ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ PSEUDOMONAS SPECIES 181a С ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового бактериального штамма Pseudomonas species 181а, обладающего способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья и подавлять рост фитопатогенных грибов рода Fusarium, который может быть использован для получения биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.

Проблема фосфорного питания растений остается одной из самых острых в земледелии, что объясняется двумя основными причинами: ограниченным запасом фосфатных руд и быстрым связыванием этого элемента в почве при внесении с удобрениями. Только 5-25% вносимого с химическими удобрениями фосфора ассимилируется растениями (Sample Е.С., Soper R.J., Racz G.J. Reactions of phosphate fertilizers in soils // The role of phosphorus in agriculture / Ed. Khasawneh F.E., Sample E.C., Kamprath E.J. Madison, WI: American Society of Agronomy, 1980. P.263-310; Муромцев Г.С., Маршунова Т.Н., Павлова В.Ф., Зольникова Н.В. Роль почвенных микроорганизмов в почвенном питании растений // Успехи микробиол. 1985. Т.20. С.174-198). Остальная часть фосфатов вымывается или переходит в почве в нерастворимую форму и становится недоступной для растений. При этом производство фосфорсодержащих химических удобрений является энергоемким и дорогостоящим процессом, чрезвычайно загрязняющим окружающую среду. Увеличение норм внесения удобрений нарушает баланс питания растений, снижает качество продукции и нарушает экосистему почв, грунтовых вод и водоемов. В связи с этим в настоящее время во многих странах ведутся интенсивные исследования возможности замены промышленного химического производства фосфорных удобрений микробиологическим (Vassilev N., Vassileva М. Biotechnological solubilization of rock phosphate on media containing agro-industrial wastes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. - V.61. - P.435-440; Anandham R., Choi K.H., Gandhi P.I., Yim W.J., Park S.J., Kim K.A., Madhaiyan M., Sa T.M. Evaluation of shelf life and rock phosphate solubilization of Burkholderia sp. in nutrient-amended clay, rice bran and rock phosphate-based granular formulation // World J. Microbiol. Biotechnol. 2007. - V.23. - №8. - P.1121-1129).

В то же время в современном зернопроизводстве очень актуальна проблема борьбы с поражениями посевов хлебных злаков и продуктов их урожая фузариозными гнилями (Соколов М.С., Коломбет Л.В. Агротехногенные факторы минимизации вредоносности фузариоза колоса пшеницы // Агрохимия. 2007. - №12. - С.63-80). Возбудителями фузариозов колоса зерновых являются в основном грибы рода Fusarium, которые не только снижают урожай, но и загрязняют зерно и производимые из него продукты питания микотоксинами, делая эти продукты опасными для здоровья человека и животных.

Если в качестве микроорганизмов, растворяющих фосфатную руду в полевых условиях, будут использованы антагонисты патогенов сельскохозяйственных культур, и прежде всего возбудителей фузариозов, это позволит значительно снизить применение химических фунгицидов, повысит экологическую безопасность и безопасность продовольствия. Создание комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами позволит дополнительно повысить экологическую безопасность, в том числе и за счет снижения загрязнения окружающей среды, сопровождающего производство и применение традиционных химических фосфорных удобрений.

В настоящее время известны фосфатрастворяющие микроорганизмы (например, патент США №5026417; Y.P.Chen, P.D.Rekha, А.В.Arum, F.T.Shen, W.-A. Lai, С/С/ Young. Phophate solubilising bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solubilizing abilities // Applied Soil Ecology. - 2006. - V.34. - P.34-41) и микроорганизмы, на основе которых созданы препараты для борьбы с болезнями растений (например, патент РФ №2019966; В.А.Павлюшин, С.Л.Тютерев, Э.В.Попова, И.И.Новикова, Г.А.Быкова, Н.С.Домнина. Новые комплексные биопрепараты для защиты овощных культур от грибных и бактериальных болезней // Биотехнология. - 2010. - №4. - С.69-80).

