно включать стадию выделения осадка микроорганизмов и проведения дополнительных тестов. В одной форме осуществления осадок можно выделить путем отсасывания среды образца и плотностного буфера. В другой форме осуществления осадок можно выделить путем вставки шприца в контейнер и отсасывания осадка, в то время как среда образца и плотностный буфер остаются интактными. Затем выделенный осадок можно ресуспендировать в подходящей среде, например, в физиологическом растворе. Как только микроорганизмы ресуспендированы, их можно подвергать любым дополнительным тестам, которые желательны, как должно быть известно специалистам в данной области техники, и как описано выше. В частности, можно проводить любой тест, для которого требуются чистые образцы микроорганизмов, с ресуспендированными микроорганизмами. В некоторых формах осуществления можно проводить дополнительные тесты идентификации. Примеры тестов идентификации включают Vitek® 2, тесты амплифицированных и не амплифицированных нуклеиновых кислот (NAT), хромогенные анализы и реакции латекс-агглютинации, иммунологические анализы (например, использование меченых антител и/или других лигандов), масс-спектрометрию (например, MALDI-TOF масс-спектрометрию) и/или другие оптические методы, такие как инфракрасная спектроскопия (FTIR) или рамановская спектроскопия. Можно также проводить дополнительные тесты характеристики, такие как устойчивость к антибиотикам и/или другим лекарствам. Дополнительная характеристика может составлять часть теста, который был начат во время первоначальных стадий разделения и идентификации способа. Например, определение устойчивого к метициллину S. aureus можно начать путем добавления к образцу пенициллина, меченного рамановским индикатором, перед разделением микроорганизмов. Как только осадок выделен и ресуспендирован, можно определить уровень связанного пенициллина.

В одном аспекте изобретения некоторые или все стадии способа могут быть автоматизированными. Автоматизация стадий способов дает возможность более эффективно протестировать большее число образцов и снижает риск ошибок человека при обращении с образцами, которые могут содержать вредные и/или инфекционные микроорганизмы.

В некоторых формах осуществления изобретения эти способы можно также использовать для определения присутствия микроорганизмов в образце. В этих формах осуществления способы включают стадии:

(a) получение образца;

(b) необязательно лизис клеток в этом образце с получением лизированного образца; и

(c) разделение микроорганизмов и других компонентов образца с образованием осадка микроорганизмов;

где присутствие осадка указывает на то, что микроорганизмы присутствуют в образце. В одной форме осуществления осадок определяют невооруженным глазом. В других формах осуществления осадок определяют путем исследования, например, спектроскопического.

В некоторых формах осуществления способы определения можно использовать для мониторинга образцов на заражение микроорганизмами, например, пищевых продуктов, фармацевтических препаратов, питьевой воды и т.д. В одной форме осуществления эти способы можно осуществлять с повторением для постоянного мониторинга на заражение, например, раз в месяц, раз в неделю, раз в сутки, раз в час или по любой другой схеме периодичности. В другой форме осуществления образцы можно тестировать по необходимости, например, когда заражение подозревают. В следующих формах осуществления способы определения можно использовать, чтобы посмотреть присутствие микроорганизмов в клинических образцах, например, в гемокультурах. Например, образец можно отбирать из гемокультуры в определенные моменты времени и осуществлять способ определения на образце, чтобы определить, является ли эта гемокультура положительной. В одной форме осуществления образец может быть отобран в установленный момент времени после инокуляции культуры, например, через 24 часа после инокуляции, чтобы определить, является ли эта гемокультура положительной. В другой форме осуществления образцы можно отбирать из гемокультуры регулярно, например, каждые 12, 6, 4 или 2 часа или каждые 60, 50, 40, 30, 20, 15, 10 или 5 минут, чтобы идентифицировать положительные гемокультуры в пределах короткого промежутка времени как обнаружимо положительные. В некоторых формах осуществления способов определения за стадией определения могут необязательно следовать способы идентификации, которые описаны в данной заявке.

В одном аспекте изобретения некоторые или все стадии способа могут быть автоматизированы. Автоматизация стадий способов дает возможность более эффективно протестировать большее число образцов и снижает риск ошибок человека при обращении с образцами, которые могут содержать вредные и/или инфекционные микроорганизмы. Огромную важность составляет, однако, то, что автоматизация может давать критически значимые результаты в любое время дня или ночи без промедления. Несколько исследований показало, что более быстрая идентификация организмов, вызывающих сепсис, коррелирует с лучшим лечением пациента, более коротким периодом пребывания в больнице и более низким общим затратам.

