ФОСФАТРАСТВОРЯЮЩИЙ ШТАММ ACINETOBACTER SPECIES С ФУНГИЦИДНЫМИ СВОЙСТВАМИ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A01N63/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается нового бактериального штамма Acinetobacter species 305, обладающего способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья и подавлять рост фитопатогенных грибов рода Fusarium, который может быть использован для получения биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.

Проблема фосфорного питания растений остается одной из самых острых в земледелии, что объясняется двумя основными причинами: ограниченным запасом фосфатных руд и быстрым связыванием этого элемента в почве при внесении с удобрениями. Только 5-25% вносимого с химическими удобрениями фосфора ассимилируется растениями (Sample E.C., Soper R.J., Racz G.J. Reactions of phosphate fertilizers in soils // The role of phosphorus in agriculture / Ed. Khasawneh F.E, Sample E.C, Kamprath E.J. Madison, WI: American Society of Agronomy, 1980. P. 263-310; Муромцев Г.С., Маршунова Г.Н., Павлова В.Ф., Зольникова Н.В. Роль почвенных микроорганизмов в почвенном питании растений // Успехи микробиол. 1985. Т.20. С.174-198). Остальная часть фосфатов вымывается или переходит в почве в нерастворимую форму и становится недоступной для растений. При этом производство фосфорсодержащих химических удобрений является энергоемким и дорогостоящим процессом, чрезвычайно загрязняющим окружающую среду. Увеличение норм внесения удобрений нарушает баланс питания растений, снижает качество продукции и нарушает экосистему почв, грунтовых вод и водоемов. В связи с этим в настоящее время во многих странах ведутся интенсивные исследования возможности замены промышленного химического производства фосфорных удобрений микробиологическим (Vassilev N., Vassileva M. Biotechnological solubilization of rock phosphate on media containing agro-industrial wastes // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2003. V.61. P.435-440; Anandham R., Choi K.H., Gandhi P.I., Yim W.J., Park S.J., Kirn K.A., Madhaiyan M., Sa T.M. Evaluation of shelf life and rock phosphate solubilization of Burkholderia sp.in nutrient-amended clay, rice bran and rock phosphate-based granular formulation // World J. Microbiol. Biotechnol. 2007. V.23. №8. P.1121-1129).

В то же время в современном зернопроизводстве очень актуальна проблема борьбы с поражениями посевов хлебных злаков и продуктов их урожая фузариозными гнилями (Соколов М.С., Коломбет Л.В. Агротехногенные факторы минимизации вредоносности фузариоза колоса пшеницы // Агрохимия. 2007. №12. С.63-80). Пшеница, кукуруза и ячмень, составляющие две трети мирового производства злаковых, наиболее подвержены заражению фузариозами. Возбудителями фузариозов колоса зерновых являются в основном грибы рода Fusarium, которые не только снижают урожай, но и загрязняют зерно и производимые из него продукты питания микотоксинами, делая эти продукты опасными для здоровья человека и животных.

Если в качестве микроорганизмов, растворяющих фосфатную руду в полевых условиях, будут использованы антагонисты патогенов сельскохозяйственных культур, и прежде всего возбудителей фузариозов, это позволит значительно снизить применение химических фунгицидов, повысит экологическую безопасность и безопасность продовольствия. Создание комплексного биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами позволит дополнительно повысить экологическую безопасность, в том числе и за счет снижения загрязнения окружающей среды, сопровождающего производство и применение традиционных химических фосфорных удобрений.

В настоящее время известны фосфатрастворяющие микроорганизмы (например, патент США №5026417; Y.P.Chen, P.D.Rekha, A.B.Arum, F.T.Shen, W.-A. Lai, C/C/ Young. Phophate solubilising bacteria from subtropical soil and their tricalcium phosphate solu-bilizing abilities // Applied Soil Ecology. - 2006. - V.34. - P.34-41) и микроорганизмы, на основе которых созданы препараты для борьбы с болезнями растений (например, патент РФ №2019966; В.А.Павлюшин, С.Л.Тютерев, Э.В.Попова, И.И.Новикова, Г.А.Быкова, Н.С.Домнина. Новые комплексные биопрепараты для защиты овощных культур от грибных и бактериальных болезней // Биотехнология. - 2010. - №4 - С.69-80).

