КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКСТРАКТ ТРАВЯНОЙ КОМБИНАЦИИ, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ Российский патент 2015 года по МПК A61K36/8945 A61P3/10 A61P25/00 

Описание патента на изобретение RU2566721C2

Область техники, к которой относится изобретение

Настоящее изобретение относится к композиции для профилактики и терапии диабетической периферической нейропатии, содержащей травяной экстракт смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.).

Благодарности

Эта работа получила поддержку в рамках программы Global Leading Technology департамента стратегических исследований и планирования развития (OSP), финансируемой Министерством инновационной экономики, республики Корея. (№ 10039303).

Предшествующий уровень техники

Частота возникновения сахарного диабета быстро увеличивается во всем мире. По оценкам всемирной организации здравоохранения приблизительно 180 миллионов человек страдают сахарным диабетом по данным на 2008 год, с перспективой удвоения числа больных диабетом к 2030 году. Таким образом, финансовые и общественные затраты, ассоциированные с диабетом, повысились, и наблюдается увеличение смертности от осложнений диабета. Однако начало или прогрессирование диабета можно замедлять, точно регулируя уровень сахара в крови, таким образом, важно поддерживать эугликемию наряду с изменением образа жизни и адекватным лечением.

Сахарный диабет является основной известной причиной нейропатии в развитых странах. Диабетическая периферическая нейропатия представляет собой термин, используемый для описания симптомов, соответствующих вызываемому диабетом нарушению периферийной нервной системы. Она представляет собой наиболее распространенное осложнение, с которым сталкиваются больные диабетом.

Диабетическая периферическая нейропатия ухудшает качество жизни пациентов с диабетом и представляет собой основную причину смертности пациентов. Распространенность диабетической периферической нейропатии у пациентов с диабетом увеличивается с возрастом пациента и продолжительностью диабета. Диабетическая периферическая нейропатия возникает у пациентов с диабетом 1 типа и 2 типа с более высокой распространенностью у пациентов с диабетом 2 типа (32,1%), чем у пациентов с диабетом 1 типа (22,7%) (Primary Care Diabetes, Volume 1, Issue 3, September 2007, Pages 129-134, Diagnosis of diabetic peripheral neuropathy among patients with type 1 and type 2 diabetes in France, Italy, Spain, and the United Kingdom).

Приблизительно 10% пациентов с диабетом жалуются на постоянную боль, которая может быть спонтанной или может возникать под воздействием стимулов. Боль может усугубляться или становиться некурабельной. Диабетическая периферическая нейропатическая боль является более тяжелой, как правило, ночью, и ее описывают преимущественно как дискомфорт с чувством жжения, колющая боль, язвы, чувство напряжения и т.п. Кроме того, диабетическую периферическую нейропатическую боль чаще чувствуют в ногах, чем в руках. Часто сильная боль может приводить к потере массы или депрессии (Pain Medicine, Volume 8, Number S2 2007, Diabetic Peripheral Neuropathic Pain: Recognition and Management).

Диабетическую периферическую нейропатию диагностируют тестом на мышечную силу и измерением тактильной чувствительности, температурной чувствительности, вибрационной чувствительности, скорости кровотока кожи периферических отделов и нервной проводимости. Диабетическую периферическую нейропатию в настоящее время лечат, контролируя уровень сахара в крови, этиологическим лечением и симптоматическим лечением. Вследствие того, что корреляция гипергликемии и прогрессирования нейропатии является хорошо установленной и выявленной во многих исследованиях, в которых описывают высокий коэффициент распространенности диабетической периферической нейропатии у пациентов с диабетом, которые не контролируют свой сахар в крови, где контролирование сахара в крови признают как первичный способ предотвращения/лечения диабетической периферической нейропатии (N. Engl. J. Med. 1993, 329:977-86, The effect of intensive treatment of diabetes on the development and progression of long-term complications in insulin-dependent diabetes mellitus).

Характерными среди этиологических терапевтических средств для диабетической нейропатии являются альфа-липоевая кислота, ингибиторы альдозоредуктазы и гамма-линолевая кислота. α-липоевая кислота (тиоктовая кислота), антиоксидант, уменьшает индуцируемый гипергликемией окислительный стресс, который приводит к гибели нервных клеток, таким образом, блокируя этиологические факторы диабетической нейропатии. Предотвращая прохождение глюкозы по полиоловому пути в нервных клетках, ингибиторы альдозоредуктазы могут подавлять аккумуляцию сорбита, который приводит к повреждению нервной клетки, блокировать прогрессирование диабетической нейропатии. Однако разработка большинства из них была прекращена на полпути вследствие побочных эффектов и недостаточного финансирования. В настоящее время используют только эпалрестат в Японии. Выявлено, что γ-линоленовая кислота, которая является компонентом фосфолипидов мембраны нервной клетки и компонентом простагландина E, который играет важную роль в гомеостазе кровотока в нервных клетках, уменьшает некоторые симптомы диабетической нейропатии (BMJ, 2007, Jul 14, 335(7610):87. Epub. 2007 Jun 11, Review. Effects of treatments for symptoms of painful diabetic neuropathy: systematic review).

Симптоматические терапевтические средства для облегчения боли диабетической нейропатии включают трициклические антидепрессанты, противосудорожные средства, избирательные ингибиторы обратного захвата серотонина и капсаицин для местного применения. Трициклические антидепрессанты (TCA) действуют, ингибируя обратный захват серотонина и норадреналина в центральной нервной системе, блокируя проведение боли, а также повышая уровень эндогенного эндорфина, облегчая боль. Противосудорожные средства и избирательные ингибиторы обратного захвата серотонина используют в качестве альтернативных вариантов для пациентов с непереносимостью TCA. Капсаицин для местного применения, известный как пригодный для болевой дизестезии, инициирует высвобождение нейропептида, субстанции P из ноцицептивных волокон типа C и подавляет накопление субстанции P, препятствуя проведению и распространению периферических болевых сигналов, что приводит к уменьшению боли.

Однако затруднительно найти терапии, которыми адекватно лечат пациентов с диабетической периферической нейропатией, вследствие того, что существует большое многообразие этиологических факторов и симптомов. На практике для облегчения боли и подавления прогрессирования диабетической периферической нейропатии предпочтение отдают симптоматическому лечению перед этиологическим лечением. Таким образом, существует возрастающая потребность в терапии, которая может устранять диабетическую периферическую нейропатию, восстанавливая разрушенные при диабете нервы. Фактор роста нервов, функционирующий, облегчая восстановление нейронов, выступает как эффективный кандидат для лечения диабетической периферической нейропатии.

Многие проведенные исследования свидетельствуют о том, что биосинтез фактора роста нервов (NGF) и ретроградный транспорт в нейронах у индивидуумов с диабетом являются повышенными, и таким образом, их рассматривают как один из этологических факторов диабетической периферической нейропатии. У здоровых индивидуумов NGF продуцируется в кератиноцитах кожи и взаимодействует с рецептором trkA. С другой стороны, низкий уровень NGF наблюдают в кератиноцитах кожи пациентов с диабетом, для которого известно, что он ассоциирован с декомпенсацией чувствительных нервных волокон (Diabetes Obes Metab., 2008 Feb, 10(2):99-108. Epub 2007 Jun 26, Review. Diabetic neuropathy: new strategies for treatment).

Проведенные исследования демонстрируют, что введение NGF приводит к уменьшению боли и симптомов у животных с индуцированной диабетической периферической нейропатией. На основании этих результатов также проводили клинические испытания на пациентах с диабетической нейропатией. В рандомизированном плацебо-контролируемом клиническом испытании 2 фазы, симптомы и боль у пациентов с диабетической периферической нейропатией уменьшались после введения рекомбинантного NGF человека три раза/неделю в течение 6 месяцев. Однако рандомизированное плацебо-контролируемое клиническое испытание 3 фазы проводили в течение 48 недель, тем не менее не являлось в значительной степени эффективным вследствие боли на участке инъекции и незначительных фармацевтических эффектов. Таким образом, последующие исследования были направлены на индуцирование биосинтеза эндогенного NGF, а не на пополнение внешнего NGF (Am. J. Med., 1999 Aug 30, 107(2B):34S-42S, Review. Neurotrophic factors in the therapy of diabetic neuropathy).

