КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕВРОПАТИИ Российский патент 2012 года по МПК A61K36/8945 A61K31/58 A61P25/02 

Область изобретения

Настоящее изобретение относится к экстракту семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) для профилактики или лечения периферической невропатии, а также к фармацевтической композиции или пищевой композиции, содержащим данный экстракт либо соединение, извлеченное из данного экстракта.

Уровень техники

Невропатия - это заболевание, вызванное структурными или функциональными нарушениями нервной системы. Нервная система подразделяется на центральную нервную систему, распределенную но головному и спинному мозгу и участвующую в контроле их функций, а также периферическую нервную систему, распределенную почти по всем органам, за исключением головного и спинного мозга, и участвующую в контроле функций этих органов. Периферическая нервная система подразделяется на двигательную нервную систему, сенсорную нервную систему и вегетативную нервную систему. Периферический нерв, аксоны которого распространяются за пределы головного и спинного мозга и заканчиваются в туловище, руках и ногах, передает ощущения из рук и ног в центральную нервную систему (головной и спинной мозг), а также передает мускулам команды центральной нервной системы.

Периферический нерв может быть поврежден по разным причинам; в совокупности это явление называется периферической невропатией. Термин «мононевропатия» относится к случаю, когда поврежден один периферический нерв, а термин «множественная невропатия» - к случаю, когда в одинаковой степени повреждены многие периферические нервы. Мононевропатия обычно возникает, когда один периферический нерв аномально сжимается или травмируется на протяжении к концам рук или ног. Мононевропатию можно лечить путем оперативного вмешательства.

Множественная невропатия может быть вызвана различными причинами, такими как заболевания обмена веществ (например, диабет, почечная недостаточность, гипотиреоз), действие лекарств (например, противораковые агенты, противотуберкулёзные лекарства) или отравление токсичными соединениями (например, Рb, органические растворители), нарушение питания (например, недостаток витаминов, алкоголизм), нарушения в соединительных тканях (например, ревматоидный артрит, системная красная волчанка), воспалительные заболевания (синдром Гийена-Барре) либо генетически предопределенная невропатия. Кроме того, множественная невропатия может быть вызвана раковыми заболеваниями.

До настоящего времени невропатию лечили лекарствами, используемыми при симптоматической терапии, которая действует только на симптомы; фундаментальные средства лечения для невропатии практически отсутствуют. Управлением по контролю продуктов питания и лекарственных средств США (FDA) был одобрен лишь эпалрестат (epalrestat) - ингибитор альдозоредуктазы - для лечения диабетической периферической невропатии, одной из множественных невропатий, однако эпалрестат не используется из-за слабого терапевтического действия (Foster D.W. Harrison's Principles of Internal Medicine 13, p.1979, 1999; Stephen L.D. Applied Therapeutics: the clinical use of drugs. 6, p.48.1-48.62, 1996).

Белок, влияющий на рост, дифференциацию и выживаемость нейронов в центральной нервной системе (ЦНС) и периферической нервной системе (ПНС), собирательно называется нейротрофическим фактором (НФ), и он является одним из факторов контроля нейронов, регулирующим рост, дифференциацию и гибель нейронов. Примерами НФ являются вырабатываемый головным мозгом нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3 (NT-3), NT-4 и NT-5. Эти НФ синтезируются разными зонами и имеют различную дифференциацию, различную экспрессию и различные участки воздействия.

Фактор роста нервов (ФРН), один из НФ, ингибирует перерождение и гибель нейронов, чтобы предотвратить уменьшение количества нейронов, защитить нейроны от повреждений и сохранить источники зрелых нейронов (Hefli F. J.Neurosci., 6(8), pp.2155-2162, 1986; Levi-Montalcini R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 46, pp.384-391, 1960). Известно, что при нормальном развитии нервной системы около 50% нейронов в процессе роста удаляются в результате гибели клеток (Raff M.C. et al., Science, 262 (5134), pp.695-70, 1993), и что ФРН, которые выделяет клетка-мишень, определяют выживаемость нейронов. Для выживания, роста и дифференциации нейронов в нормальном состоянии обязательно требуется фактор роста типа ФРН.

Осуществимость ФРН привела к разработке рекомбинантного человеческого фактора роста нервов для лечения диабетической невропатии, являющейся одной из множественных невропатий. Однако рекомбинантный человеческий фактор роста нервов все же не является удовлетворительным с точки зрения безопасности и эффективности (Apfel S.C. et al., Journal of American Medical Association 284(17), pp.2215-2221, 2000).

Раскрытие изобретения

Техническая задача

Настоящее изобретение обеспечивает травяные экстракты и выделенные из них соединения, пригодные для профилактики или лечения периферической невропатии, вызванной различными причинами.

То есть, настоящее изобретение обеспечивает экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) для профилактики или лечения периферической невропатии.

Настоящее изобретение также обеспечивает фармацевтическую композицию или пищевую композицию, содержащую экстракт или соединение, выделенное из этого экстракта, в качестве активного компонента.

Техническое решение

Согласно одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) для профилактики или лечения периферической невропатии, причем семейство диоскорейных (Dioscoreaceae) представляет собой, по меньшей мере, один вид растений, выбранный из группы, состоящей из Dioscorea nipponica, Dioscorea septemloba, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica, Dioscorea bulbifera, Dioscorea tokoro, Dioscorea tenuipes.

Согласно другому аспекту настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, которая содержит терапевтически эффективное количество указанного экстракта, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается пищевая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, которая содержит указанный экстракт в качестве активного компонента.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается фармацевтическая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, которая содержит терапевтически эффективное количество соединения формулы 1 или его соли, а также фармацевтически приемлемый носитель:

[Формула 1]

где R - атом водорода, алкильная группа С₁-С₄ или сахарид.

