ШТАММ БАКТЕРИЙ PSEUDOMONAS LEMOIGNEI ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА, ИСПОЛЬЗУЕМОГО ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА И ЗАЩИТЫ РАСТЕНИЙ ОТ ГРИБНЫХ ФИТОПАТОГЕНОВ В ПРОЦЕССЕ ВЕГЕТАЦИИ И ПРИ ХРАНЕНИИ УРОЖАЯ Российский патент 1998 года по МПК A01N63/00 C12N1/20 C12N1/20 C12R1/38 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству микробиологических средств защиты растений от болезней, и касается нового штамма бактерий Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615, который может быть использован для приготовления препарата, обладающего способностью стимулировать рост растений, ингибировать рост фитопатогенных грибов, защищать сельскохозяйственные культуры от заболеваний в процессе вегетации и повышать сохранность урожая при хранении.

Грибные фитопатогены способны в значительной степени (до 70%) снижать урожай сельскохозяйственных культур. Применяемые химические пестициды со временем становятся малоэффективными вследствие распространения устойчивых к ним рас фитопатогенов. Не менее значим тот факт, что химические пестициды нарушают равновесие природных экосистем и угрожают здоровью нынешнего и будущего поколений людей. Количество микробиологических препаратов и спектр их действия пока очень ограничены, поэтому поиск и внедрение новых экологически чистых средств защиты растений остается актуальной задачей.

Известен бактериальный штамм Bacillus Subtillis ВНИИСХМ 131, используемый для получения препарата для защиты яблок и винограда от возбудителей гнилей при хранении плодов. Штамм выделен из почвы Киевской области в 1976 г. (авт. св. SU N1706504, кл. A 01 N 63/00, опубл. 23.01.92).

Недостатком указанного штамма является то, что он отличается от заявленного штамма по спектру антагонистической активности и номенклатуре сельскохозяйственных культур, на которых он применяется, а также отсутствием способности стимулировать рост растений.

Известен штамм бактерий Pseudomonas fluorescens ВКМ N CR-328Д, используемый для получения препарата против грибковых заболеваний растений. Штамм проявляет антагонистические свойства в отношении ряда грибных фитопатогенов (патент СССР (SU), N 1817874, кл. A 01 N 63/00, 20.05.95).

Недостатком указанного штамма является отсутствие сведений о проявлении ростостимулирующих свойств.

Наиболее близким техническим решением (прототипом) является штамм Preudomonas putida ВКМ В-1743Д, используемый для приготовления препарата против фитопатогенных грибов рода Fusarium и бактерий Erwinia. Указанный штамм обладает способностью стимулировать рост редиса и капусты (патент СССР (SU), N 1805849, кл. A 01 N 63/00, опубл. 30.03.93).

Недостатком штамма-прототипа является ограниченный (2 рода микроорганизмов) спектр подавляемых им фитопатогенов и отсутствие ростостимулирующего действия на зерновые культуры.

Задачей предлагаемого изобретения является получение такого нового штамма бактерий, который обладал бы более широким антагонистическим спектром по сравнению с известными штаммами-аналогами, а также был бы способен стимулировать рост зерновых и других сельскохозяйственных культур и защищать их от почвенных фитопатогенов в процессе вегетации и при хранении урожая.

Указанная задача решается путем получения нового штамма Pseudomonas lemoignei, который депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ВНИИ генетики под регистрационным номером В-6615.

Родословная штамма.

Предлагаемый штамм бактерий Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 выделен сотрудниками ГНЦ ВБ "Вектор" с листовой поверхности ячменя в Новосибирской области.

Физиолого-биохимические свойства.

Клетки палочковидные, прямые, (0,5-1)-(2-4) мкм, подвижные, грамотрицательные, стадии покоя неизвестны.

Облигатный аэроб, оптимальная температура роста 28^oC, оптимум pH 6,8-7,2, растет при 41^oC.

Штамм не требователен к факторам роста, хорошо растет на обычных питательных средах (СПА, МПА, МПБ). Колонии на мясопептонном агаре (МПА) беловатые, слизистые, с ровными краями. На стандартной среде King B продуцируют желто-зеленый флуоресцирующий пигмент, диффундирующий в агар.

В качестве источника углерода использует глицерин, ксилозу, мальтозу, глюкозу, ацетат, цитрат.

Не восстанавливает нитраты, не гидролизует крахмал и желатину; аргинин и бетаин не используются; аргининдигидролаза отсутствует.

Стандартные условия культивирования.

При размножении бактерий штамма Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 используют мясопептонный бульон. Культивирование проводят на качалке или виброреакторе при 28^oC в течение суток.

Для приготовления препарата бактерии штамма размножают на МПБ в условиях интенсивной аэрации при 28^oC, pH 6,8-7,2 до концентрации 5•10⁹ кл./мл.

Биологическая активность.

Препарат, приготовленный на основе штамма Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615, обладает способностью стимулировать рост растений, ингибировать рост фитопатогенных грибов, защищать сельскохозяйственные культуры от заболеваний в процессе вегетации и повышать сохранность урожая при хранении.

Способ хранения. Штамм поддерживают ежемесячными пересевами на среде King B. Хранят на косяках при температуре +4-8^oC. Длительное хранение осуществляется в растворе глицерина при -20-70^oC, либо в лиофилизованном виде.