Dioscorea Rhizoma, растение, принадлежащее к Dioscoreaceae, представляет собой термин для свежего корневища Dioscorea batatas Decaisne или Dioscorea japonica Thunberg, лишенного перидермы, или для корневища, получаемого после того, как свежее корневище пропарили и высушили в лекарственное средство из растительного сырья. Растение содержит диосцин, сапонин стероидного типа, и аллантоин.

Dioscorea nipponica, корневище вьющегося многолетнего растения Dioscorea nipponica Makino, содержит различные сапонины стероидного типа, включая диосцин, просапоген A и просапоген C.

В лекарственном средстве из растительного сырья эти травы используют отдельно или в комбинации с другими травами. В опубликованных ранее документах не описана медицинская эффективность экстракта из комбинации этих двух трав в отношении диабетической периферической нейропатии.

Патент Кореи № 854621 относится к композиции для предотвращения и лечения периферической нейропатии, содержащей экстракт из растения, выбранного из числа Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica и Dioscorea tokora, в котором описано, что композиция индуцирует рост невритов и увеличивает секрецию эндогенного фактора роста нервов, таким образом, является эффективной для предотвращения и лечения периферической нейропатии.

Авторы настоящего изобретения подтверждают, что действием экстракта из растения, выбранного из числа Dioscorea nipponica, Dioscorea quinqueoloba, Dioscorea batatas, Dioscorea japonica и Dioscorea tokora, являлась индукция значительного роста невритов и увеличение секреции эндогенного NGF, как описано в патенте Кореи № 854621. Неожиданно, авторы настоящего изобретения выявили посредством экспериментов на моделях на животных, что экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в конкретном отношении обеспечивает терапевтически синергическое действие в отношении диабетической периферической нейропатии, повышая уровень NGF in vivo, например, в плазме и в слюнной железе, в очень значительной степени и облегчая вызываемую диабетической нейропатией боль, высокочувствительную к термическим и механическим стимулам, тогда как экстракты из каждой или из комбинации этих трав обладают одинаковым действием в отношении роста невритов и секреции эндогенного фактора роста нервов, что привело к настоящему изобретению.

Описание изобретения

Техническая проблема

Целью настоящего изобретения является предоставление растительной композиции, получаемой из трав, раскрытых в патенте Кореи № 854621, обладающей действием в отношении значительного увеличения in vivo уровня фактора роста нервов (NGF), терапевтически эффективной в отношении диабетической периферической нейропатии.

Другой целью настоящего изобретения является предоставление фармацевтической композиции и функционального оздоровительного пищевого продукта для профилактики и терапии диабетической периферической нейропатии, содержащих растительную композицию.

Решение проблемы

Целей настоящего изобретению можно достигать предоставлением фармацевтической композиции и функционального оздоровительного пищевого продукта, содержащих травяной экстракт, получаемый из смеси 3,5:1 (мас./мас.) Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica, пригодный для предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии.

По одному из аспектов настоящее изобретение относится к травяному экстракту из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica. Более конкретно травяной экстракт, к которому относится настоящее изобретение, получают из смеси, содержащей Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в массовом отношении 3,5:1 (мас./мас.).

Травяной экстракт по настоящему изобретению можно получать из смеси высушенных Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica холодным осаждением в 50% этаноле при комнатной температуре в течение 48 часов с последующей концентрацией в вакууме. Более подробно, Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica промывают, сушат, режут и смешивают в массовом отношении Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 и подвергают смесь однократному холодному осаждению в 5 массовых частях 50% этанола при комнатной температуре в течение 48 часов с последующим концентрированием экстракта при сниженном давлении.

Согласно другому аспекту настоящее изобретение относится к композиции для профилактики и терапии диабетической периферической нейропатии, содержащей в качестве активного ингредиента травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в комбинации с фармацевтически приемлемым носителем, разбавителями или эксципиентом.

Композиция по настоящему изобретению содержит травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в количестве от 0,01 до 80 мас.% от общей массы композиции и предпочтительно в количестве от 1 до 50 мас.%

Специалистам в данной области следует понимать, что симптомы диабетической нейропатии включают потерю чувствительности, такую как тактильная чувствительность, вибрационная чувствительность, температурная чувствительность и т.д., и боль, такую как дискомфорт с чувством жжения, колющие боли, болезненное ощущение, чувство напряжения и т.п.

Композиция на основе травяного экстракта из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением может дополнительно содержать подходящий носитель, эксципиент или разбавитель.

Примеры носителя, эксципиента или разбавителей, пригодных в композиции по настоящему изобретению, включают лактозу, декстрозу, сахарозу, сорбит, маннит, ксилит, эритритол, мальтит, крахмал, гуммиарабик, альгинат, желатин, фосфат кальция, силикат кальция, целлюлозу, метилцеллюлозу, микрокристаллическую целлюлозу, поливинилпирролидон, воду, метилгидроксибензоат, пропилгидроксибензоат, тальк, стеарат магния и минеральное масло.

Композицию по настоящему изобретению можно формулировать в пероральных лекарственных формах, таких как порошки, гранулы, таблетки, капсулы, суспензии, эмульсии, сиропы, аэрозоль и т.д., местных средств, суппозиториев или стерильных инъекционных растворов. Фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно формулировать в комбинации с разбавителем или эксципиентом, таким как наполнитель, сгущающее средство, связывающее средство, средство для смачивания, дезинтегрант, поверхностно-активное вещество и т.д. Твердые препараты, предназначенные для перорального введения, могут находиться в форме таблеток, пилюль, порошков, гранул, капсул и т.п. В отношении таких твердых средств объединенный травяной экстракт по настоящему изобретению формулируют в комбинации по меньшей мере с одним эксципиентом, таким как крахмал, карбонат кальция, сахароза, лактоза или желатин. В дополнение к таким простым эксципиентам, можно использовать смазочные средства, такие как стеарат магния и тальк. Жидкие препараты, предназначенные для перорального введения, включают суспензии, растворы для внутреннего применения, эмульсию, сиропы и т.п. В дополнение к простому разбавителю, такому как вода или парафиновое масло, в жидких препаратах могут содержаться различные эксципиенты, такие как средства для смачивания, подсластители, ароматизаторы, консерванты и т.п. Также фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить непероральным путем. Для этого можно использовать стерильные водные растворы, неводные растворители, суспензии, эмульсии, лиофилизаты, суппозитории и т.п. Для неводных растворителей и суспензий подходящими могут являться инъецируемый пропиленгликоль, полиэтиленгликоль, растительные масла, такие как оливковое масло, и сложные эфиры, такие как этилолеат. Основные минеральные вещества суппозиториев включают витепсол, макрогол, Tween 61, масло какао, лауриновое масло и глицерожелатин.

В соответствии с дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к использованию травяного экстракта из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) при получении терапевтического средства для диабетической периферической нейропатии.

В соответствии с еще одним дополнительным аспектом настоящее изобретение относится к способу лечения диабетической нейропатии, включающему введение фармацевтической композиции в терапевтически эффективном количестве нуждающемуся в этом млекопитающему, где указанная фармацевтическая композиция содержит травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.).

Дозирование фармацевтической композиции, содержащей травяной экстракт смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.), может изменяться в зависимости от различных факторов, включая возраст, пол, массу и состояние здоровья пациентов, рацион питания, время введения, путь введения, скорость экскреции и т.п. Как правило, фармацевтическую композицию по настоящему изобретению можно вводить в виде однократной дозы или в виде многократных доз один раз в сутки при суточном дозировании в диапазоне от 0,01 до 10 г/кг и предпочтительно от 1 до 5 г/кг. Однако специалистам в данной области следует понимать, что дозирование не ограничивает каким-либо образом настоящее изобретение.

Фармацевтическую композицию, содержащую травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением, можно вводить различными путями млекопитающим, таким как крысы, мыши, домашний скот, люди и т.д. Можно рассматривать все пути введения, например, фармацевтическую композицию можно вводить перорально, интраректально, внутривенно, внутримышечно, подкожно, внутриматочно, интрадурально или интрацереброваскулярно.

Практически не обладающий токсичностью и побочными эффектами, травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) можно безопасно принимать внутрь в течение длительного периода времени с целью предотвращения диабетической нейропатии.

В настоящем изобретении проводили тесты in vivo для определения способности травяного экстракта из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) повышать уровень фактора роста нервов in vivo и уменьшать симптомы диабетической периферической нейропатии. Данные от моделей на животных, которые соответственно являлись здоровыми и страдающими диабетической нейропатией, демонстрировали, что экстракт из смеси трав конкретного отношения в соответствии с настоящим изобретением обладал терапевтически синергическим действием по сравнению с экстрактами из отдельных трав или смеси трав других массовых отношений.