Известен штамм Pseudomonas aureofaciens BKM В-2390, предназначенный для защиты растений от грибных патогенов, в том числе от грибов рода Fusarium, для очистки почв от мышьяка и растворяющий фосфаты (Патент РФ №2323967).

Однако антагонистическая и фосфатрастворяющая активность этого штамма характеризуются только качественно, причем последняя констатируется по наличию зоны просветления в агаре, содержащем нерастворимое фосфатное сырье. Известно, что результаты определения растворения фосфатов микроорганизмами, полученные на плотных и жидких средах, часто не совпадают, и для количественной оценки фосфатрастворяющей активности необходимы исследования в жидкой среде (Gupta R., Singal R., Shankar A., Kuhad R.C., Saxena R.K. A modified plate assay for screening phosphate solubilizing microorganisms // J. Gen. Appl. Microbiol. 1994. V.40. P.255-260; Deubel A., Fankem H., Nwaga D., Antoun Y., Merbach W. In vitro mobilization of calcium, iron and aluminum phosphate by rhizosphere bacteria of African oil palm // Proceedings of 3^rd International Symposium on Phosphorus Dynamics in the Soil-Plant Continuum / Ed. Alves V.M.C. et al. Uberlandia, Brazil: Embrapa Milho e Sorgo, 2006. P. 232-233). He подтверждено также влияние заявленного штамма на повышение урожайности.

Наиболее близким к заявляемому изобретению является штамм Pseudomonas sp.NJ-101, который давал зоны ингибирования до 1,8 мм с культурами фитопатогенов, таких как Fusarium oxysporum, F. solani и F. udum, и переводил в раствор до 74,6 мкг/мл фосфата из Са₃(РO₄)₂ (Bano N., Musarrat J. Characterization of a novel carbofuran degrading Pseudomonas sp.with collateral biocontrol and plant growth promoting potential // FEMS Microbiol. Lett. 2004. V.231. P.13-17). Однако активность этого штамма низка и его влияние на повышение урожайности также не подтверждено.

Задачей изобретения является получение нового штамма, обладающего высокой фосфатрастворяющей активностью и способностью к подавлению фитопатогенных грибов рода Fusarium для борьбы с фузариозами и повышения урожайности.

Поставленная задача решается тем, что предлагается штамм Acinetobacter species 305, выделенный из грунта Краснодарского края с использованием селективной минимальной минеральной среды, содержащей нерастворимый фосфат кальция (Са₃(РO₄)₂). Основными критериями отбора служили степень растворения Са₃(РO₄)₂, подавление роста фитопатогенных грибов рода Fusarium, стимуляция роста растений и безвредность для теплокровных.

Предлагаемый штамм Acinetobacter species 305 обладает высокой способностью растворять фосфаты, подавляет рост фитопатогенных грибов рода Fusarium и стимулирует рост растений.

Предлагаемый штамм Acinetobacter species 305 депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск. Серпуховского р-на Московской обл.) под номером В-6645.

Штамм бактерий Acinetobacter species 305 характеризуется следующими свойствами.

Культурально-морфологические признаки

Клетки неподвижные, короткие, палочковидные, грамотрицательные, спор не образуют.