Согласно еще одному аспекту настоящего изобретения обеспечивается пищевая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, которая содержит соединение формулы 1 или его соль в качестве активного компонента.

Преимущества

Экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) и/или соединение, выделенное из указанного экстракта, стимулирует эндогенный фактора роста нервов в организме, поэтому он может использоваться в широком диапазоне приложений для профилактики или лечения периферической невропатии.

Описание графических материалов

На фиг.1 и 2 показано влияние соединения, выделенного из экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения, на вырастание аксонов.

Фиг.3 представляет собой график, иллюстрирующий изменение уровня фактора роста нервов (ФРН) в сыворотке крови нормальной мыши в результате введения соединения, выделенною из экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения.

Фиг.4 представляет собой график, иллюстрирующий изменение уровня ФРН в сыворотке крови мыши с индуцированным диабетом в результате введения экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения и соединения, выделенного из этого экстракта.

На фиг.5 и 6 показано воздействие соединения, выделенного из экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения, на скорость передачи по двигательному нерву и сенсорном нерву в седалищном нерве мышей с индуцированным диабетом (фиг.5: лечение с помощью DG в течение 1 месяца, фиг.6: лечение с помощью DG в течение 2 месяцев).

Фиг.7 представляет собой график, иллюстрирующий изменение уровня ФРН в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом в результате введения соединения, выделенного из экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения.

Фиг.8 представляет собой график, иллюстрирующий изменение уровня сорбита в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом в результате ведения соединения, выделенного из экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения.

На фиг.9 представлены изображения, иллюстрирующие гистологические изменения в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом в результате введения экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения и соединения, выделенного из этого экстракта.

ЛУЧШИЙ ВАРИАНТ

В данном описании термин «периферическая невропатия» относится к состоянию периферических нервов (двигательных нервов, сенсорных нервов и вегетативных нервов), поврежденных по той или иной причине. Периферическую невропатию можно подразделить на мононевропатию и полиневропатию (которую также называют множественной невропатией). Множественная невропатия включает любую невропатию, вызванную заболеваниями обмена веществ (например, диабетом, почечной недостаточностью, гипотиреозом), действием лекарств (например, противораковых агентов, противотуберкулёзных лекарств) или отравлением токсичными соединениями (например, Pb, органическими растворителями), нарушением питания (например, недостатком витаминов, алкоголизмом), нарушениями в соединительных тканях (например, ревматоидным артритом, системной красной волчанкой), воспалительными заболеваниями (синдромом Гийена-Барре) либо генетически предопределенной невропатией. Кроме того, множественная невропатия может включать невропатию, вызванную генетическими факторами и раковыми заболеваниями.

Экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения или соединение, выделенное из указанного экстракта, вызывает вырастание аксонов и увеличивает количество вырабатываемого эндогенного фактора роста нервов, что приводит к эффективной дифференциации, защите и реиннервации периферической нервной системы. В частности, указанные экстракт и/или соединение допускают пероральное введение, что способствует соблюдению пациентами режима и схемы лечения.

Настоящее изобретение обеспечивает экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) для профилактики или лечения периферической невропатии.

Семейство диоскорейных (Dioscoreaceae) - это, по меньшей мере, один вид растений, выбранный из Dioscorea nipponica, Dioscorea septemloba, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica, Dioscorea bulbifera, Dioscorea tokoro и Dioscorea tenuipes. Предпочтительно семейство диоскорейных (Dioscoreaceae) представляет собой Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba и/или Dioscorea tokoro. Более предпочтительно семейство диоскорейных (Dioscoreaceae) представлено Dioscorea nipponica.

Экстракт в соответствии с настоящим изобретением может быть получен путем процесса экстракции, который включает экстрагирование цельного растения семейства диоскорейных (Dioscoreaceae), корня либо надземной части (например, лист или стебель) при помощи экстракционного растворителя (первого экстракционного растворителя), выбранного из группы, состоящей из воды, спирта С₁-С₄ и смеси воды со спиртом C₁-C₄. Например, экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) может быть получен путем экстрагирования корня семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) первым экстракционным растворителем. Первый экстракционный растворитель может представлять собой смешанный растворитель из воды и метанола либо смешанный растворитель из воды и этанола.

В процессе экстракции цельное растение семейства диоскорейных (Dioscoreaceae), корень либо надземную часть, предпочтительно корень семейства диоскорейных (Dioscoreaceae), разрезают на маленькие куски и затем экстрагируют первым экстракционным растворителем. На этом этапе количество первого экстракционного растворителя может быть в 1-20 раз, предпочтительно в 3-10 раз, больше, чем количество семейства диоскорейных (Dioscoreaceae). Первый экстракционный растворитель может представлять собой смешанный растворитель из воды и метанола (например, раствор метанола концентрации приблизительно 85%) либо смешанный растворитель из воды и этанола (например, раствор этанола концентрации приблизительно 85%). Экстракция не зависит от температуры и может проводиться в различных температурных диапазонах, например от 15 до 100°С. Указанная экстракция может осуществляться методами холодной экстракции, горячей экстракции, экстракции сверхкритическим флюидом, центробежной экстракции, ультразвуковой экстракции либо экстракции с обратным холодильником. Продолжительность экстракции может варьироваться в зависимости от метода экстракции. Например, экстракция может осуществляться однократно либо многократно приблизительно в течение от 1 часа до 10 суток. Предпочтительно экстракция может осуществляться 2 или 3 раза при комнатной температуре в течение приблизительно 2 дней с использованием первой экстракции. Экстракт, полученный путем экстрагирования первым экстракционным растворителем, может быть в виде жидкости, примеси из которой удаляют обычным методом, например путем фильтрования, либо в виде порошка, полученного путем концентрирования жидкою экстракта при пониженном давлении или его высушивания традиционным методом.