В соответствии с еще одним аспектом предусматривают, что настоящее изобретение представляет собой функциональные оздоровительные пищевые продукты для предотвращения и улучшения состояния диабетической нейропатии, содержащие травяной экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) и ситологически приемлемую пищевую добавку.

В рамках изобретения предполагают, что термин "функциональные оздоровительные пищевые продукты" включает такие продукты, которые определены в "2002 Law for health functional foods", такие как диетические пищевые продукты, встречающиеся в списке установленных веществ или ингредиентов для функциональных оздоровительных пищевых продуктов, верифицированных в отношении функциональности и безопасности для людей, в соответствии со статьей KFDA № 2004-12 Управления по контролю качества продуктов и лекарств Кореи.

Более конкретно, настоящее изобретение относится к функциональным оздоровительным пищевым продуктам для предотвращения и улучшения состояния диабетической нейропатии, содержащим экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 и ситологически приемлемую пищевую добавку.

Композицию, содержащую экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 в соответствии с настоящим изобретением, можно применять для лекарственного средства, пищевого продукта и напитка для уменьшения симптомов диабетической нейропатии. Например, пищевые продукты, к которым можно добавлять экстракт трав по настоящему изобретению, включают напитки, жевательную резинку, чаи, витаминные комплексы и пищевые добавки. Для применения в лекарственных средствах экстракт трав может находиться в форме пилюль, порошков, гранул, таблеток, капсул или жидкостей.

Когда применяют для твердых пищевых продуктов, экстракт трав по настоящему изобретению можно использовать в количестве от 0,1 до 15 мас.% от общей массы пищевого продукта и предпочтительно в количестве от 0,2 до 10 мас.%. В жидкой форме диетического пищевого продукта экстракт трав по настоящему изобретению может содержаться в количестве в диапазоне от 0,1 до 30 г на 100 мл жидкости и предпочтительно от 0,2 до 5 г.

За исключением конкретного отношения, указанного для нежелательных ингредиентов трав, не предусматривают конкретных ограничений для жидкой композиции диетического пищевого продукта. Как характерные напитки, жидкая композиция диетического пищевого продукта может дополнительно содержать различные ароматизаторы, природные углеводы или другие добавки.

Предпочтительные примеры природных углеводов включают моносахариды, такие как глюкоза, фруктоза и т.д., дисахариды, такие как мальтоза, сахароза и т.д., полисахариды, такие как декстрин, циклодекстрин и т.д., и сахарные спирты, такие как ксилит, сорбит, эритритол и т.д. Пригодные в настоящем изобретении ароматизаторы могут быть природными (тауматин, экстракт стевии, например, ребаудиозид A, глициризин) или синтетическими (сахарин, аспартам). Природные углеводы можно использовать в количестве приблизительно от 1 до 20 г на 100 мл жидкой композиции диетического пищевого продукта и предпочтительно в количестве приблизительно от 5 до 12 г.

Кроме того, композиция по настоящему изобретению может содержать различные питательные вещества, витамины, минералы (электролиты), синтетические и/или природные ароматизаторы, красители, наполнители (сыр, шоколад и т.д.), пектиновую кислоту и ее соли, альгиновую кислоту и ее соли, органические кислоты, защитные коллоидные загустители, регуляторы pH, стабилизаторы, консерванты, глицерин, спирты и карбонизирующие средства для карбонатных напитков. Для применения в натуральном фруктовом соке, напитках на основе натуральных фруктовых соков или овощных напитках композиция по настоящему изобретению может дополнительно содержать мякоть фруктов. Эти добавки можно использовать отдельно или в сочетании. Как правило, но необязательно, количества добавок находятся в порядке от 0 до 20 массовых частей на 100 массовых частей композиции.

Полезные эффекты изобретения

Как описано ранее, экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением обладает значительно более высоким синергическим действием в отношении увеличения уровня фактора роста нервов (NGF) in vivo, роста невритов и когнитивной способности по сравнению с аналогичными показателями для экстрактов только из Dioscorea Rhizoma или Dioscorea nipponica или смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях, и таким образом можно использовать в фармацевтических композициях и функциональных оздоровительных пищевых продуктах для предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии.

Краткое описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой электронные фотоснимки, демонстрирующие эффект экстракта примера 1 на седалищный нерв мышей с диабетом 1 типа.

Фиг. 2 представляет собой электронные фотоснимки, демонстрирующие эффект экстракта примера 1 на седалищный нерв крыс с диабетом 1 типа.

Способ осуществления изобретения

Лучшее понимание настоящего изобретения можно получать посредством следующих ниже примеров, которые приведены для иллюстрации, и не следует их интерпретировать как ограничивающие настоящее изобретение.

Пример 1: Получение экстракта смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica

Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica, обе в сухом состоянии, приобретали в магазине лекарственных трав на рынке Kyoungdong, Корея. Затем из них удаляли примеси, травы измельчали с использованием устройства для нарезания и смешивали в массовом отношении Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1. К 2 кг смеси добавляли 10 л 50% раствора этанола с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 48 часов при перемешивании. Смесь трав удаляли фильтрованием и концентрировали фильтрат в вакууме и сушили сублимацией с получением смешанного экстракта трав (неочищенного экстракта) (см. таблицу 1)

Таблица 1
Выход продукта объединенного травяного экстракта по изобретению
Пример Количество вещества Растворитель Количество растворителя Промывание Температура экстрак
ции
Время экстракции Неочищенный экстракт (г) Выход продукта (%)
D. Rhizoma D. nipponica Пример 1 1,55 кг 0,45 кг 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 212,85 10,64

Сравнительный пример 1: Получение экстракта Dioscorea Rhizoma

Экстракт Dioscorea Rhizoma (неочищенный экстракт) получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали 2 кг Dioscorea Rhizoma вместо 2 кг смеси (см. таблицу 2).

Сравнительный пример 2: Получение экстракта Dioscorea nipponica

Экстракт Dioscorea nipponica (неочищенный экстракт) получали таким же образом, как в примере 1, за исключением того, что использовали 2 кг Dioscorea nipponica вместо 2 кг смеси (см. таблицу 2).

Таблица 2
Выход продукта соответствующих экстрактов из D. Rhizoma и D. Nipponica
№ сравнит. примера Количество вещества Растворитель Количество растворителя Промывание Температура экстракции Время экстракции Неочищенный экстракт (г) Выход продукта (%) D. Rhizoma D. nipponica 1 2 кг - 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 253,8 12,69 2 - 2 кг 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 160,0 8,00

Сравнительный пример 3-10: Получение экстрактов из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica

Использовали аналогичные травы Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica, как использовали в примере 1. Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica измельчали с использованием устройства для нарезания и смешивали в массовых отношениях, указанных в таблице 3. К 2 кг каждой смеси добавляли 10 л 50% раствора этанола с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 48 часов при перемешивании. Смеси трав удаляли фильтрованием и концентрировали фильтрат в вакууме и сушили сублимацией с получением смешанных экстрактов трав (неочищенные экстракты).

Таблица 3
Выход продукта объединенного экстракта смеси D. Rhizoma и D. Nipponica
№ сравнит. примера Количество вещества Растворитель Промывание Температура экстракции Время экстракции Неочищенный экстракт (г) Выход продукта (%) D. Rhizoma D. nipponica Вид Количество 3 1 1 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 179,05 8,95 4 1,33 0,67 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 135,96 6,80 5 1,67 0,33 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 160,07 8,00 6 1,82 0,18 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 138,75 6,93 7 0,67 1,33 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 153,56 7,68 8 0,45 1,55 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 139,15 6,96 9 0,33 1,67 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 181,06 9,05 10 0,18 1,82 50% EtOH 10 л 1 л Комнатная температура 2 суток 146,43 7,32

Тестовый пример 1: Тестирование уровня in vivo фактора роста нервов на модели на здоровых мышах

Оценивали способность неочищенного экстракта с 50% этанолом в примере 1 индуцировать секрецию фактора роста нервов in vivo (O. Arrieta and J. Sotelo et al., Retinoic acid increases tissue and plasma contents of nerve growth factor and prevents neuropathy in diabetic mice. European Journal of Clinical Investigation (2005) 35).