Штамм хорошо растет на следующих средах: гидролизат рыбной муки (ГРМ)-бульон (ФГУН ГНЦПМБ, п.Оболенск)+2% глюкозы, на минеральной среде состава (г/л): K₂НРO₄ 1,5; KН₂РO₄ 3,0; NH₄Cl 0,5; глюкоза 20,0; дрожжевой экстракт 2,0; MgSO₄ 0,4; NaCl 3,0, раствор микроэлементов 10 мл/л (состав раствора микроэлементов, %: сульфат железа (FeSO₄×7H₂O) 0,01; сульфат меди (CuSO₄×5H₂O) 0,1; сульфат марганца (MnSO₄×2H₂O) 0,1; сульфат цинка (ZnSO₄×7H₂O) 0,01).

Морфологию колоний на питательных средах определяют после 1-2 суток роста при 28°С. Колонии на среде ГРМ-агар (ФГУН ГНЦПМБ, п. Оболенск) непрозрачные, круглые, выпуклые, гладкие, слизистые, белого цвета, диаметр 3-4 мм. Штамм формирует на агаре Endo слизистые ярко малиновые колонии без металлического блеска, на агаре Левина - розовые слизистые колонии, на агаре McConkey - фиолетовые колонии, на TSI агаре - выделение газа и изменение цвета агара из малинового в желто-красный.

Физиолого-биохимические признаки

Облигатный аэроб, температурный оптимум роста 28-30°С, не растет при 41°С; растет в пределах рН среды от 3,5 до 8.0.

В дополнительных факторах роста не нуждается (прототроф). Метаболизм глюкозы окислительный. Молекулярный азот не фиксирует. Крахмал гидролизует. Клетчатку не разлагает. Штамм не продуцирует индол, фосфатазу и сероводород, обладает уреазой и b-галактозидазой, b-глюкозидазой, у-глютамилтрансферазой, не разлагает орнитин, аргинин, фенилаланин.

Отношение к источникам углерода

Усваивает с образованием кислоты адонитол, ацетоин, галактозу, глюкозу, дульцитол, инозитол, ксилозу, лактозу, лизин, малонат, мальтозу, маннитол, меллибиозу, рамнозу, рафинозу, сахарозу, сорбитол, трегалозу, фруктозу, целлобиозу, цитрат Симмонса, эскулин.

Отношение к источникам азота

Использует аммиачные и нитратные соли азота в качестве единственного источника азота.

Сапрофит. Штамм не обладает фитопатогенной активностью, о чем свидетельствует отсутствие мацерации на ломтиках картофеля при нанесении на них уколом живых клеток штамма.

Штамм не патогенен для теплокровных: не вызывает гибели мышей линии СВА при подкожном введении 10⁸ КОЕ.

Условия хранения

Штамм бактерий Acinetobacter species 305 хранят на чашках или косяках с ГРМ-агаром при 5-7°С. Пересевы на свежие среды - один раз в месяц. Долгосрочное хранение в лиофильно высушенном состоянии в лактозно-полиглюкиновой защитной среде. Хранить при температуре (4-8)°С, перезакладка через 3 года.

У штамма Acinetobacter species 305 отсутствует фитотоксичность. Показатели фи-тотоксичности штамма Acinetobacter species 305 имеют отрицательные значения (таблица 1), свидетельствующие о наличии стимулирующего рост растений эффекта.

Штамм Acinetobacter species 305 угнетает рост следующих фитопатогенных грибов: Fusarium oxysporum, Fusarium graminearum, Fusarium culmorum.

Возможность осуществления изобретения иллюстрируется приведенными ниже примерами, но не ограничивается ими.

Пример 1. Получение культуры бактерий Acinetobacter species 305.

Культуру клеток штамма Acinetobacter species 305 для испытаний готовят следующим образом: в колбу емкостью 750 мл наливают 150 мл стерильной среды ГРМ-бульон, добавляют 6 мл стерильного 50%-раствора глюкозы и вносят 1-2 мл стационарной культуры штамма Acinetobacter species 305. Культивирование проводят с аэрацией (160-250 об/мин) при 28°С в течение 12-15 ч до конечного титра культуральной жидкости 5-10×10⁹ кл/мл.