Кроме того, при необходимости процесс экстракции может дополнительно включать получение фракции, имеющей более высокое содержание активных компонентов. То есть, процесс экстракции дополнительно включает диспергирование экстракта, полученного путем экстрагирования первым экстракционным растворителем, в воде и экстрагирование полученного раствора водонасыщенным спиртом C₁-C₄ (второй экстракционный растворитель), что повышает содержание активных компонентов в полученном экстракте.

При диспергировании в воде экстракта, полученного путем экстрагирования первым экстракционным растворителем, в воде может быть диспергирована непосредственно жидкая форма, полученная экстрагированием первым экстракционным растворителем, либо порошковая форма, полученная путем концентрирования жидкого экстракта при пониженном давлении и/или высушивания жидкого экстракта традиционным методом.

В качестве водонасыщенного спирта C₁-C₄ (второй экстракционный растворитель) может быть использован водонасыщенный бутанол.

В своем объеме настоящее изобретение включает состав, состоящий из соединения, выделенного из экстракта, т.е. стероидный сапонин или стероидный сапогенин. То есть, настоящее изобретение включает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащую терапевтически эффективное количество соединения формулы 1 или его соли, а также фармацевтически приемлемый носитель:

[Формула 1]

где R - атом водорода, алкильная группа С₁-C₄ или сахарид.

В соединении формулы 1 радикал R может представлять собой водород или метил, предпочтительно водород. Иначе говоря, соединение формулы 1 может представлять собой 3-β, 25R-спирост-5-ен-3-ол.

Сахарид может представлять собой моносахарид, дисахарид или полисахарид, такой как глюкоза, фруктоза, манноза, галактоза, рибоза, целлюлоза, гликоген, сахароза, мальтоза и лактоза.

Соль соединения формулы 1 может представлять собой образованную присоединением широко распространенной неорганической и/или органической кислоты соль, полученную из соединений стероидных сапонина или сапогенина. Примеры соли соединения формулы 1 включают соли, раскрытые в выложенной международной патентной публикации № WO 2003/082893. Эти соли могут быть получены in situ в процессе окончательного отделения и очистки соединения. В частности, соль, образованная присоединением кислоты, может быть получена путем реакции очищенного соединения в виде свободного основания с подходящей органической или неорганической кислотой с последующим отделением полученной соли (см. S.M.Berge et al. Pharmaceutical Salts, J.Pharm. Sci., 66: p.1-19 (1977)). Выложенная международная патентная публикация № WO 2003/082893 и статья M.Berge et аl. в журнале используются в настоящем изобретении в качестве ссылок. Соль, образованная присоединением основания, может быть получена путем реакции очищенного соединения в виде кислоты с подходящим органическим или неорганическим основанием и отделения полученной соли. Соль, образованная присоединением основания, может представлять собой фармацевтически приемлемую соль металла или амина. Соль, образованная присоединением кислоты, может представлять собой соль, полученную из одной из следующих кислот: соляная кислота, серная кислота, фосфорная кислота и азотная кислота. Соль, образованная присоединением основания, может представлять собой соль, полученную из одного из следующих оснований: гидроксид натрия, гидроксид калия, гидроксид аммония.

Соединение формулы 1 может быть выделено из экстракта в соответствии с примером осуществления настоящего изобретения, синтезировано с использованием известного метода (см. Herbert О. House, Modern Synthetic Reactions, The Benjamin Cummings Publishing Company, 1972) либо приобретено (Sigma Co., США).

Способ выделения соединения формулы 1 из экстракта может включать процесс кислотного гидролиза и процесс перекристаллизации с использованием экстракта, полученного согласно примеру осуществления настоящего изобретения (например, экстракта, полученного с использованием первого экстракционного растворителя и второго экстракционного растворителя). Например, способ выделения соединения формулы 1 из экстракта может включать гидролиз кислотой, например 2,5 н. соляной кислотой, при температуре 50-150°С, предпочтительно приблизительно 94°С, в течение от 30 минут до 3 суток, предпочтительно приблизительно 4 часов; экстрагирование полученного продукта гидролиза (т.е. агликонового сапогенина) органическим растворителем, таким как хлороформ, ацетон, бензол или ксилол, в течение 1-60 минут, предпочтительно приблизительно 15 минут, и последующее отделение органического слоя: при необходимости - концентрирование отделенного органического слоя при температуре 10-100°С, предпочтительно 30-35°С; перекристаллизацию органического слоя или концентрированного раствора органического слоя спиртом C₁-C₄ или раствором спирта C₁-C₄ (например, 95%-ным раствором этанола), и промывку полученного осадка водой при необходимости и перекристаллизацию ацетоном.

Настоящее изобретение обеспечивает фармацевтическую композицию для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащую терапевтически эффективное количество экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1 или его соли, а также фармацевтически приемлемый носитель.

Фармацевтическая композиция но настоящему изобретению включает фармацевтически приемлемый носитель и может быть включена в рецептуру лекарственной формы для перорального приема, лекарственной формы для наружного применения, суппозитория или стерильного раствора для инъекций, например в виде порошков, гранул, таблеток, капсул, суспензий, эмульсий, сиропов или аэрозолей. Фармацевтически приемлемый носитель может представлять собой лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритрит, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния или минеральное масло. Фармацевтическая композиция может дополнительно включать разбавитель или заполнитель, такие как наполнитель, расширитель, связующее, увлажнитель, разрыхлитель или поверхностно-активное вещество. Твердый состав для перорального приема может представлять собой таблетку, пилюлю, порошок, гранулу или капсулу. Такие твердые составы могут включать, по меньшей мере, один заполнитель, выбранный, например, из следующих: крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза и желатин. Кроме того, такие твердые составы могут дополнительно включать скользящее вещество, такое как стеарат магния или тальк. Жидкий состав для перорального приема может представлять собой суспензию, раствор, эмульсию или сироп. Кроме того, жидкий состав для перорального приема может дополнительно включать разбавитель, такой как вода, жидкий парафин; увлажнитель; подсластитель; отдушку или консервант. Состав для парентерального введения может представлять собой стерильный водный раствор, неводный раствор, суспензию, эмульсию, лиофилизованный состав или суппозиторий. Неводными растворителями или суспендирующими агентами могут быть пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, натуральное масло, такое как оливковое масло, или инъецируемые эфиры, например этилолеат. В качестве основы для суппозиториев могут применяться витепсол, макрогол, твин 63, масло какао, лауриновое масло, глицерожелатин.