Известен штамм Pseudomonas aureofaciens ВКМ В-2390, предназначенный для защиты растений от грибных патогенов, в том числе от грибов рода Fusarium, для очистки почв от мышьяка и растворяющий фосфаты (Патент РФ №2323967).

Однако антагонистическая и фосфатрастворяющая активность этого штамма характеризуются только качественно, причем последняя констатируется по наличию зоны просветления в агаре, содержащем нерастворимое фосфатное сырье. Известно, что результаты определения растворения фосфатов микроорганизмами, полученные на плотных и жидких средах, часто не совпадают, и для количественной оценки фосфатрастворяющей активности необходимы исследования в жидкой среде (Gupta R., Singal R., Shankar A., Kuhad R.C., Saxena R.K. A modified plate assay for screening phosphate solubilizing microorganisms // J. Gen. Appl. Microbiol. 1994. V.40. P.255-260; Deubel A., Fankem H., Nwaga D., Antoun Y., Merbach W. In vitro mobilization of calcium, iron and aluminum phosphate by rhizosphere bacteria of African oil palm // Proceedings of 3^rd International Symposium on Phosphorus Dynamics in the Soil-Plant Continuum / Ed. Alves V.M.C. et al. Uberlandia, Brazil: Embrapa Milho e Sorgo, 2006. P.232-233). He подтверждено также влияние заявленного штамма на повышение урожайности.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Pseudomonas sp. NJ-101, который давал зоны ингибирования до 1,8 мм с культурами фитопатогенов, таких как Fusarium oxysporum, F. solani и F. udum, и переводил в раствор до 74,6 мкг/мл фосфата из Са₃(РO₄)₂ (Bano N., Musarrat J. Characterization of a novel carbofuran degrading Pseudomonas sp.with collateral biocontrol and plant growth promoting potential // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V.231. P.13-17).

Однако активность этого штамма низка и его влияние на повышение урожайности также не подтверждено.

Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой фосфатрастворяющей активностью и способностью к подавлению фитопатогенных грибов рода Fusarium для борьбы с фузариозами и повышения урожайности.

Поставленная задача решается тем, что предлагается штамм Pseudomonas species 181а, выделенный из разрушающейся скальной породы Карелии с использованием селективной минимальной минеральной среды, содержащей нерастворимый фосфат кальция (Са₃(РO₄)₂). Основными критериями отбора служили степень растворения Са₃(РO₄)₂, подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, стимуляция роста растений и безвредность для теплокровных.

Предлагаемый штамм Pseudomonas species 181а обладает высокой способностью растворять фосфаты, подавляет рост фитопатогенных грибов рода Fusarium и стимулирует рост растений.

Предлагаемый штамм депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п.Оболенск Серпуховского р-на Московской обл.) под номером В-6646.

Штамм бактерий Pseudomonas species 181а характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки

Клетки подвижные, грамотрицательные, короткие овальные палочки, спор не образуют. Размер клеток 1-1,5×1,5-2,5 мкм, наблюдается клеточный полиморфизм.

При росте на агаре, содержащем гидролизат рыбной муки (ГРМ-агар) (ФГУН ГНЦПМБ, п.Оболенск)), штамм образует выпуклые, слизистые колонии бежево-желтого цвета диаметром 5-7 мм. При росте на минимальной среде, содержащей Са₃(РO₄)₂ в качестве единственного источника фосфора, образует выпуклые, слизистые колонии бежево-желтого цвета диаметром 3-5 мм с зонами растворения фосфата диаметром до 7 мм.

Штамм хорошо растет на следующих средах: гидролизат рыбной муки (ГРМ)-бульон (ФГУН ГНЦПМБ, п.Оболенск) + 2% глюкозы, на минимальной синтетической среде состава (г/л): K₂НРO₄ - 1,5; KН₂РO₄ - 3,0; NH₄CI - 0,5; глюкоза - 20,0; дрожжевой экстракт - 2,0; MgSO₄ - 0,4; NaCl - 3,0, раствор микроэлементов - 10 мл/л (состав раствора микроэлементов, %: сульфат железа (FeSO₄×7H₂O) - 0,01; сульфат меди (CuSO₄×5H₂O) - 0,1; сульфат марганца (MnSO₄×2H₂O) - 0,1; сульфат цинка (ZnSO₄×7H₂O) - 0,01).