Самцов мышей ICR каждый массой 25~30 г акклиматизировали в течение 1 недели при 22-24ºC при относительной влажности 60-80% при содержании на воде и стандартном корме. Их разделяли на группы в зависимости от массы. Получаемые в обоих примерах экстракты перорально вводили в предопределенных количествах мышам с использованием габапентина в качестве положительного контроля при дозе 100 мг/кг, через 16 часов у мышей отбирали образцы крови. Затем их умерщвляли для выделения седалищного нерва и слюнных желез.

Затем образцы крови центрифугировали при 10000 об./мин. в течение 10 минут, уровни фактора роста нервов в таким образом выделенной плазме измеряли ELISA (ABS 450 нм). Седалищный нерв и слюнные железы взвешивали и добавляли раствор, содержащий 100 мМ Tris-HCl, 1M NaCl, 2% BSA, 4 мМ ЭДТА, 2,0% Trtion®X-100, 0,02% азида натрия, 0,1 мг/мл пепстатина А, 5 мг/мл апротонина, 0,5 мг/мл противоболевого средства, 167 мг/мл бензамидина и 5,2 мг/мл PMSF, в пропорциональных массам количествах с последующей гомогенизацией. Гомогенаты инкубировали в течение 15 минут с 1н. HCl в количестве 1 мкл/50 мкл для окисления и нейтрализовали 1н. NaOH в количестве 1 мкл/50 мкл. Для получения супернатантов проводили центрифугирование при 10000 об./мин. в течение 10 минут. Как и в плазме, в седалищном нерве и слюнных железах количественно анализировали уровни фактора роста нервов.

Данные приведены в таблице 4 для уровней NGF в плазме, в таблице 5 для уровней NGF в седалищном нерве и в таблице 6 для уровней NGF в слюнной железе.

Таблица 4
Уровень NGF в плазме
Группа Количество вещества (кг) Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica Доза (мг/кг) Уровень NGF в плазме (пг/мл) D. Rhizoma D. nipponica Контроль 601,5 Пример 1 1,55 0,45 3,5:1 100 1106,9 Сравнит. пример 1 2 - - 100 606,2 Сравнит. пример 2 - 2 - 100 602,1 Сравнит. пример 3 1 1 1:1 100 663,6 Сравнит. пример 4 1,33 0,67 1:2 100 689,9 Сравнит. пример 5 1,67 0,33 5:1 100 725,6 Сравнит. пример 6 1,82 0,18 10:1 100 696,8 Сравнит. пример 7 0,67 1,33 1:2 100 607,0 Сравнит. пример 8 0,45 1,55 1:3,5 100 656,0 Сравнит. пример 9 0,33 1,67 1:5 100 642,6 Сравнит. пример 10 0,18 1,82 1:10 100 640,7 Габапентин 100 610,4

При введении в аналогичной дозе, как можно видеть в таблице 4, наблюдали, что экстракт Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстракт Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 и экстракты из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10 индуцировали секрецию фактора роста нервов в плазме в той же степени, что и контроль. В противоположность этому, экстракт примера 1 увеличивал уровень NGF в плазме в большей степени по сравнению с уровнем, получаемым при введении экстракта Dioscorea Rhizoma, экстракта Dioscorea nipponica или экстрактов из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях.

Увеличение уровня фактора роста нервов в плазме, путь по которому фактор роста нервов двигается к мишеням, свидетельствует об индукции секреции фактора роста нервов. Таким образом, экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением дополнительно индуцирует секрецию фактора роста нервов, значительно повышая уровень NGF in vivo по сравнению с экстрактами из одной Dioscorea Rhizoma, одной Dioscorea nipponica или из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях.

Таблица 5
Уровень NGF в седалищном нерве
Группа Количество вещества (кг) Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica Доза (мг/кг) Уровень NGF в седалищном нерве (пг/мг) D. Rhizoma D. nipponica Контроль 3,3 Пример 1 1,55 0,45 3,5:1 100 7,5 Сравнит. пример 1 2 - - 100 3,8 Сравнит. пример 2 - 2 - 100 3,6 Сравнит. пример 3 1 1 1:1 100 4,6 Сравнит. пример 4 1,33 0,67 1:2 100 4,1 Сравнит. пример 5 1,67 0,33 5:1 100 4,0 Сравнит. пример 6 1,82 0,18 10:1 100 3,2 Сравнит. пример 7 0,67 1,33 1:2 100 5,1 Сравнит. пример 8 0,45 1,55 1:3,5 100 4,6 Сравнит. пример 9 0,33 1,67 1:5 100 4,0 Сравнит. пример 10 0,18 1,82 1:10 100 4,9 α-липоевая кислота 50 5,0 Габапентин 100 4,2

Наблюдения показали, что при введении в аналогичной дозе, как можно видеть в таблице 5, экстракт Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстракт Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 и экстракты из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10 вызывали секрецию фактора роста нервов в седалищном нерве в той же степени, что и контроль. В противоположность этому, экстракт примера 1 увеличивал уровень NGF в седалищном нерве в большей степени по сравнению с уровнем, получаемым при введении экстракта Dioscorea Rhizoma, экстракта Dioscorea nipponica или экстрактов из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях.

Таким образом, экстракт из смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 в соответствии с настоящим изобретением может индуцировать секрецию NGF в кровь, что приводит к значительному увеличению уровня NGF в седалищном нерве, ткани-мишени.

Таблица 6
Уровень NGF в слюнной железе
Группа Количество вещества (кг) Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica Доза (мг/кг) Уровень NGF в слюнной железе (нг/мг) D. Rhizoma D. nipponica Контроль 166,1 Пример 1 1,55 0,45 3,5:1 100 221,7 Сравнит. пример 1 2 - - 100 171,6 Сравнит. пример 2 - 2 - 100 170,1 Сравнит. пример 3 1 1 1:1 100 206,2 Сравнит. пример 4 1,33 0,67 2:1 100 193,3 Сравнит. пример 5 1,67 0,33 5:1 100 177,4 Сравнит. пример 6 1,82 0,18 10:1 100 202,5 Сравнит. пример 7 0,67 1,33 1:2 100 173,4 Сравнит. пример 8 0,45 1,55 1:3,5 100 200,2 Сравнит. пример 9 0,33 1,67 1:5 100 181,2 Сравнит. пример 10 0,18 1,82 1:10 100 188,1 α-липоевая кислота 50 164,4 Габапентин 100 193,1

Как видно из данных таблицы 6, при введении в аналогичной дозе экстракт Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1 и экстракт Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 увеличивали уровень NGF в слюнных железах только на 2-3% по сравнению с контролем, тогда как экстракты из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10 индуцировали секрецию NGF в слюнных железах в той же степени или менее по сравнению с секрецией, получаемой при положительном контроле габапентином. В противоположность этому, экстракт примера 1 повышал уровень NGF в слюнных железах на 33,5%. Таким образом, экстракт по настоящему изобретению обеспечивал значительное увеличение уровня NGF в слюнной железе по сравнению с экстрактами из одной Dioscorea Rhizoma, одной Dioscorea nipponica или смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях. Увеличение уровня NGF в слюнной железе, которая функционирует как источник NGF, означает индукцию синтеза NGF.

Таким образом, экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) может значительно повышать уровень NGF in vivo.

Таким образом, вследствие своей способности значительно повышать уровень NGF in vivo экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) в соответствии с настоящим изобретением можно применять для фармацевтической композиции или функционального оздоровительного пищевого продукта для предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии.

Тестовый пример 2: Тестирование эффектов в отношении боли, секреции NGF и нейродегенерации на самцах крыс SD с индуцированным стрептозотоцином диабетом 1 типа

Экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1, получаемый в примере 1, и экстракты сравнительных примеров 1-10 оценивали в отношении эффекта боли, уровня NGF in vivo и нейродегенерации у самцов крыс SD с диабетом 1 типа.

Самцов крыс SD, каждый массой 220~250 г акклиматизировали в течение одной недели при 22-24ºC при относительной влажности 60-80% при содержании на стандартной корме и воде. В дальнейшем крысам однократно вводили внутривенно раствор стрептозотоцина в физиологическом растворе в дозе 50 мг/кг для индукции диабета 1 типа. Через четыре недели после индукции диабета крыс разделяли на группы в зависимости от уровня сахара в крови. Экстракты, получаемые в указанных выше примерах, вводили перорально крысам один раз в сутки в течение 8 недель в предопределенных дозах, при этом α-липоевую кислоту и габапентин использовали в качестве положительных контролей в дозах 50 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно. Затем их умерщвляли для получения седалищного нерва и слюнных желез. Седалищный нерв и слюнные железы обрабатывали таким же образом, как в тестовом примере 1 и определяли уровень NGF ELISA. Результаты приведены в таблице 7 ниже.