В фармацевтической композиции по настоящему изобретению дозировка экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceue) или соединения формулы 1 может варьироваться в зависимости от состояния пациента или массы его тела, серьезности заболевания, лекарственных форм, путей введения и продолжительности введения. Например, экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединение формулы 1 может применяться в дозировке 0,0001-1000 мг/кг, предпочтительно 0,001-1000 мг/кг, в сутки. Прием фармацевтической композиции может производиться один или несколько раз в сутки. Доза экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1 в фармацевтической композиции по настоящему изобретению может составлять 0,001-50 мас.% в расчете на 100 мас.% фармацевтической композиции.

Фармацевтическая композиция может вводиться млекопитающим, таким как крысы, мыши, домашний скот или люди, различными путями, например перорально, ректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, путем внутриматочной инъекции, инъекции через твёрдую оболочку головного мозга, интрацеребральной или вентрикулярной инъекции.

Настоящее изобретение включает в своем объеме пищевую композицию для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащую в качестве активного компонента экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединение формулы 1.

Пищевая композиция в соответствии с настоящим изобретением может использоваться как оздоравливающая пища. Согласно статье 6727 Закона Республики Корея об оздоравливающей пище, термин «оздоравливающая пища» относится к пище, производимой и обрабатываемой с использованием источника или компонента, оказывающего благоприятное воздействие на тело человека. Термин «воздействие» относится к приему внутрь с целью достижения благоприятного действия на здоровье, т.е. к контролю питательных элементов с учетом структуры и функций тела человека или его физиологии.

Пищевая композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать обычные пищевые добавки. Соответствие «пищевой добавки» требованиям определяется, в отсутствие других нормативов, с учетом стандартов и критериев соответствующего продукта согласно общим правилам кодекса о пищевых добавках и общим испытаниям, утвержденным Управлением по контролю за продуктами и лекарствами Республики Корея.

Продукты, входящие в список «кодекса о пищевых добавках», включают вещества, синтезированные химическим путем, такие как кетон, глицин, цитрат калия, никотиновая кислота, коричная кислота; натуральные добавки, такие как пигмент хурмы, экстракт лакрицы, кристаллическая целлюлоза, пигмент каоляна, гуаровая камедь; или смешанные композиции, такие как состав с L-глютаматом натрия, щелочные добавки для лапши, консерванты, состав с пигментом дегтя.

Пищевая композиция в соответствии с настоящим изобретением может включать экстракт семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединение формулы 1 в количестве 0,01-95 мас.%, предпочтительно 1-80 мас.%, в расчете на 100 мас.% пищевой композиции, с целью профилактики и/или лечения периферической невропатии. Кроме того, с целью профилактики и/или лечения периферической невропатии пищевая композиция может выпускаться и обрабатываться для получения таблеток, капсул, порошка, гранул, жидкости или пилюль.

Например, для производства оздоравливающих пищевых продуктов в форме таблеток смесь экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1, заполнитель, связующее, разрыхлитель и другие добавки могут быть подвергнуты гранулированию традиционным методом, а затем формованию со скользящим веществом. В качестве альтернативы смесь может быть непосредственно подвергнута формованию. Кроме того, при необходимости в состав оздоравливающих пищевых продуктов в форме таблеток могут быть включены подсластители, а при необходимости оздоравливающая пищевые продукты в форме таблеток могут быть покрыты оболочкой.

Что касается оздоравливающих пищевых продуктов в форме капсул, то композиция может производиться в жестких капсулах путем наполнения традиционных жестких капсул смесью экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1 с добавкой, такой как заполнитель, либо гранулами этой смеси, либо покрытыми гранулами этой смеси, либо состав может производиться в мягких капсулах путем наполнения желатиновой основы капсулы смесью экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1 с добавкой, такой как заполнитель. При необходимости в состав для мягких капсул может входить пластификатор, такой как глицерин или сорбит, краситель и консервант.

Оздоравливающие пищевые продукты в форме пилюль могут изготавливаться путем формования смеси экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1, заполнителя, связующего и разрыхлителя подходящим методом. При необходимости оздоравливающие пищевые продукты, изготовленные в форме пилюль, могут быть покрыты белым сахаром или другими материалами для покрытия либо могут быть покрыты крахмалом, тальком или другими материалами.

Оздоравливающие пищевые продукты в форме гранул могут изготовливаться путем гранулирования смеси экстракта семейства диоскорейных (Dioscoreaceae) или соединения формулы 1, заполнителя, связующего и разрыхлителя подходящим методом. При необходимости оздоравливающие пищевые продукты, изготовленные в форме гранул, могут включать в себя ароматизатор и подсластитель.

Заполнитель, связующее, разрыхлитель, скользящее вещество, подсластитель и ароматизатор, используемые в настоящем изобретении, могут быть определены как соответствующие материалы, имеющие такое же или аналогичное назначение и раскрытые в источниках, известных в данной области (The Korean pharmacopoeia review. Moonsungsa Publication Co., Korea Pharmaceutical University Association, Fifth edition, p.33-48, 1989).