Физиолого-биохимические признаки

Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 28-30°С, не растет при 41°С; растет в пределах рН среды от 3,5 до 8,0.

В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Метаболизм глюкозы окислительный. Молекулярный азот не фиксирует. Крахмал гидролизует. Клетчатку не разлагает. Штамм не продуцирует индол, уреазу и сероводород, обладает b-галактозидазой, b-глюкозидазой, фосфатазой, N-ацетил-bD-глюкозаминадазой, у-глютамилтрансферазой, не разлагает фенилаланин, адонитол, аргинин, рафинозу, сорбитол, лактозу, лизин, орнитин, рафинозу, целлобиозу, дульцитол. Оксидазная реакция положительная.

Отношение к источникам углерода

Усваивает ацетоин, галактозу, глюкозу, инозитол, ксилозу, крахмал, малонат, мальтозу, маннитол, меллибиозу, рамнозу, сахарозу, трегалозу, фруктозу, цитрат Симмонса.

Отношение к источникам азота

Использует аммиачные и нитратные соли азота в качестве единственного источника азота.

Сапрофит. Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм не патогенен для теплокровных: не вызывает гибели мышей линии СВА при подкожном введении 10⁸ КОЕ.

Условия хранения

Штамм бактерий Pseudomonas species 181а хранят на чашках или косяках с ГРМ-агаром при 5-7°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Долгосрочное хранение в лиофильно высушенном состоянии в лактозно-полиглюкиновой защитной среде. Хранить при температуре (4-8)°С, перезакладка через 3 года.

У штамма Pseudomonas species 181а отсутствует фитотоксичность. Показатели фитотоксичности штамма Pseudomonas species 181а имеют отрицательные значения (таблица 1), свидетельствующие о наличии стимулирующего рост растений эффекта.

Штамм Pseudomonas species 181а угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum.

Возможность осуществления изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Получение культуры бактерий Pseudomonas species 181а

Культуру клеток штамма Pseudomonas species 181а для испытаний готовят следующим образом: в колбу объемом 750 мл наливают 150 мл стерильной среды ГРМ-бульон, добавляют 6 мл стерильного 50%-раствора глюкозы и вносят 1-2 мл стационарной культуры штамма Pseudomonas species 181а. Культивирование проводят с аэрацией (160-250 об/мин) при 28°С в течение 10-15 ч до титра культуральной жидкости 5-10×10⁹ кл./мл.

Пример 2. Демонстрация отсутствия фитотоксичности у штамма Pseudomonas species 181а

Из культуральной жидкости, полученной по примеру 1, готовят 1% (v/v) суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде (0,5-1,0×10⁸ кл./мл). В полученной суспензии замачивают семена пшеницы сорта "Иволга" в течение 2 ч. В контрольном опыте семена замачивают в дистиллированной воде. По 50 семян каждого варианта раскладывают на увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, которую помещают в чашки Петри, и выдерживают в термостате при 28°С в течение 4 суток, постоянно увлажняя. Через сутки оценивают всхожесть семян (таблица 1), а через 4 суток проростки морфометрируют, измеряя длину всех корней и стебля.

Фитотоксическую активность штамма рассчитывают по формуле:

А=(100-Д_о/Д_к×100)%,

где А - показатель фитотоксичности;

Д_о - средний показатель параметра в опыте;

Д_к - средний показатель параметра в контроле.

Отрицательные значения показателя А свидетельствуют о стимулирующем эффекте.