Дополнительные подробности и описание способа характеристики и/или идентификации микроорганизмов в соответствии с настоящим изобретением раскрыты в совместно поданных заявках на патент США, серийный №12/589952 и 12/589936, обе поданы 30 октября 2009, озаглавленных "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Spectroscopy" и "Method for Separation, Characterization and/or Identification of Microorganisms using Mass Spectrometry", соответственно, содержание которых включено в данную заявку посредством ссылки.

Настоящее изобретение описано более подробно в приведенных ниже примерах, которые предложены в качестве иллюстрации и никоим образом не предназначены для ограничения изобретения. Используют стандартные методы, хорошо известные в данной области техники, или методы, специально описанные ниже.

ПРИМЕРЫ

Пример 1. Способ лизиса-центрифугирования для идентификации микроорганизмов из гемокультур с помощью рамановской спектроскопии

Микроорганизмы "высевали" при низком инокулуме во флаконы BacT/ALERT® SA, содержащие 10 мл крови человека. Образцы культуральной среды гемокультуры отбирали из флаконов в пределах нескольких минут после положительного мечения системой обнаружения микроорганизмов BacT/ALERT® 3D. Образцы культуральной среды обрабатывали для разделения микроорганизмов от крови и компонентов среды, которые могли интерферировать при последующем анализе, как описано ниже:

4,0 мл культуральной среды из свежих положительных гемокультур объединяли с 2,0 мл буфера для лизиса (0,45% Brij® 97 в 0,3 М CAPS, pH 11,7), перемешивали на вортексе в течение 5 секунд, а затем инкубировали в водяной бане на 37°C в течение 90 секунд. После инкубации 0,95 мл лизата наслаивали сверху на 0,5 мл плотностного буфера (14% масс./об. йогексол, 0,005% Pluronic F-108 в 10 мМ ГЭПЭС, pH 7,4) в каждой из четырех 1,5 мл конических центрифужных пробирок. Затем все четыре пробирки центрифугировали в течение 2 минут при 10000 g при 25°C до седиментации (осаждения) микроорганизмов через плотностный буфер. Лизированная кровь и среда оставались над плотностным буфером.

После завершения цикла центрифугирования надосадочную жидкость удаляли, и седиментированные (осажденные) микроорганизмы в каждой пробирке ресуспендировали 10 мкл дистиллированной воды. Ресуспендированные микроорганизмы из всех 4 пробирок объединяли в чистой пробирке и мягко перемешивали. Затем объем каждого обработанного образца регулировали таким образом, чтобы оптическая плотность при 660 нм (A₆₆₀) конечной суспензии была равна 20/см. Обработанные образцы лидо хранили при 2-8°C в течение тех же суток тестирования, либо делили на аликвоты и замораживали при -70°C для тестирования на последующие сутки.

Пример 2. Анализ образцов микроорганизмов, обработанных из положительных гемокультур лизисом-центрифугированием, с помощью рамановской спектроскопии

Образцы, обработанные в соответствии с методикой в примере 1, быстро оттаивали при 37°C (если были ранее заморожены), мягко перемешивали. Часть образца держали неразведенным, а остальной образец разводили до 1:2 в дистиллированной воде. Один микролитр каждого разведенного и неразведенного образца наносили на первую поверхность покрытого золотом предметного стекла микроскопа и давали возможность высохнуть в условиях окружающей среды.

После высыхания 25 спектров в схеме решетки 5×5 снимали для каждого из высушенных образцов с помощью рамановского микроскопа Model R×N1 (Kaiser Optical Systems Inc., Michigan) при длине волны освещения 785 нм. Микроскоп был оборудован объективом с 40Х линзами, мощность лазера была установлена на 400 МВт, и каждый из 25 индивидуальных спектров снимали с 5-секундным временем накопления.

После снятия спектры предварительно обрабатывали для проведения вычитания темноты, удаления артефакта космических лучей, спектрального сжатия, вычитания базового уровня, нормализации и удаления резко отклоняющихся значений при подготовке к многофакторному статистическому анализу и его проведении.

Репрезентативные рамановские спектры избранных микроорганизмов, выделенных и обработанных из положительных гемокультур, показаны на фиг. 1 и 2. На фиг. 1 показаны спектры четырех видов микроорганизмов; четырех изолятов С. albicans, шести изолятов Р. aeruginosa, тринадцати изолятов Е. coli и тринадцати изолятов S. aureus. Спектры от каждого вида усредняли для ясности иллюстрации.

Соответствующие различия по всем спектрам различных видов легко очевидны для этих организмов. Это показывает, что потенциально маскирующие кровь и культуральные среды достаточно удалены, чтобы получить характеристические спектры для микроорганизмов после обработки.