Исследовали способность экстрактов облегчать боль, вызываемую диабетической нейропатией. В связи с этим крыс с индуцированным стрептозотоцином диабетом разделяли и вводили перорально экстракты в предопределенных дозах один раз в сутки в течение 14 недель, где α-липоевая кислота 50 мг/кг и габапентин 100 мг/кг служили в качестве положительных контролей. Проводили тест Рэндалла-Селитто для определения порога чувствительности давления на лапу. Латентный период времени, затрачиваемый на ответ на термическую боль, измеряли с использованием теста отдергивания хвоста. Результаты приведены в таблице 8. Для оценки нейродегенерации, которая прогрессирует с началом диабетической нейропатии, седалищный нерв, получаемый у крыс из каждой группы, фиксировали формалином и наблюдали под электронным микроскопом для определения размера и толщины миелиновой оболочки, и результаты приведены в таблице 9.

Таблица 7
Уровень NGF в седалищном нерве на модели диабета 2 типа на крысах (самец крысы SD)
Группа Количество вещества (кг) Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica Доза (мг/кг) Уровень NGF D. Rhizoma D. nipponica Седалищный нерв (пг/мг) Слюнная железа (нг/мг) Нормальные 25,5 4,1 Контроль 11,9 2,1 Пример 1 1,55 0,45 3,5:1 100 35,4 3,8 Сравнит. пример 1 2 - - 100 13,1 2,0 Сравнит. пример 2 - 2 - 100 12,7 1,7 Сравнит. пример 3 1 1 1:1 100 19,2 1,9 Сравнит. пример 4 1,33 0,67 2:1 100 27,9 2,4 Сравнит. пример 5 1,67 0,33 5:1 100 25,1 2,9 Сравнит. пример 6 1,82 0,18 10:1 100 24,6 2,8 Сравнит. пример 7 0,67 1,33 1:2 100 19,1 3,3 Сравнит. пример 8 0,45 1,55 1:3,5 100 19,8 2,9 Сравнит. пример 9 0,33 1,67 1:5 100 20,9 2,9 Сравнит. пример 10 0,18 1,82 1:10 100 16,4 2,5 α-липоевая кислота 50 13,8 2,8 Габапентин 100 14,9 2,4

При введении в аналогичной дозе, как можно видеть в таблице 7, экстракт примера 1 значительно увеличивал уровень NGF в седалищном нерве и слюнной железе по сравнению с экстрактом Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстрактом Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 или экстрактами из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10.

Таким образом, было доказано, что экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 индуцирует значительное увеличение NGF в тканях-мишенях (седалищный нерв, слюнная железа) даже у животных с диабетом 1 типа.

Таблица 8
Анализ болевого ответа на модели диабета 1 типа на крысах (самец крысы SD)
Количество вещества (кг) Массовое отношение D. Rhizoma:D. nipponica Доза (мг/кг) Болевой порог давления (г) Латентное время болевой реакции (сек) D. Rhizoma D. nipponica Нормальные 270,0 9,9 Контроль 128,8 5,4 Пример 1 1,55 0,45 3,5:1 100 191,7 11,4 Сравнит. пример 1 2 - - 100 130,1 6,3 Сравнит. пример 2 - 2 - 100 129,8 6,7 Сравнит. пример 3 1 1 1:1 100 169,0 8,0 Сравнит. пример 4 1,33 0,67 2:1 100 163,7 7,8 Сравнит. пример 5 1,67 0,33 5:1 100 138,0 7,4 Сравнит. пример 6 1,82 0,18 10:1 100 150,0 7,2 Сравнит. пример 7 0,67 1,33 1:2 100 153,5 7,9 Сравнит. пример 8 0,45 1,55 1:3,5 100 157,0 7,6 Сравнит. пример 9 0,33 1,67 1:5 100 157,6 7,1 Сравнит. пример 10 0,18 1,82 1:10 100 129,2 7,5 α-липоевая кислота 50 150,0 7,4 Габапентин 100 137,7 7,7

Как можно видеть в таблице 8, при введении в аналогичной дозе экстракт примера 1 значительно увеличивает болевой порог давления и латентный период времени ответа на давление по сравнению с экстрактом Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстрактом Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 или экстрактами из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10.

Увеличение порога механических стимулов определяет увеличение порога к боли. В тесте отдергивания хвоста увеличение латентного периода времени на болезненный ответ соответствует увеличению порога к термическим стимулам, свидетельствующему об уменьшении боли.

Таким образом, для экстракта трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 в соответствии с настоящим изобретением продемонстрировали значительный эффект уменьшения боли, симптома диабетической периферической нейропатии.

Таблица 9
Анализ нейродегенерации на модели диабета 1 типа на крысах (самец крысы SD)
Доза (мг/кг) Нейродегенерация Размер миелиновой оболочки (мкм) Толщина миелиновой оболочки (мкм) Нормальные 15,3 3,2 Контроль 9,3 2,5 Пример1 30 13,6 3,2 100 13,8 2,9 α-липоевая кислота 50 11,2 2,6 Габапентин 100 10,4 2,2

Как видно из данных таблицы 9, размер и толщина миелиновой оболочки контроля становились меньше, свидетельствуя о повреждениях или дегенерации седалищного нерва вследствие диабетической нейропатии. При введении экстракта примера 1 наблюдали, что размер и толщина миелиновой оболочки крыс становились больше.

Таким образом, экстракт по настоящему изобретению может улучшать состояние нейродегенерации, обеспечивая увеличение нервной регенерации в органах-мишенях даже в гистологическом аспекте.

Таким образом, экстракт трав в соответствии с настоящим изобретением можно применять для фармацевтической композиции, которая может приводить к значительному синергическому действию в отношении предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии у индивидуумов с диабетом 1 типа.

Тестовый пример 3: Тестирование эффектов в отношении боли, секреции NGF и нейродегенерации у самцов мышей ICR с индуцированным стрептозотоцином диабетом 1 типа

Экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1, получаемый в примере 1, оценивали на эффекты в отношении боли, уровня NGF in vivo и нейродегенерации у самцов мышей ICR с диабетом 1 типа.

Самцов мышей ICR, каждый массой 25~30 г, акклиматизировали в течение одной недели при 22-24ºC при относительной влажности 60-80% при содержании на стандартном рационе и воде. В дальнейшем мышам с индуцированным диабетом 1 типа однократно вводили внутривенно раствор стрептозотоцина в физиологическом растворе в дозе 200 мг/кг. Через четыре недели после индукции диабета крыс разделяли на группы в зависимости от уровня сахара в крови. Экстракты, получаемые в указанных выше примерах, вводили перорально один раз в сутки в течение 14 недель в предопределенных дозах мышам, при этом α-липоевую кислоту и габапентин использовали в качестве положительных контролей в дозе 50 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно. Мышей в каждой группе помещали на горячую плиту 58ºC и исследовали в отношении гипералгезии к тепловому воздействию, измеряя латентный период времени, который требовался мышам для ощущения вызываемой теплом боли в их подошвах и подпрыгивания. Результаты приведены в таблице 10.

Затем мышей умерщвляли для получения их седалищного нерва и слюнных желез. Седалищный нерв и слюнные железы обрабатывали таким же образом, как в тестовом примере 1, и определяли уровень NGF ELISA. Результаты приведены в таблице 11 ниже.

Для оценки нейродегенерации, которая прогрессировала с началом диабетической нейропатии, получаемый у мышей из каждой группы седалищный нерв фиксировали формалином и наблюдали под электронным микроскопом для измерения размера и толщины миелиновой оболочки, и результаты приведены в таблице 12.