Осуществление изобретения

Настоящее изобретение будет описано более подробно со ссылкой на приводимые далее примеры. Данные примеры предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример 1. Получение экстракта

Растения Dioscorea Nipponica высушили и их корни разрезали на мелкие куски. Образец массой 500 г добавили в 10 л 85%-ного раствора метанола и затем трижды экстрагировали (каждый раз по 2 часа) при комнатной температуре. Указанный процесс экстракции повторили два раза. Полученные надосадочные жидкости объединили и сконцентрировали при пониженном давлении, получив таким образом 74 г неочищенного экстракта.

Полученные 74 г неочищенного экстракта суспендировали в 1 л дистиллированной воды и добавили туда 1 л водонасыщенного бутанола, после чего образовавшийся органический слой отделили; данную процедуру повторили 5 раз. Полученные органические слои объединили и высушили при пониженном давлении. В результате получили 17 г экстракта Dioscorea Nipponica.

Пример 2. Получение экстракта

Растения Dioscorea quinqneoloba высушили и их корни разрезали на мелкие куски. Образец массой 500 г добавили в 5 л 85%-ного раствора этанола и трижды экстрагировали (каждый раз по 2 часа) при комнатной температуре. Указанный процесс экстракции повторили два раза. Полученные надосадочные жидкости объединили и сконцентрировали при пониженном давлении, получив таким образом 90 г неочищенного экстракта.

Полученные 90 г неочищенного экстракта суспендировали в 1 л дистиллированной воды и добавили туда 1 л водонасыщенного бутанола, после чего образовавшийся органический слой отделили; данную процедуру повторили 5 раз. Полученные органические слои объединили и высушили при пониженном давлении. В результате получили 26 г экстракта Dioscorea quinqueoloba.

Пример 3. Получение экстракта

Высушили растения Dioscorea tokoro и их корни разрезали на мелкие куски. Образец массой 300 г добавили в 3 л 85%-ного раствора этанола и трижды экстрагировали (каждый раз по 2 часа) при комнатной температуре. Указанный процесс экстракции повторили 2 раза. Полученные надосадочные жидкости объединили и сконцентрировали при пониженном давлении, получив таким образом 35 г неочищенного экстракта.

Полученные 35 г неочищенного экстракта суспендировали в 0,5 л дистиллированной воды и добавили туда 0,5 л водонасыщенного бутанола, после чего образовавшийся органический слой отделили; данную процедуру повторили 5 раз. Полученные органические слои объединили и высушили при пониженном давлении. В результате получили 11 г экстракта Dioscorea tokoro.

Пример 4. Отделение активного соединения

1 г экстракта Dioscorea nipponica, полученного в примере 1, подвергли гидролизу при 94°С в течение 4 ч путем добавления 10 мл 2,5 н. НСl. После этого полученный гидролизат экстрагировали хлороформом (10 мл) в течение 15 минут. Хлороформный слой отделили, профильтровали и затем сконцентрировали при пониженном давлении и температуре 30-35°С. Полученный остаток перекристаллизовали при 4°С, используя 5 мл 95%-ного раствора этанола. Перекристаллизованный осадок отфильтровали, промыли водой, перекристаллизовали при 4°С, используя 3 мл ацетона, и затем отфильтровали, получив около 100 мг осадка. Осадок был идентифицирован как 3b,25R-спирост-5-ен-3-ол, представленный формулой 2

[Формула 2]

(1) Формула: С₂₇Н₄₂O₃

(2) Молекулярная масса: 414.62

(3) Температура плавления: 204-207°С

(4) [α]²⁵ _D:-129°

(5) Данные ЯМР: см. таблицу

¹³С Химический сдвиг (δ)а ¹Н Химический сдвиг (δ)а C-1 37,6-37,7 Н-1 1,60-1,70; 0,87-0,91 (м, о) С-2 30,3-30,4 Н-2 2,00-2,03; 1,75-1,79 (м, о) С-3 78,1-78,7 Н-3 3,81-3,90 (м, J=4,7-5,6 Гц) С-4 38,9-39,5 Н-4 2,57-2,29 (м, J=13-14 Гц; J=5,0; 12,0 Гц) С-5 140,9-141,1 H-5   С-6 121,9-122,0 Н-6 5,23-5,26 (д, J=4,6-5,4 Гц) С-7 32,4-32,5 Н-7 1,77-1,82; 1,41-1,46 (м, о) С-8 31,8-31,9 Н-8 1,44-1,48 (м, о) С-9 50,4-50,5 Н-9 0,80-0,83 (м) С-10 37,2-37,3 H-10   С-11 ~21,3 Н-11 1,35-1,38 (м, о) С-12 40,0-40,1 Н-12 1,60-1,62 (м, о) С-13 40,6-40,7 H-13   С-14 56,8-56,8 Н-14 1,01(м, о) С-15 32,4-32,5 Н-15 1,95-1,98 (м, J=5,9-6,1 Гц); 1,31-1,35 (м, о) С-16 81,3-81,3 Н-16 4,45-4,48 (м, J=7,0-7,4 Гц) С-17 63,0-63,1 Н-17 1,72-1,75 (м, о) С-18 16,5-16,6 Н-18 0,73-0,76 (с) С-19 19,6-19,6 Н-19 0,80-1,00 (с) С-20 42,1-42,2 Н-20 1,88 (м) С-21 15,2-15,2 Н-21 1,05-1,07 (д, J=6,8-7,2 Гц) С-22 109,4-109,5     С-23 32,0-32,0 Н-23 1,57-1,63 (м, о) С-24 29,4-29,5 H-24 1,48-l,52 (м, o) C-25 30,8-30,8 H-25 1,50 (м, о) С-26 67,0-67,1 H-26 3,50-3,40 (м, J=10,5; 3,0; 10,5 Гц) С-27 17,5-17,5 H-27 0,60-0,63 (д, J=4,7-5,8 Гц)

Экспериментальный пример 1. Измерение роста аксонов

В инкубаторе при условиях, включающих содержание СО₂ 5% и температуру 37°С, выращивали клетки PC 12 (феохромоцитома, код АТСС (Американская коллекция культур): CRL-1721) в среде RPMI 1640 с добавкой лошадиной сыворотки (10 об.%), эмбриональной бычьей сыворотки (5 об.%) и 1% пенициллина-стрептомицина.