Таблица 1 Показатель фитотоксичности штамма Pseudomonas species 181а для проростков пшеницы сорта Иволга. Вариант обработки семян Всхожесть семян, % к контролю Показатель фитотоксичности, % Корни Стебель Суспензия клеток Pseudomonas species 181а 100 -23,5 -16,8

Пример 3. Демонстрация фосфатрастворяющей активности штамма Pseudomonas species 181а

Для определения фосфатрастворяющей активности в колбы вместимостью 750 мл вносят 100 мл стерильной минеральной среды следующего состава (г/л): NH₄Cl, 0,16; MgSO₄×7H₂O, 0,2; Са₃(РO₄)₂×2Н₂O, 5,0; глюкоза, 10. В среду вносят 2-3 мл культуры Pseudomonas species 181а, выращенной по примеру 1. Инкубирование ведут на качалке New Brunswick при 160-180 об/мин при 28°С.

Для определения количества фосфата, перешедшего в раствор, используют одностадийный метод, основанный на измерении интенсивности окраски его молибденового комплекса с Твином 80 при 350 нм (Пупышев А.Б. Стабильный реактив для одностадийного определения неорганического фосфата // Лабораторное дело. - 1991. - №9. - С.12-16). Измерение фосфата в растворе проводят в трех повторностях. Через двое суток концентрация фосфата в растворе составляет 2620±150 мкг/мл, что более чем в 30 раз выше, чем у прототипа.

Пример 4. Демонстрация антагонизма штамма Pseudomonas species 181а в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium

В качестве тест-объектов используют следующие штаммы фитопатогенных грибов рода Fusarium (в скобках указано вызываемое патогеном заболевание): F. graminearum Schwabe 1838 K-33 (фузариоз колоса и зерна), F. culmorum (W.G.Smith, 1884) Saccardo 1895 (корневая гниль злаковых), F. oxysporum Schlecht №6 (фузариоз).

Для определения супрессивных свойств используют метод лунок. Суспензии фитопатогенных грибов (10⁵ КОЕ/мл) готовят, смывая мицелиальную и споровую массу с газонов грибов на картофельно-глюкозном агаре (КГА) (Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 217 с.) стерильным раствором 0,9% хлористого натрия. Полученные суспензии в количестве 0,1 мл засевают на поверхность КГА в чашках Петри и растирают шпателем. В центре засеянных патогенами чашек Петри с КГА делают лунки диаметром 4-5 мм, в которые вносят 0,1 мл культуральной жидкости Pseudomonas species 181а, полученной по примеру 1. Чашки инкубируют при 28°С в течение 4-х суток. Для F. graminearum зона угнетения составляет 1,0 мм, F. culmorum - 1,5 мм, для F. oxysporum - 2,5 мм.

Пример 5. Демонстрация стимулирования роста растений в результате применения штамма Pseudomonas species 181а

В качестве тест-культуры используют бархатцы отклоненные (Tagetes patula), которая удобна для выращивания в условиях лаборатории и чувствительна к наличию фосфора. В каждый горшок объемом 1,5 л помещают 1550 г супесчаной почвы, дефицитной по доступному фосфору (<5 мг Р₂О₅/100 г почвы по Кирсанову), рН 6,8. Почву просеивают через сито (2 мм) и стерилизуют перед использованием (2 атм, 2 ч). рН почвы 6,8. Источники минерального питания азота и калия вносят дробно в течение вегетационного периода в виде растворов солей. В качестве источника фосфора используют измельченную фосфоритную руду Егорьевского месторождения (содержание оксида фосфора (Р₂О₅) 19,6%). Руду вносят в полной норме однократно, непосредственно перед посевом, перемешивая с почвенной навеской горшка. В вариантах с использованием штамма Pseudomonas species 181а руду сначала перемешивают с биомассой, а затем вносят в почву из расчета 10⁶ клеток на 1 г почвы. В вариантах без использования руды биомассу смешивают непосредственно с почвой из того же расчета 10⁶ клеток на 1 г почвы. Суммарное внесение элементов питания в пересчете на NPK за весь вегетационный период составляет, г на 1 кг сухой почвы: азота (N) - 0,15; окиси калия (K₂О) -0,1; Р₂О₅ - 0,1.