Таблица 10
Анализ болевого ответа на модели диабета 1 типа на мышах
(самец мыши ICR)
Группа Доза (мг/кг) Латентный период времени к болевому ответу на горячей плите 58ºC (сек) Нормальные 55,3 Контроль 25,2 Пример 1 100 45,9 Сравнит. пример 1 100 26,6 Сравнит. пример 2 100 25,7 Сравнит. пример 3 100 35,6 Сравнит. пример 4 100 25,3 Сравнит. пример 5 100 26,0 Сравнит. пример 6 100 35,0 Сравнит. пример 7 100 32,2 Сравнит. пример 8 100 33,0 Сравнит. пример 9 100 26,8 Сравнит. пример 10 100 36,1 α-липоевая кислота 50 31,1 Габапентин 100 33,0

Увеличение латентного периода времени к болевому ответу на горячей плите отражает увеличение болевого порога к термическому воздействию, свидетельствующему об уменьшение боли. Как можно видеть в таблице 10, экстракт примера 1 значительно увеличивал латентный период времени к болевом ответу на горячей плите по сравнению с экстрактом Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстрактом Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 или экстрактами из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10, демонстрируя, что композиция трав по настоящему изобретению обладает значительным эффектом в отношении уменьшения боли, симптома диабетической периферической нейропатии.

Таблица 11
Уровни NGF в седалищном нерве и слюнной железе на модели диабета 1 типа на мышах (самец мыши ICR)
Группа Доза (мг/кг) Уровни NGF Седалищный нерв (пг/мг) Слюнная железа (нг/мг) Нормальные 9,7 226,1 Контроль 3,9 101,8 Пример 1 100 9,2 169,6 Сравнит. пример 1 100 4,1 107,2 Сравнит. пример 2 100 3,9 104,3 Сравнит. пример 3 100 6,2 118,7 Сравнит. пример 4 100 4,8 115,8 Сравнит. пример 5 100 4,0 121,0 Сравнит. пример 6 100 3,6 114,3 Сравнит. пример 7 100 6,2 122,7 Сравнит. пример 8 100 4,8 104,7 Сравнит. пример 9 100 4,1 104,7 Сравнит. пример 10 100 3,5 120,4 α-липоевая кислота 50 5,7 118,7 Габапентин 100 5,5 117,1

Как можно видеть в таблице 11, экстракт примера 1 значительно увеличивал уровень NGF в седалищном нерве и слюнной железе по сравнению с экстрактом Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстрактом Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 или экстрактами из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10.

Таким образом, доказано, что экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 индуцирует значительное увеличение NGF в органах-мишенях (седалищном нерве, слюнной железе) у самцов мышей ICR с диабетом 1 типа, а также у самцов крыс SD с диабетом 1 типа.

Таблица 12
Анализ нейродегенерации на модели диабета 1 типа на мышах (самец мыши ICR)
Группа Доза (мг/кг) Нейродегенерация Размер миелиновой оболочки (мкм) Толщина миелиновой оболочки (мкм) Нормальные 14,3 3,4 Контроль 9,1 2,0 Пример 1 30 13,7 2,9 100 12,9 2,6

Как видно из данных таблицы 12, миелиновая оболочка контроля являлась уменьшенной в отношении размера и толщины, указывая на повреждение или дегенерацию седалищного нерва вследствие диабетической нейропатии. При введении экстракта примера 1 наблюдали, что мыши обладают миелиновую оболочку, которая являлась увеличенной в отношении размера и толщины.

Таким образом, экстракт по настоящему изобретению может улучшать состояние нейродегенерации у мышей ICR с диабетом 1 типа, а также крыс SD с диабетом 1 типа, увеличивая нервную регенерацию в органах-мишенях даже в гистологическом аспекте.

Таким образом, экстракт трав в соответствии с настоящим изобретением можно применять в фармацевтической композиции, которая может приводить к значительному синергическому действию в отношении предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии у индивидуумов с диабетом 1 типа.

Тестовый пример 4: Тестирование эффектов в отношении боли и секреции NGF у самцов мышей с генетически индуцированным диабетом 2 типа (самец мыши db/db)

Экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1, получаемый в примере 1, оценивали по эффектам в отношении боли и уровня NGF in vivo у самцов мышей db/db с диабетом 2 типа.

Самцов мышей db/db, каждый массой 40~45 г, акклиматизировали в течение одной недели при 22-24ºC при относительной влажности 60-80% при содержании на стандартном рационе и воде. На первые сутки 9-й недели после рождения отбирали мышей, у которых индуцировали диабет. Через четыре недели страдающих диабетом 2 типа мышей разделяли в зависимости от уровня сахара в крови. Получаемые в указанных выше примерах экстракты перорально вводили мышам один раз в сутки в течение 12 недель в предопределенных дозах, при этом α-липоевую кислоту и габапентин использовали в качестве положительных контролей в дозе 50 мг/кг и 100 мг/кг, соответственно. Мышей в каждой группе помещали на горячую плиту 58ºC и исследовали в отношении гипералгезии к термическому воздействию, измеряя латентный период времени, который требовался мышам для ощущения вызываемой теплом боли в их подошвах и подпрыгивания. Результаты приведены в таблице 13.

Затем мышей умерщвляли для получения их седалищного нерва. Седалищный нерв обрабатывали таким же образом, как в тестовом примере 1 и измеряли уровень NGF ELISA. Результаты приведены в таблице 14 ниже.

Таблица 13
Анализ болевого ответа на модели диабета 2 типа на мышах
(самец мыши db/db)
Группа Доза (мг/кг) Латентный период времени к болевому ответу на горячей плите 58ºC (сек) Контроль 12,7 Пример 1 100 28,0 Сравнит. пример 1 100 15,1 Сравнит. пример 2 100 14,9 Сравнит. пример 3 100 21,3 Сравнит. пример 4 100 21,0 Сравнит. пример 5 100 20,5 Сравнит. пример 6 100 19,3 Сравнит. пример 7 100 22,3 Сравнит. пример 8 100 17,6 Сравнит. пример 9 100 17,6 Сравнит. пример 10 100 16,8 α-липоевая кислота 50 15,4 Габапентин 100 16,1

Как можно видеть в таблице 13, экстракт примера 1 значительно увеличивал латентный период времени к болевому ответу на горячей плите по сравнению с экстрактом Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстрактом Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 или экстрактами из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10, демонстрируя, что композиция трав по настоящему изобретению обладает значительным эффектом в отношении уменьшения боли, симптома диабетической периферической нейропатии.

Таблица 14
Уровень NGF в седалищном нерве на модели диабета 2 типа на мышах (самец мыши db/db)
Группа Доза (мг/кг) Уровень NGF в седалищном нерве (пг/мг) Контроль 6,2 Пример 1 100 11,6 Сравнит. пример 1 100 6,5 Сравнит. пример 2 100 6,3 Сравнит. пример 3 100 8,4 Сравнит. пример 4 100 8,3 Сравнит. пример 5 100 7,8 Сравнит. пример 6 100 6,9 Сравнит. пример 7 100 8,1 Сравнит. пример 8 100 7,0 Сравнит. пример 9 100 7,1 Сравнит. пример 10 100 7,3 α-липоевая кислота 50 7,6 Габапентин 100 7,2

Как можно видеть в таблице 14, экстракт примера 1 значительно увеличивал уровень NGF в седалищном нерве по сравнению с экстрактом Dioscorea Rhizoma сравнительного примера 1, экстрактом Dioscorea nipponica сравнительного примера 2 или экстрактами из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica сравнительных примеров 3-10.

Таким образом, доказано, что экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 индуцирует значительное увеличение NGF в органе-мишени даже в условиях диабета 2 типа.

Обладающий способностью значительной увеличивать уровни NGF in vivo, экстракт трав в соответствии с настоящим изобретением можно применять в фармацевтической композиции, которая может приводить к значительному синергическому действию в отношении предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии у индивидуумов с диабетом 1 типа или 2 типа.

Тестовый пример 5: Тестирование активности индукции синтеза NGF и роста нервных клеток с использованием клеток C6 глиомы крысы и нервных клеток PC12

Получаемый в примере 1 экстракт смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 (мас./мас.) исследовали на способность индуцировать синтез NGF в клетках C6 глиомы крысы и рост нервных клеток PC12 крысы.

Для оценки способности экстракта индуцировать синтез NGF, клетки C6 глиомы высевали в одинаковой плотности на лунку в планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Клетки отмывали PBS и культивировали в течение 48 часов в свежих средах для культивирования с добавлением 50 мкг/мл или 250 мкг/мл экстрактов трав примера 1 или сравнительных примеров 1-10. Затем среды для культивирования собирали и количественно анализировали в них уровни NGF с использованием ELISA. Результаты приведены в таблице 15.