Для выявления влияния соединения формулы 2 на рост аксонов среды с добавлением 2% лошадиной сыворотки, 1% эмбриональной бычьей сыворотки и 1% пенициллина-стрептомицина добавляли в каждый 6-луночный планшет с нанесенным поли-d-лизином, затем в каждую лунку инокулировали по 5×10⁴ клеток PC12. Через 24 часа эти лунки обрабатывали 10 мкл/мл этанола, 10 мг/мл соединения формулы 2 и 50 и г/мл фактора роста нервов (R&D system, США) соответственно. Затем через 48 часов измеряли длину аксона при помощи инвертированного микроскопа с контрастным устройством (СК-2, Olympus, США) (См. фиг.1 и 2).

Согласно фиг.1 и 2 рост аксонов не наблюдался в группе, инъецированной этанолом (контрольная группа), однако рост аксонов был простимулирован как в группе, обработанной соединением формулы 2 (DG), так и в группе, обработанной фактором роста нервов (ФРН). Соответственно было обнаружено, что соединение формулы 2 стимулировало дифференциацию клеток PC 12 за счет стимулирования роста аксонов.

Экспериментальный пример 2. Измерение уровня фактора роста нервов в мышиной сыворотке

Соединение формулы 2 растворили в 0,2 мл раствора диметилсульфоксид : этанол (3:1) и затем раствор однократно перорально ввели самцам мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста (n=7) в количестве 10 мг/кг. Через 24 часа количество эндогенного фактора роста нервов измерили методом иммуноферментного анализа. Мышам ICR, как контрольной группе, ввели однократно перорально 0,2 мл диметилсульфоксида:этанола (3:1). Затем количество фактора роста нервов в контрольной группе измерили так же, как описано выше.

Как видно на фиг.3, в группе, которой вводилось соединение формулы 2 (DG 10 мг/кг перорально), фактор роста нервов в сыворотке оказался в 2,5 раза выше, чем в контрольной группе. Эти результаты показывают, что соединением формулы 2 можно осуществить лечение невропатии, подавляя перерождение и гибель нейронов у мыши и тем самым предотвращая снижение количества нейронов.

Экспериментальный пример 3. Измерение уровня фактора роста нервов в сыворотке мыши с индуцированным диабетом

Подготовили мышь с аллоксан-индуцированным диабетом в качестве модели животных с диабетической невропатией, одной из множественных невропатий.

Самцов мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста подвергали алиментарной абстиненции в течение 18 часов, затем сделали им однократную интраперитонеальную инъекцию аллоксана, растворенного в физиологическом солевом растворе, с дозировкой 160 мг/кг для индуцирования диабета. Мыши, сохранившие содержание сахара в крови натощак 200 мг/дл или более в течение одной недели, т.е. мыши с индуцированным диабетом, были отобраны и затем разделены на контрольную группу (n=10), группу приема экстракта (n=10) и группу приема соединения (n=10). В контрольной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1); в группе приема экстракта применяли экстракт, полученный в соответствии с примером 1 и растворенный в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), в количестве 100 мг/кг, а в группе приема соединения применяли соединение формулы 2, растворенное в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), в количестве 10 мг/кг. Во всех группах прием осуществляли перорально три раза в неделю, причем общая продолжительность применения составила один месяц. Количество эндогенного фактора роста нервов в сыворотке измеряли методом иммуноферментного анализа.

Согласно фиг.4 количество эндогенного фактора роста нервов в сыворотке как группы приема экстракта (DN 100 мг/кг перорально), так и группы приема соединения (DG 10 мг/кг перорально) было в 3 и 4 раза выше соответственно, чем у контрольной группы, в которой применяли лишь наполнитель. Эти результаты показывают, что экстрактом и соединением по настоящему изобретению можно лечить диабетическую невропатию путем подавления перерождения и гибели нейронов при повреждениях нервов, вызванных диабетом, и тем самым предотвращая снижение количества нейронов.

Экспериментальный пример 4. Измерение скорости передачи по двигательному нерву и сенсорному нерву в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом

Терапевтическое действие соединения по настоящему изобретению на диабетическую невропатию, одну из множественных невропатий, определяли путем измерения воздействия соединения по настоящему изобретению на скорость передачи по двигательному нерву и сенсорному нерву в седалищном нерве.

Самцов мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста подвергали алиментарной абстиненции в течение 18 часов, затем сделали им однократную интраперитонеальную инъекцию аллоксана, растворенного в физиологическом солевом растворе, с дозировкой 160 мг/кг для индуцирования диабета. Мыши, сохранившие содержание сахара в крови натощак 200 мг/дл или более в течение одной недели, т.е. мыши с индуцированным диабетом, были отобраны и затем разделены на контрольную группу (n=7) и группу приема соединения (n=7). В контрольной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1), а в группе приема соединения применяли соединение формулы 2, растворенное в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), в количестве 10 мг/кг. Самцов мышей ICR 7-недельного возраста, у которых диабет не был индуцирован, объединили в нормальную группу (n=7), и в нормальной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1). Во всех группах прием осуществляли перорально три раза в неделю, причем общая продолжительность применения составила 2 месяца. По завершении применения мышей умертвили путем смещения шейных позвонков и затем быстро удалили кожу и мышцы в бедренной области. После этого отделили соответственно левый и правый седалищные нервы длиной 20 мм или более и сохранили их в физиологическом солевом растворе, через который пропускали воздух. Отделенные седалищные нервы поместили на 20-миллиметровую круглую измерительную пластину. После этого к соответствующим концам нервов подключили датчик и возбуждающий зонд и измерили электропроводность при помощи цифрового осциллографа с памятью для определения скорости передачи по нерву (см. фиг.5 и 6).