Пример 2. Демонстрация отсутствия фитотоксичности у штамма Acinetobacter species 305.

Из культуральной жидкости, полученной по примеру 1, готовят 1% (v/v) суспензию клеток в стерильной дистиллированной воде (0,5-1,0×10⁸ кл/мл). В полученной суспензии замачивают семена пшеницы сорта "Иволга" в течение 2 ч. В контрольном опыте семена замачивают в дистиллированной воде. По 50 семян каждого варианта раскладывают на увлажненную дистиллированной водой фильтровальную бумагу, которую помещают в чашки Петри, и выдерживают в термостате при 28°С в течение 4 суток, постоянно увлажняя. Через сутки оценивают всхожесть семян (таблица 1), а через 4 суток проростки морфометрируют, измеряя длину всех корней и стебля.

Фитотоксическую активность штамма рассчитывают по формуле:

А=(100-Д₀/Д_к×100)%,

где А - показатель фитотоксичности;

Д₀ - средний показатель параметра в опыте;

Д_к - средний показатель параметра в контроле.

Отрицательные значения показателя А свидетельствуют о стимулирующем эффекте.

Таблица 1 Показатель фитотоксичности штамма Acinetobacter species 305 для проростков пшеницы сорта Иволга Вариант обработки семян Всхожесть семян, % к контролю Показатель фитотоксичности, % Корни Стебель Суспензия клеток Acinetobacter species 305 100 -29,4 -19,8

Пример 3. Демонстрация фосфатрастворяющей активности штамма Acinetobacter species 305.

Для определения фосфатрастворяющей активности в колбы вместимостью 750 мл вносят 100 мл стерильной минеральной среды следующего состава (г/л): NH₄Cl 0,16; MgSO₄×7H₂O 0,2; Са₃(РO₄)₂×2Н₂O 5,0; глюкоза 10. В среду вносят 2-3 мл культуры Acinetobacter species 305, выращенной по примеру 1. Инкубирование ведут на качалке New Brunswick при 160-180 об/мин при 28°С.

Для определения количества фосфата, перешедшего в раствор, используют одностадийный метод, основанный на измерении интенсивности окраски его молибденового комплекса с Твином 80 при 350 нм (Пупышев, А.Б. Стабильный реактив для одностадийного определения неорганического фосфата // Лабораторное дело. - 1991. - №9. - С.12-16). Измерение фосфата в растворе проводят в трех повторностях. Через двое суток концентрация фосфата в растворе составляет 2560±140 мкг/мл, что более чем в 30 раз выше, чем у прототипа.

Пример 4. Демонстрация антагонизма штамма Acinetobacter species 305 в отношении фитопатогенных грибов рода Fusarium.

В качестве тест-объектов используют следующие штаммы фитопатогенных грибов рода Fusarium (в скобках указано вызываемое патогенном заболевание): F. graminearum Schwabe 1838 К-33 (фузариоз колоса и зерна), F. culmorum (W.G.Smith 1884) Saccardo 1895 (корневая гниль злаковых), F. oxysporum Schlecht №6 (фузариоз).

Для определения супрессивных свойств используют метод лунок. Суспензии фитопатогенных грибов (10⁵ KОЕ/мл) готовят, смывая мицелиальную и споровую массу с газонов грибов на картофельно-глюкозном агаре (КГА) (Егоров Н.С. Руководство к практическим занятиям по микробиологии. - М.: Изд-во МГУ, 1995. - 217 с.) стерильным раствором 0,9% хлористого натрия. Полученные суспензии в количестве 0,1 мл засевают на поверхность КГА в чашках Петри и растирают шпателем. В центре засеянных патогенами чашек Петри с КГА делают лунки диаметром 4-5 мм, в которые вносят 0,1 мл культуральной жидкости Acinetobacter species 305, полученной по примеру 1. Чашки инкубируют при 28°С в течение 4 суток. Для F. graminearum и F. culmorum зона угнетения составляет 1,5 мм, для F. oxysporum 2 мм.