Все варианты воспроизводят в 4-х повторностях. В каждый горшок высевают по 10 семян. Всходы прореживают в течение 3-5 дней после их появления с целью выравнивания по высоте, оставляя в каждом горшке по 1 растению. Растения выращивают 3,5 месяца, затем их выкапывают, высушивают на воздухе и взвешивают. Результаты приведены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние штамма Pseudomonas species 181а на вес растений бархатцев         № вариан-та Характеристика варианта Общий сухой вес растении, г Сухой вес цветов и бутонов, г Внесение фосфоритной руды Внесение штамма Pseudomonas species 181а 1     3,76±0,18 0,28±0,01 2   + 4,61±0,32 0,34±0,03 3 +   4,46±0,29 0,46±0,04 4 + + 5,15±0,37 0,55±0,04

В вариантах с применением штамма Pseudomonas species 181а отмечают более раннее появление цветов в среднем на 7-10 дней. Также в вариантах с применением штамма Pseudomonas species 181а общий вес растений увеличился на 22 и 15%, а вес цветов и бутонов - на 21 и 20% по сравнению с соответствующими вариантами без бактерий.

Пример 6. Демонстрация повышения урожайности растений в результате применения штамма Pseudomonas species 181а

В качестве тест-культуры используют яровую пшеницу сорта «Лада».

Закладку опыта осуществляют на темно-серой лесной тяжелосуглинистой почве со следующими агрохимическими показателями: рН солевой вытяжки 5,3; содержание гумуса в слое 0-40 см (по Тюрину) - 4,6%, подвижного фосфора - 0,25 г/кг почвы, подвижного калия - 0,13 г/кг почвы. Дополнительно удобрений не вносят.

В опыте используют основные методики и схемы, общепринятые в селекционных, научно-исследовательских учреждениях и Государственном сортоиспытании.

Посев осуществляют в оптимальные для агрозоны сроки по технологии, рекомендованной для возделывания яровой пшеницы, с учетом погодных условий.

Способ внесения клеток штамма Pseudomonas species 181а: обработка семян перед посевом. Для этого из культуральной жидкости, полученной по примеру 1, готовят 500 мл 3%-ной суспензии клеток в стерильной дистиллированной воде (1,5-3,0×10⁸ кл./мл). В полученной суспензии замачивают 1000 г семян пшеницы сорта «Лада» в течение 30 мин, тщательно перемешивая смесь. В контрольном варианте (без обработки) семена замачивают в дистиллированной воде. Затем семена подсушивают на воздухе и проводят посев делянок сеялкой ССФК-7М. Норма высева 250 г семян на делянку 10 м². Повторность 4-кратная. Уборку проводят комбайном «САМПО-130». Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3 Влияние штамма Pseudomonas species 181а на урожай пшеницы № Вариант Урожайность, т/га 1 Контроль без обработки 1,03±0,22 2 Обработка семян Pseudomonas species 181а 1,37±0,26

При использовании штамма Pseudomonas species 181а урожайность яровой пшеницы повысилась на 33%.

Таким образом, штамм Pseudomonas species 181а обладает высокой способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья, что улучшает их доступность для растений. Кроме того, он подавляет рост фитопатогенных грибов рода Fusarium, возбудителей болезней зерновых культур и повышает урожайность. Штамм не токсичен для растений, стимулирует их рост и может быть рекомендован для создания на его основе биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Pseudomonas species 181а, выделенный из разрушающейся скальной породы Карелии с использованием селективной минимальной минеральной среды, содержащей нерастворимый фосфат кальция, депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п.Оболенск Серпуховского р-на Московской обл.) под номером В-6646. Штамм обладает высокой способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья, активен против грибов рода Fusarium, стимулирует рост растений, повышает урожайность. Штамм не токсичен для растений и может быть рекомендован для создания на его основе биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами. Изобретение позволяет повысить эффективность борьбы с фузариозами, а также повысить урожайность. 3 табл, 6 пр.

Фосфатрастворяющий штамм бактерий Pseudomonas species 181а для защиты растений от болезней, вызываемых грибами рода Fusarium, и повышения урожайности депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-6646.