Патогенность. Штамм Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 непатогенен для человека, животных и растений.

Пример 1. Культивирование штамма Р. lemoignei ВКМ В-6615 и исследование его антагонистической активности.

Штамм P. lemoignei ВКМ В-6615 выращивают на среде МПБ в колбе на качалке при 28^oC в течение 20 часов до концентрации 2•10⁹ кл./мл. Суспензию клеток осаждают на бактериальный фильтр 0,45 мкм Millipore из расчета 1 мл культуры на фильтр. Приготовленные таким образом фильтры помещали в центр чашки с суслоагаром, предварительно засеянным глубинным способом культурой фитопатогенного гриба. Чашки инкубировали при 28^oC от 3-х до 6 суток. Учитывали зоны угнетения роста фитопатогенных грибов.

Изучена антагонистическая активность заявленного штамма в отношении 5 видов фитопатогенных грибов. Полученные данные, отображенные в табл. 1, свидетельствуют о том, что данный штамм эффективно подавляют рост тест-культур 5 видов, относящихся к 4 различным родам фитопатогенных грибов.

Пример 2. Исследование способности штамма P. lemoignei B-6615 подавлять развитие фитопатогенов в ризосфере проростков ячменя.

Выращивание культуры осуществляли, как описано в примере 1. При необходимости бактериальную суспензию разбавляют водопроводной водой. Для эксперимента взяли почву с высоким естественным инфекционным фоном. Семена замачивали в суспензии бактерий в течение 60 минут. Необработанные и обработанные суспензией бактерий семена проращивали при комнатной температуре 20-23^oC. По результатам эксперимента (табл. 2) видно, что в почве с высоким уровнем фитопатогенов уровень всхожести бактеризованных семян на 25% выше, чем контрольных. Прирост зеленой массы и массы корней больше чем в контроле соответственно на 45,6 и 83,7%. Доля пораженных инфекцией растений ниже, чем в контроле почти в 5 раз.

Пример 3. Исследование ростостимулирующего действия бактериальной суспензии штамма P.lemoignei B-6615 на семена растений в гнотобиотических условиях.

Бактериальную суспензию штамма P. lemoignei B-6615 готовят аналогично примеру 1. Семена ячменя дезинфицируют в растворе перекиси водорода. Затем проводят бактеризацию семян как в примере 2. Контрольные (дезинфицированные) и бактеризованные (также предварительно дезифицированные) семена высевали в стерильную (автоклавированную) почву и проращивали в климатической камере при 25^oC. Данные, приведенные в табл. 3, показывают, что через 2 недели после высева зеленая и корневая масса проростков из бактеризованных семян превышала контрольные на 27 и 43% соответственно. На 9% лучше была всхожесть опытных семян. Выше, чем в контроле, была и скорость прорастания.

Полученные данные показывают, что заявленный штамм P.lemoignei B-6615 не только подавляет развитие почвенных фитопатогенов на проростках ячменя, но и способен к прямой стимуляции роста растений в отсутствие фитопатогенов.

Пример 4. Исследование влияния обработки культурой штамма P.lemoignei B-6615 на сохранность клубней картофеля.

Получение бактериальной суспензии описана в примере 1. Клубни картофеля, предназначенные для хранения, обрабатывают суспензией бактерий штамма P.lemoignei B-6615. Контрольные клубни не обрабатывают ничем. Условия хранения (T=+5-8^oC, при относительной влажности 80-90%)- на естественном инфекционном фоне. После 5 месяцев хранения были получены результаты, приведенные в табл. 4, свидетельствующие о том, что бактеризация в 4 раза снижает долю пораженных клубней.

Таким образом, штамм Pseudomobas lemoignei ВКМ B-6615 проявляет стимулирующее действие на рост растений; обладает способностью к ингибированию роста фитопатогенных грибов: Alternaria radiciana, Botrytis cinerea, Fusarium solani, Fusarium sambucinum, Helmintosporium sativum; защищает растения от поражения почвенными фитопатогенами в условиях высоко инфекционного фона во время вегетации и при хранении урожая.

Промышленная применимость. Изобретение относится к области микробиологии и биотехнологии, а именно к производству бактериальных противогрибковых и ростостимулирующих препаратов.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к производству микробиологических средств защиты растений от болезней, и касается получения нового штамма бактерий Pseudomonas lemoignei. Штамм депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) ВНИИ генетики под регистрационным номером В-6615. Для приготовления препарата штамм размножают на мясопептонном бульоне в условиях интенсивной аэрации при 28°С, рН 6,8-7,2 до концентрации 5•10⁹ клеток/мл. Штамм ингибирует рост фитопатогенных грибов Alternaria radiciana, Botrytis cinerea, Fusarium solani, Fusarium sambucinum, Helmintosporium sativum. Препарат стимулирует рост растений, защищает от фитопатогенов как в процессе вегетации растений, так и при хранении урожая, в частности картофеля. 4 табл.

Штамм бактерий Pseudomonas lemoignei ВКМ В-6615 для получения препарата, используемого для стимуляции роста растений, в частности зерновых культур, защиты растений от грибных фитопатогенов в процессе вегетации и при хранении урожая.