Пример 5. Демонстрация повышения урожайности пшеницы в результате применения штамма Acinetobacter species 305.

В качестве тест-культуры используют яровую пшеницу сорта «Иволга».

Субстратом для растений служит супесчаная почва с низким содержанием доступного фосфора (менее 3 мг Р₂О₅/100 г почвы по Кирсанову) и рН 6,8. Предварительно почву тщательно перемешивают и просеивают через сито с размером ячеек 2,5 мм, затем стерилизуют автоклавированием в течение 2 часов при давлении 2 атм.

В качестве сосудов для выращивания используют горшки объемом 1,5 л. Для искусственного инфицирования семена обрабатывают суспензией фитопатогена F. graminearum Schwabe 1838 К-33. Для обработки 100 г семян используют 50 мл суспензии конидий гриба F. graminearum с титром 3х10⁵ КОЕ/мл, выращенного на КГА.

Семена высевают по 10 шт.в каждый горшок. После появления всходов часть растений выпалывают с целью выравнивания по высоте, оставляя в каждом горшке по 6 растений. На каждый вариант использовали по 4 горшка.

Источники минерального питания азота и калия вносят дробно в течение вегетационного периода в виде растворов солей. В качестве источника фосфора используют измельченную фосфоритную руду Егорьевского месторождения (содержание оксида фосфора (Р₂O₅) 19,6%). Руду вносят в полной норме однократно, непосредственно перед посевом, перемешивая с почвенной навеской каждого горшка. В вариантах с использованием штамма Acinetobacter species 305 руду сначала перемешивают с биомассой, а затем вносят в почву из расчета 10⁶ клеток на 1 г почвы. Суммарное внесение элементов питания в пересчете на NPK за весь вегетационный период составляет, г на 1 кг сухой почвы: азота (N) 0,15; окиси калия (K₂О) 0,1; Р₂O₅ 0,1.

Растения выращивают в течение 3 месяцев. Результаты по средней массе зерен приведены в таблице 2.

Таблица 2 Влияние штамма Acinetobacter species 305 на урожай пшеницы при различных вариантах обработки № варианта Характеристика варианта Средняя масса зерна, г Инфицирование F. graminearum Внесение штамма Acinetobacter species 305 1 +   4,95±0,20 2 + + 5,68±0,43 3     5,80±0,35 4   + 6,94±0,55

В вариантах с применением штамма Acinetobacter species 305 отмечают более раннее наступление сроков основных фаз развития растений в среднем на 5-7 дней. Также в вариантах с применением штамма Acinetobacter species 305 масса зерна увеличилась на 15-20% по сравнению с соответствующими инфицированным и неинфицированным вариантами.

Таким образом, штамм Acinetobacter species 305 обладает высокой способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья, подавляет рост фитопатогенных грибов рода Fusarium, основных возбудителей болезней зерновых культур, и повышает урожайность. Штамм не токсичен для растений, стимулирует их рост и может быть рекомендован для создания на его основе биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами.

Изобретение относится к биотехнологии. Штамм Acinetobacter species ГКПМ - Оболенск В-6645, обладающий высокой способностью высвобождать фосфаты из нерастворимого минерального сырья, стимулировать рост растений, повышать урожайность, активен против грибов рода Fusarium и депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» (п. Оболенск, Серпуховского р-на Московской обл.) под номером В-6645 и может быть использован при создании биофосфорного удобрения с фунгицидными свойствами. Изобретение позволяет подавлять рост фитопатогенных грибов рода Fusarium. 2 табл., 5 пр.

Фосфатрастворяющий штамм бактерий Acinetobacter species с фунгицидными свойствами для защиты растений от болезней, вызываемых грибами рода Fusarium, и повышения урожайности депонирован в Государственной коллекции патогенных микроорганизмов и клеточных культур «ГКПМ-Оболенск» под номером В-6645.