Для применения в тестировании способности индуцировать рост нервных клеток нервные клетки PC12 высевали в одинаковой плотности на лунку в планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Клетки отмывали PBS и культивировали в течение 48 часов в средах для культивирования с добавлением экстрактов трав примера 1 или сравнительных примеров 1-10 или NGF. Рост клеток определяли с использованием анализа MTS, и результаты приведены в таблице 16.

Таблица 15
Промоторный эффект в отношении синтеза NGF
Группа Доза (мг/мл) Уровень NGF (% от контроля) Контроль 100 Пример 1 50 113 250 149 Сравнит. пример 1 50 - 250 107 Сравнит. пример 2 50 - 250 103 Сравнит. пример 3 50 108 250 110 Сравнит. пример 4 50 102 250 105 Сравнит. пример 5 50 101 250 110 Сравнит. пример 6 50 105 250 111 Сравнит. пример 7 50 102 250 122 Сравнит. пример 8 50 107 250 128 Сравнит. пример 9 50 104 250 119 Сравнит. пример 10 50 101 250 123

Как можно видеть в таблице 15, экстракт примера 1 значительно увеличивал уровень NGF в клетках C6 по сравнению с экстрактом сравнительного примера 1 (из одной Dioscorea Rhizoma), экстрактом сравнительного примера 2 (из одной Dioscorea nipponica) или экстрактами сравнительных примеров 3-10 (из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях).

Таким образом, доказано, что экстракт смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 максимально индуцирует синтез NGF.

Таблица 16
Пролиферативный эффект на нервные клетки
Группа Доза (мг/мл) Пролиферативный эффект на нервную клетку (% от контроля) Контроль 100 NGF 2 (нг/мл) 112 50 (нг/мл) 118 Пример 1 1 111 30 117 Сравнит. пример 1 1 - 30 101 Сравнит. пример 2 1 - 30 100 Сравнит. пример 3 1 101 30 105 Сравнит. пример 4 1 98 30 103 Сравнит. пример 5 1 100 30 101 Сравнит. пример 6 1 99 30 102 Сравнит. пример 7 50 104 250 106 Сравнит. пример 8 50 100 250 103 Сравнит. пример 9 50 99 250 101 Сравнит. пример 10 50 104 250 102

Как можно видеть в таблице 16, экстракт примера 1 в значительной степени активирует рост нервных клеток PC12 по сравнению с экстрактом сравнительного примера 1 (из одной Dioscorea Rhizoma), экстрактом сравнительного примера 2 (из одной Dioscorea nipponica) или экстрактами сравнительных примеров 3-10 (из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях).

Таким образом, доказано, что экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 в соответствии с настоящим изобретением обладает значительным пролиферативным эффектом на нервные клетки.

Тестовый пример 6: Тестирование фосфорилирования рецептора NGF в нервных клетках PC12

Получаемый в примере 1 экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 оценивали в отношении его способности активировать фосфорилирование рецепторов NGF в нервных клетках PC12 крысы.

Для применения в этом тесте нервные клетки PC12 высевали в одинаковой плотности на лунку в планшеты и инкубировали в течение 24 часов. Клетки отмывали PBS и культивировали в течение 48 часов в средах для культивирования с добавлением экстрактов трав примера 1 или сравнительных примеров 1-10 или NGF. В дальнейшем фосфорилированную TrkA (рецептор NGF) детектировали с использованием Вестерн-блоттинга и количественно анализировали на основании толщины детектируемых полос. Результаты приведены в таблице 17.

Сигнальный каскад NGF начинается со связывания NGF с его рецептором (Trk-A), что приводит к фосфорилированию рецептора. Таким образом, повышенный уровень фосфорилированных рецепторов NGF означает амплификацию сигнала пути передачи сигнала NGF.

Как видно из данных таблицы 17 ниже, экстракт примера 1 индуцировал значительное увеличение фосфорилирования рецепторов NGF по сравнению с экстрактом сравнительного примера 1 (из одной Dioscorea Rhizoma), экстрактом сравнительного примера 2 (из одной Dioscorea nipponica) или экстрактами сравнительных примеров 3-10 (из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях).

Таблица 17
Промоторный эффект в отношении фосфорилирования рецептора NGF
Группа Доза Относительное количество фосфорилированного NGF (% от контроля) NGF (нг/мл) Объединенный экстракт (мкг/мл) Контроль 100 NGF 2 - 241 50 - 337 Пример 1+NGF 2 200 309 500 389 Сравнит. пример 1+NGF 2 200 - 500 232 Сравнит. пример 2+NGF 2 200 - 500 229 Сравнит. пример 3+NGF 2 200 268 500 299 Сравнит. пример 4+NGF 2 200 255 500 287 Сравнит. пример 5+NGF 2 200 254 500 274 Сравнит. пример 6+NGF 2 200 248 500 277 Сравнит. пример 7+NGF 2 200 251 500 268 Сравнит. пример 8+NGF 2 200 239 500 287 Сравнит. пример 9+NGF 2 200 249 500 296 Сравнит. пример 10+NGF 2 200 244 500 280

Тестовый пример 7: Тестирование активности индукции роста невритов на выделяемых у крысы нервных клетках DRG

Получаемый в примере 1 экстракт трав смеси Dioscorea Rhizoma:Dioscorea nipponica 3,5:1 оценивали в отношении активности индукции роста невритов в нервных клетках DRG (ганглия заднего корешка), получаемых у эмбрионов крыс.

Для применения в этом тесте нервные клетки DRG высевали в одинаковой плотности в планшеты и инкубировали в течение 24 часов. В дальнейшем клетки отмывали PBS и культивировали в течение 48 часов в среде для культивирования при отсутствии или в присутствии комбинации экстракта примера 1 или сравнительных примеров 1-10 и NGF. Нервные клетки в каждой группе наблюдали под микроскопом для измерения площади роста невритов в них. Средние значения измерений приведены в таблице 18.

Увеличение площади невритов свидетельствует о том, что нервные клетки являются активированными в отношении роста невритов. Как можно видеть в таблице 18 ниже, экстракт примера 1 значительно увеличивает площадь невритов по сравнению с экстрактом сравнительного примера 1 (из одной Dioscorea Rhizoma), экстрактом сравнительного примера 2 (из одной Dioscorea nipponica) или экстрактами сравнительных примеров 3-10 (из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях).

Таблица 18
Промоторный эффект в отношении образования невритов из нервной клетки DRG
Группа Доза Площадь неврита нервной клетки DRG (мкм2) NGF (нг/мл) Объединенный экстракт (мкг/мл) Контроль 149 NGF 2 - 235 50 - 461 Пример 1+NGF 2 30 291 100 502 Сравнит. пример 1+NGF 2 30 - 100 234 Сравнит. пример 2+NGF 2 30 - 100 236 Сравнит. пример 3+NGF 2 30 264 100 288 Сравнит. пример 4+NGF 2 30 259 100 271 Сравнит. пример 5+NGF 2 30 241 100 294 Сравнит. пример 6+NGF 2 30 232 100 301 Сравнит. пример 7+NGF 2 30 269 100 288 Сравнит. пример 8+NGF 2 30 257 100 279 Сравнит. пример 9+NGF 2 30 241 100 266 Сравнит. пример 10+NGF 2 30 239 100 248

В своей совокупности данные, полученные в тестовых примерах 1-7, демонстрируют, что экстракт примера 1 может значительно индуцировать повышение уровней NGF in vivo, рост нервных клеток и невритов, уменьшение боли, симптома диабетической нейропатии, и предотвращение гистологической нейродегенерации (активации регенерации нервов) по сравнению с экстрактом сравнительного примера 1 (из одной Dioscorea Rhizoma), экстрактом сравнительного примера 2 (из одной Dioscorea nipponica) или экстрактами сравнительных примеров 3-10 (из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica в других массовых отношениях), и, таким образом, его можно применять в фармацевтических композициях и диетических пищевых добавках для предотвращения и лечения диабетической периферической нейропатии.

Ниже приведено описание иллюстративных неограничивающих примеров составов, содержащих экстракт трав из смеси Dioscorea Rhizoma и Dioscorea nipponica.

Пример состава 1. Получение инъекционного раствора.

Экстракт примера 1 100 мг Метабисульфит натрия 3 мг Метилпарабен 0,8 мг Пропилпарабен 0,1 мг Стерильная вода для инъекций в достаточном количестве

К смеси ингредиентов добавляли стерильную воду с получением общего объема 2 мл и помещали раствор в 2 мл ампулу и стерилизовали с получением инъекционного раствора.