На фиг. 2 показаны 13 индивидуальных рамановских спектров изолятов S. aureus, которые были показаны усредненными на фиг. 1. Эти тринадцать спектров показывают соответствие рамановского спектра данному микроорганизму для всех различных клинических изолятов, даже выращенных в различных гемокультурах от различных доноров крови.

Пример 3. Неинвазивный анализ образцов микроорганизмов, обработанных из положительных гемокультур лизисом-центрифугированием, с помощью рамановской спектроскопии

Микроорганизмы "высевали" при низком инокулуме во флаконы BacT/ALERT® SA, содержащие 10 мл крови человека. Образцы культуральной среды гемокультуры отбирали из флаконов в пределах нескольких минут после положительного мечения системой обнаружения микроорганизмов BacT/ALERT® 3D. Образцы обрабатывали, как описано ниже:

1. 2,0 мл образец положительной культуральной среды смешивали с 1,0 мл селективного буфера для лизиса (0,45% масс./об. Brij® 97 + 0,3 М CAPS, pH 11,7), затем помещали в водяную баню на 37°C в течение 1 минуты.

2. 1,0 мл образец лизата наслаивали сверху на 0,5 мл плотностного буфера (24% масс./об. хлорид цезия в 10 мМ ГЭПЭС pH 7,4 + 0,005% Pluronic F-108), содержащегося в изготовленной на заказ оптической разделительной пробирке. Полипропиленовый шарик присутствовал на поверхности плотностного буфера, чтобы облегчить нанесение без нарушения водных фаз.

3. Оптическую разделительную пробирку герметично закрывали завинчивающейся крышкой и центрифугировали в течение 2 минут при 10000 об/мин (микроцентрифуга Eppendorf® 5417R, оборудованная колебательным ротором А-8-11, см. фиг. 4).

4. Герметично закрытую пробирку переносили в изготовленный на заказ адаптер, который способствовал исследованию осадка микроорганизмов в основании пробирки с помощью рамановского микроскопа Model R×N1 (Kaiser Optical Systems Inc., Michigan) при длине волны освещения 785 нм. Также записывали спектры пустых разделительных пробирок для установлении базового уровня рамановского спектра пластмассы.

На фиг. 3 показаны рамановские спектры, снятые через пластмассовую разделительную пробирку, как с осадком микроорганизмов, так и без него. В данном режиме в спектрах преобладают рамановские полосы от самой пластмассы; однако полосы, уникальные для микроорганизмов, видимы в спектре осадка микроорганизмов только при волновых числах около 1227/см, 1583/см и 1660/см. Другие полосы микроорганизма также присутствуют, но замаскированы более сильными полосами пластмассы на данной шкале.

На фиг. 4 показаны рамановские спектры трех микроорганизмов после удаления фона путем вычитания спектра пустой пластмассовой разделительной пробирки. Хотя это вычитание фона не на 100% эффективно, спектральные полосы микроорганизмов четко видны. Другие геометрии системы снятия, такие как снятие с пространственным смещением или трансмиссионное снятие, вероятно, дополнительно улучшают компенсацию фона (см., например, опубликованные заявки на патент США №№2008/0129992 и 2009/0244533).

Приведенные выше примеры являются иллюстративными для настоящего изобретения и не должны быть истолкованы как ограничивающие его. Изобретение определено приведенной ниже формулой изобретения, где эквиваленты формулы изобретения должны быть включены в нее. Все публикации, заявки на патенты, патенты, патентные публикации и любые другие ссылки, цитируемые в данной заявке, включены полностью посредством ссылки на информацию, релевантную для предложения и/или параграфа, в котором представлена ссылка.

Изобретение направлено на способ идентификации микроорганизмов из тестируемого образца гемокультуры. Способ предусматривает получение тестируемого образца, селективный лизис и растворение клеток, не являющихся микроорганизмами, тестируемого образца, наслаивание полученного лизата на плотностной буфер в герметичном контейнере и дальнейшее центрифугирование. Плотностный буфер имеет однородную плотность от примерно 1,025 г/мл до примерно 1,120 г/мл. При этом микроорганизмы, проходя через указанный буфер, формируют осадок на дне контейнера. Осадок исследуют с использованием рамановской спектроскопии, что позволяет идентифицировать микроорганизм на уровне рода или вида. Изобретение позволяет идентифицировать микроорганизмы из клинических образцов менее чем за 120 мин. 12 з.п. ф-лы, 4 ил., 3 пр.