В общем случае миелин представляет собой фосфолипидную мембрану, несколько слоев которой окружает аксоны; ее также называют миелиновой оболочкой. Подобно пластиковому покрытию электропровода миелин благодаря белому липидному материалу предотвращает утечку и рассеяние электрических сигналов, передаваемых нейронами. Миелин равномерно распределен между узлами Ранвье (часть, формирующая узлы миелина), в которых миелин не образуется, и окружает аксоны. Электрический сигнал передается по пространству, импульсы быстро передаются по нейронам, а миелин повышает скорость прохождения электрических импульсов. Соответственно, при разрушении миелина из-за повреждения нервов в результате невропатии, вызванной диабетом, аксоны прекращают функционировать и скорость передачи по нервам снижается.

В течение одного месяца периода с индуцированным диабетом группа приема соединения (DM-DG) показала скорость передачи по сенсорному нерву на 25% выше, чем контрольная группа с индуцированным диабетом (DM), в которой применяли только наполнитель (см. фиг.5). В течение двух месяцев периода с индуцированным диабетом группа приема соединения (DM-DG) показала скорость передачи по сенсорному нерву на 45% выше, чем контрольная группа с индуцированным диабетом, а также скорость передачи сигнала по двигательному нерву на 40% выше, чем контрольная группа (см. фиг.6). Таким образом, обнаружено, что соединение по настоящему изобретению оказывает терапевтическое действие на повреждение нервов, вызванное диабетической невропатией, за счет повышения скорости передачи по сенсорному и двигательному нервам у мыши с индуцированным диабетом.

Экспериментальный пример 5. Измерение уровня фактора роста нервов в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом

Самцов мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста подвергали алиментарной абстиненции в течение 18 часов, затем сделали им однократную интраперитонеальную инъекцию аллоксана, растворенного в физиологическом солевом растворе, с дозировкой 160 мг/кг для индуцирования диабета. Мыши, сохранившие содержание сахара в крови натощак 200 мг/дл или более в течение одной недели, т.е. мыши с индуцированным диабетом, были отобраны и затем разделены на контрольную группу (n=5) и группу приема соединения (n=5). В контрольной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1), а в группе приема соединения применяли соединение формулы 2, растворенное в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), в количестве 10 мг/кг. Во всех группах прием осуществляли перорально три раза в неделю, причем общая продолжительность применения составила один месяц. Количество эндогенного фактора роста нервов в седалищном нерве измеряли методом иммуноферментного анализа (см. фиг.7).

Согласно фиг.7 было обнаружено, что фактор роста нервов в седалищном нерве группы приема соединения (DM-DG 10 мг/кг перорально) был приблизительно на 30% выше, чем в контрольной группе, которой вводили только наполнитель. Таким образом, сделан вывод, что результаты, показанные на фиг.5 и 6, являются следствием защитного действия фактора роста нервов.

Экспериментальный пример 6. Измерение изменения содержания сорбита в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом

Терапевтический эффект соединения по настоящему изобретению на невропатию определялся путем измерения изменений содержания сорбита в седалищном нерве.

Самцов мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста подвергали алиментарной абстиненции в течение 18 часов, затем сделали им однократную интраперитонеальную инъекцию аллоксана, растворенного в физиологическом солевом растворе, с дозировкой 160 мг/кг для индуцирования диабета. Мыши, сохранившие содержание сахара в крови натощак 200 мг/дл или более в течение одной недели, т.е. мыши с индуцированным диабетом, были отобраны и затем разделены на контрольную группу (n=3) и группу приема соединения (n=3). В контрольной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1), а в группе приема соединения применяли соединение формулы 2, растворенное в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), в количестве 10 мг/кг. Самцов мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста, у которых диaбeт не был индуцирован, объединили в нормальную группу (n=3) и в нормальной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1). В нормальной группе, контрольной группе и группе приема соединения прием осуществляли перорально три раза в неделю, причем общая продолжительность применения составила две недели. По завершении применения мышей умертвили путем смещения шейных позвонков и затем измерили содержание сорбита в седалищном нерве методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) (см. фиг. 8).

Полиоловый путь - это процесс, при котором глюкоза преобразуется в сорбит под действием альдозоредуктазы, а сорбит преобразуется в фруктозу под действием сорбитдегидрогеназы. При гипергликемическом состоянии, таком как диабет, избыточная глюкоза попадает в клетки, а сорбит образуется и накапливается по полиоловому пути. На этом этапе нервы могут повреждаться за счет осмотического эффекта, вызывающего засасывание воды в клетки. Таким образом, в результате измерения влияния соединения по настоящему изобретению на накопление сорбита в седалищном нерве мыши с индуцированным диабетом, как показано на фиг.8, было обнаружено, что содержание сорбита в седалищном нерве у контрольной группы с индуцированным диабетом (DM-CON) было примерно на 40% выше, чем у нормальной группы, но содержание сорбита в седалищном нерве у группы приема соединения (DM-DG), было на 10% ниже, чем у контрольной группы с индуцированным диабетом (DM-CON). Эти результаты показывают, что соединение по настоящему изобретению может частично снижать агрессивные факторы, вызывающие повреждение нервов.

Экспериментальный пример 7. Гистологическое сравнение седалищного нерва мыши с индуцированным диабетом

Терапевтический эффект соединения по настоящему изобретению на невропатию определялся путем измерения гистологических изменений в седалищном нерве.