Пример состава 2. Получение таблетки.

Экстракт примера 1 200 мг Лактоза 100 мг Крахмал 100 мг Стеарат Mg в достаточном количестве

Ингредиенты смешивали и прессовали в таблетку способом таблетирования.

Пример состава 3. Получение капсулы.

Экстракт примера 1 100 мг Лактоза 50 мг Крахмал 50 мг Тальк 2 мг Стеарат Mg в достаточном количестве

Ингредиенты смешивали и помещали в желатиновую капсулу общепринятым способом получения капсулы.

Пример состава 4. Получение жидкого состава.

Экстракт примера 1 1000 мг Сахар 20 г Изомероза 20 г Лимонная вкусоароматическая добавка в достаточном количестве Очищенная вода добавляют до общего объема 100 мл

Указанные выше ингредиенты смешивали, помещали в 100 мл коричневый флакон и стерилизовали с получением жидкого состава.

Несмотря на то, что предпочтительные варианты осуществления настоящего изобретения описаны с иллюстративными целями, специалистам в данной области будет понятно, что возможны различные модификации, добавления и замещения, не выходящие за рамки объема и сущности изобретения, как описано в прилагаемой формуле изобретения.

Похожие патенты RU2566721C2

название год авторы номер документа
КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКСТРАКТ РАСТЕНИЙ, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ 2011
  • Ким Соон-Хое
  • Сон Ми-Вон
  • Чой Санг-Зин
  • Ким Хие-Дзу
  • Риу Дза-Йоунг
  • Ким Сун-Йоу
RU2575832C2
ЭКСТРАКТ СЕМЕЙСТВА ДИОСКОРЕЙНЫХ (DIOSCOREACEAE) И СОДЕРЖАЩАЯ ЕГО КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕВРОПАТИИ 2006
  • Ким Сон-Ю
  • Кан Тон-Хо
  • Пак Чи-Хо
RU2430737C2
КОМПОЗИЦИЯ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕВРОПАТИИ 2006
  • Ким Сон-Ю
  • Кан Тон-Хо
  • Пак Чи-Хо
RU2453327C1
СОДЕРЖАЩИЙ G-CSF АГЕНТ ДЛЯ ПРЕДУПРЕЖДЕНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ 2007
  • Ким Кьянг-Соо
  • Гин Ги-Йонг
RU2448726C2
СОСТАВ, СОДЕРЖАЩИЙ СМЕШАННЫЙ ЭКСТРАКТ ШЕЛКОВИЦЫ И КОЖИЦЫ PORIA COCOS, ПРЕДНАЗНАЧЕННЫЙ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ, ОБЛЕГЧЕНИЯ СОСТОЯНИЯ И ЛЕЧЕНИЯ НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ РАССТРОЙСТВ 2015
  • Чхве Сан Зин
  • Сон Ми Вон
  • Ко Хё Сан
  • Рю Ча
  • Чжон Чжин Сок
  • Чхве Сон Хён
  • Ким Ын Чжин
  • Чо Ун
  • Ким Со
RU2679654C2
ПРИМЕНЕНИЕ ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА ДЛЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНОГО ВОССТАНОВЛЕНИЯ ПЕРИФЕРИЧЕСКИХ НЕРВОВ ПРИ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ НЕВРОПАТИИ 2007
  • Фернандес Монтекин Хосе Игнасио
  • Эррера Мартинес Луис Сатурнино
  • Берланга Акоста Хорхе Амадор
  • Гарсия Дель Барко Эррера Диана
  • Сибриан Вера Данай
  • Гильен Ньето Херардо Энрике
  • Убьета Гомес Раймундо
  • Гонсалес Бланко Сонья
  • Саес Мартинес Вивиан Мария
RU2460536C2
НЕЙРОТРОПНЫЕ АНАЛОГИ ТАКРОЛИМУСА 2001
  • Мацуока Нобуя
  • Ямадзи Такаюки
  • Голд Брюс
RU2288716C2
ТЕРАПИЯ ДЛЯ СТИМУЛЯЦИИ РОСТА КЛЕТОК 2010
  • Лаздунски Мишель Морис Жак
  • Эрто Катрин Луис Клод
  • Пикар Давид
RU2586302C2
Комбинации пальмитоилэтаноламида для лечения хронической боли 2018
  • Сыров Кирилл Константинович
  • Нестерук Владимир Викторович
RU2701720C1
ТЕРАПЕВТИЧЕСКИЕ И ДИЕТИЧЕСКИЕ КОМПОЗИЦИИ, СОДЕРЖАЩИЕ НЕОБХОДИМЫЕ ЖИРНЫЕ КИСЛОТЫ И БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЕ ДИСУЛЬФИДЫ 1998
  • Хорробин Дэвид Фредерик
  • Тричлер Ханс-Юрген
RU2205004C2

Иллюстрации к изобретению RU 2 566 721 C2

Реферат патента 2015 года КОМПОЗИЦИЯ, СОДЕРЖАЩАЯ ЭКСТРАКТ ТРАВЯНОЙ КОМБИНАЦИИ, ДЛЯ ПРЕДОТВРАЩЕНИЯ ИЛИ ЛЕЧЕНИЯ ДИАБЕТИЧЕСКОЙ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ НЕЙРОПАТИИ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности, в частности к фармацевтической композиции для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии, содержащая в качестве активного ингредиента смешанные экстракты корневища Dioscorea batatas Decaisne, Dioscorea japonica Thunberg, или Dioscorea opposita Thunberg, и корневища Dioscorea nipponica в массовом отношении 3,5:1 мас./мас. и фармацевтически приемлемый носитель. Функциональный оздоровительный пищевой продукт для предотвращения или улучшения состояния диабетической периферической нейропатии. Вышеописанные композиция и пищевой продукт эффективны для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии. 2 н. и 5 з.п. ф-лы, 2 ил., 18 табл., 7 пр.

Формула изобретения RU 2 566 721 C2

1. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии, содержащая в качестве активного ингредиента смешанные экстракты корневища Dioscorea batatas Decaisne, Dioscorea japonica Thunberg или Dioscorea opposita Thunberg и корневища Dioscorea nipponica в массовом отношении 3,5:1 мас./мас. и фармацевтически приемлемый носитель.

2. Фармацевтическая композиция по п. 1, где диабетическая периферическая нейропатия представляет собой заболевание, развивающееся вследствие по меньшей мере одной причины, выбранной из группы, состоящей из дистрофии, дегенерации и апоптоза нервных клеток.

3. Фармацевтическая композиция по п. 1, где диабетическая периферическая нейропатия проявляет симптом, выбранный из группы, состоящей из дискомфорта с чувством жжения, колющей боли, болезненного ощущения, чувства напряжения, потери тактильной чувствительности, вибрационной чувствительности или температурной чувствительности и их сочетания.

4. Функциональный оздоровительный пищевой продукт для предотвращения или улучшения состояния диабетической периферической нейропатии, содержащий смешанные экстракты корневища Dioscorea batatas Decaisne, Dioscorea japonica Thunberg или Dioscorea opposita Thunberg и корневища Dioscorea nipponica в массовом отношении 3,5:1 мас./мас.

5. Функциональный оздоровительный пищевой продукт по п. 4, где функциональный оздоровительный пищевой продукт получают в форме, выбранной из группы, состоящей из порошка, гранулы, таблетки, капсулы, сиропа и напитка.

6. Фармацевтическая композиция для предотвращения или лечения диабетической периферической нейропатии по п. 1, в которой экстракты получены с помощью этанола в качестве растворителя для экстракции.

7. Функциональный оздоровительный пищевой продукт по п. 4, где экстракты получены с помощью этанола в качестве растворителя для экстракции.

Документы, цитированные в отчете о поиске Патент 2015 года RU2566721C2

KR 20070045988 A, 02.05.2007
СПОСОБ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛИНЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА И ЛЕКАРСТВЕННЫЙ СБОР ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ИНСУЛИНЗАВИСИМОГО САХАРНОГО ДИАБЕТА 2000
  • Захаров Ю.А.
RU2161039C1
KR 100811683 B1, 11.03.2008

RU 2 566 721 C2

Авторы

Ким Соон-Хое

Сон Ми-Вон

Чой Санг-Зин

Ким Хие-Дзу

Риу Дза-Йоунг

Ким Сун-Йоу

Даты

2015-10-27Публикация

2011-12-29Подача