1. Способ идентификации микроорганизма из тестируемого образца гемокультуры, включающий:
(a) получение тестируемого образца, о котором известно, что он содержит микроорганизмы;
(b) селективный лизис и растворение клеток не микроорганизмов тестируемого образца с помощью лизирующего раствора с получением лизата образца, где указанный лизирующий раствор имеет pH от примерно 8 до примерно 13;
(c) наслаивание указанного лизата образца на плотностный буфер, где указанный плотностный буфер имеет однородную плотность от примерно 1,025 г/мл до примерно 1,120 г/мл, в герметичном контейнере и дальнейшее центрифугирование контейнера с целью разделения и изолирования указанных микроорганизмов от других компонентов в лизате образца, где микроорганизмы, проходя через плотностный буфер, формируют осадок на дне указанного контейнера;
(d) исследование указанного осадка с использованием одного или более чем одного метода рамановской спектроскопии с получением спектроскопических измерений данного микроорганизма, где указанные исследования с помощью рамановской спектроскопии проводятся с осадком микроорганизмов, оставшимся на дне контейнера, и
(e) идентификацию данного микроорганизма в указанном осадке путем сравнения спектроскопических измерений со снятыми спектроскопическими измерениями известных микроорганизмов или предсказанными спектроскопическими свойствами известных микроорганизмов, где микроорганизмы идентифицируют на уровне рода или на уровне вида.

2. Способ по п.1, где стадия исследования (d) является неинвазивной.

3. Способ по п.1, где метод рамановской спектроскопии выбран из группы, состоящей из рамановской спектроскопии, конфокальной рамановской спектроскопии, рамановской спектроскопии, усиленной поверхностью, рамановской спектроскопии с пространственным смещением, резонансной рамановской спектроскопии, трансмиссионной рамановской спектроскопии и любой их комбинации.

4. Способ по п.1, где стадию селективного лизиса (b) осуществляют используя раствор для лизиса, содержащий один или более чем один детергент.

5. Способ по п.4, где один или более чем один детергент выбран из группы, состоящей из Тритона® Х-100, Тритона® X-100-R, Тритона® Х-114, NP-40, Genapol® С-100, Genapol® Х-100, Igepal® CA 630, Arlasolve™ 200, Brij® 96/97, CHAPS, октил-D-глюкопиранозида, сапонина, нонаэтиленгликоля монододецилового эфира (C₁₂E₉, полидоценол), додецилсульфата натрия, N-лаурилсаркозина, деоксихолата натрия, желчных солей, гексадецилтриметиламмония бромида, SB3-10, SB3-12, амидосульфобетаина-14, C₇BzO, Brij® 98, Brij® 58, Brij® 35, Твин® 80, Твин® 20, Pluronic® L64, Pluronic® P84, не детергентных сульфобетаинов (NDSB 201), амфиполов (PMAL-C8) и метил-β-циклодекстрина.

6. Способ по п.4, где указанный детергент представляет собой полиоксиэтиленовый детергент, включающий структуру C_12-18/E_9-10.

7. Способ по п.6, где указанный полиоксиэтиленовый детергент выбран из группы, состоящей из Brij® 97, Brij® 96V, Genapol® С-100, Genapol® Х-100 и полидоценола.

8. Способ по п. 4, где раствор для лизиса дополнительно содержит один или более чем один фермент, который включает смесь одной или более чем одной протеиназы и одной или более чем одной нуклеазы.

9. Способ по п.4, где раствор для лизиса содержит один или более чем один буферный агент.

10. Способ по п.1, где указанный плотностный буфер выбран из группы, состоящей из коллоидного кремнезема, йодированных контрастных агентов, сахарозы, иммерсионного масла для микроскопа, минерального масла, силиконового масла, фторсиликонового масла, силиконового геля, метризоата-фиколла®, диатризоата-декстрана, карбоксиметилцеллюлозы, гидроксипропилметилцеллюлозы, полиэтиленоксида (высокой молекулярной массы), Pluronic® F127, Pluronic® F68, полиакриловой кислоты, сшитого поливинилового спирта, сшитого поливинилпирролидина, сополимера метилового эфира ПЭГ и метакрилата, пектина, агарозы, ксантана, геллана, Phytagel®, сорбита, фиколла®, глицерина, декстрана, гликогена, хлорида цезия, перфторуглеродных жидкостей и/или гидрофторуглеродной жидкости и их комбинаций.

11. Способ по п.1, где тестируемый образец представляет собой образец культуры, о которой известно, что она содержит микроорганизмы.

12. Способ по п.1, где указанный исследуемый образец представляет собой образец гемокультуры.

13. Способ по п.1, где указанный плотностный буфер содержит хлорид цезия или йогексол.