Самцов мышей ICR (Институт исследований рака) 7-недельного возраста подвергали алиментарной абстиненции в течение 18 часов, затем сделали им однократную интраперитонеальную инъекцию аллоксана, растворенного в физиологическом солевом растворе, с дозировкой 160 мг/кг для индуцирования диабета. Мыши, сохранившие содержание сахара в крови натощак 200 мг/дл или более в течение одной недели, т.е. мыши с индуцированным диабетом, были отобраны и затем разделены на контрольную группу (n=5), группу приема экстракта (n=5) и группу приема соединения (n=3). В контрольной группе применяли по 0,2 мл раствора диметилсульфоксида : этанола (3:1), в группе приема экстракта применяли экстракт, полученный в соответствии с примером 1, растворенный в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), а в группе приема соединения применяли соединение формулы 2, растворенное в растворе диметилсульфоксида : этанола (3:1), в количестве 10 мг/кг. Во всех группах прием осуществляли перорально три раза в неделю, причем общая продолжительность применения составила два месяца. По завершении применения мышей умертвили путем смещения шейных позвонков и затем седалищный нерв отделили, окрасили согласно указанным ниже условиям и визуально исследовали под конфокальным микроскопом при увеличениях 600× и 1200×.

(1) префиксация: 2.5% глутаральдегид, 12 часов или более

(2) промывка: рН 7,4; 0,1 М фосфатный буферный раствор, 2 раза по 15 минут

(3) постфиксация: 1% тетраоксид осмия OsO₄, 60 минут

(4) промывка: рН 7,4; 0,1 М фосфатный буферный раствор, 2 раза по 5 минут

(5) обезвоживание:

50, 70, 80, 90 % спирт: по 10 минут в каждом растворе

100%-ный спирт: 2 раза по 15 минут

(6) замещение: пропиленоксид, 2 раза по 15 минут

(7) пропитка: пропиленоксид (1), ЕРОК 812 (2), 12 часов или более

(8) заключение: очищенный ЕРОК 812 (полимеризация при 80°С): 12 часов или более

(9) секционирование: секция средней толщины, 35-95 мкм

(10) контрастирование: 1% толуидиновый синий

Фиг. 9А и 9В показывают результаты, полученные при 600-кратном (9А) и 1200-кратном увеличении (9В) соответственно. В группе с индуцированным диабетом (DM) аксон и миелин в центральной части седалищного нерва были в значительной степени разрушены. Однако в группе приема соединения (DM-DG) и в группе приема экстракта (DM-DN) аксон и миелин в центральной части седалищного нерва были четко видны. Полученные результаты показывают, что экстракт или соединение в соответствии с настоящим изобретением могут защищать и лечить нервы, поврежденные из-за невропатии.

Из соединения по настоящему изобретению были приготовлены составы, описанные ниже. Однако данные примеры составов предназначены только для иллюстрации и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения.

Пример состава 1. Состав таблеток

Соединение формулы 2 200 мг Лактоза 100 мг Крахмал 100 мг Стеарат магния по потребности

Указанные соединения смешали и спрессовали в таблетки обычным методом изготовления таблеток.

Пример состава 2. Жидкий состав

Соединение формулы 2 1000 мг КМЦ-Na 20 г Изомеризованный сахар 20 г Лимонный ароматизатор по потребности

Добавили очищенную воду до общего объема раствора 1000 мл. Указанные компоненты перемешали в соответствии с обычным методом приготовления жидких составов, залили в коричневую бутыль и простерилизовали, получив таким образом жидкий состав.

Пример состава 3. Состав капсул

Соединение формулы 2 300 мг Кристаллическая целлюлоза 3 мг Лактоза 14,8 мг Стеарат магния 0.2 мг

Указанные компоненты перемешали в соответствии с обычным методом приготовления составов для капсул и заполнили этой смесью желатиновые капсулы, получив таким образом состав для капсул.

Пример состава 4. Состав для инъекций

Соединение формулы 2 300 мг Маннит 180 мг Стерильная дистиллированная вода для инъекций 2974 мг Na₂HPO₄·12H₂O 26 мг

Инъекцию, содержащую компоненты в указанных выше количествах в расчете на одну ампулу (2 мл), приготовили обычным способом изготовления инъекций.

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к композиции для профилактики или лечения периферической невропатии. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащая терапевтически эффективное количество соединения, представленного формулой 1, или его соли и фармацевтически приемлемый носитель:

[Формула 1]

где R - атом водорода, алкильная группа C₁-C₄ или сахарид. Пищевая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащая соединение, представленное формулой 1, или его соль в качестве активного компонента. Вышеописанные композиции эффективны для профилактики или лечения периферической невропатии. 2 н. и 4 з.п. ф-лы, 9 ил., 1 табл., 15 пр.

1. Фармацевтическая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащая терапевтически эффективное количество соединения, представленного формулой 1, или его соли и фармацевтически приемлемый носитель:
[Формула 1]

где R - атом водорода, алкильная группа C₁-С₄ или сахарид.

2. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой R - атом водорода.

3. Фармацевтическая композиция по п.1, в которой сахарид выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, рибозы, целлюлозы, гликогена, сахарозы, мальтозы и лактозы.

4. Пищевая композиция для профилактики или лечения периферической невропатии, содержащая соединение, представленное формулой 1, или его соль в качестве активного компонента
[Формула 1]

где R - атом водорода, алкильная группа C₁-C₄ или сахарид.

5. Пищевая композиция по п.4, в которой R - атом водорода.

6. Пищевая композиция по п.4, в которой сахарид выбран из группы, состоящей из глюкозы, фруктозы, маннозы, галактозы, рибозы, целлюлозы, гликогена, сахарозы, мальтозы и лактозы.