СПОСОБ ДЕТЕКЦИИ ГЕНОВ АНТИБИОТИКОУСТОЙЧИВОСТИ У ШТАММОВ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ МЕТОДОМ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/68 C12Q1/04 

Изобретение относится к области медицинской микробиологии и, в частности, к детекции антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя чумы.

Чума представляет реальную угрозу для населения Российской Федерации, связанную с наличием на ее территории многочисленных природных очагов, в которых циркулируют штаммы Yersinia pestis, кроме того, существует опасная возможность заноса инфекции из соседних стран. Как правило, штаммы чумного микроба чувствительны к действию различных антибиотиков, поэтому ранее изучению антибиотикоустойчивости штаммов не уделялось достаточного внимания. Однако в 1995 г. на о.Мадагаскар был выделен штамм чумного микроба с множественной устойчивостью к таким антибиотикам, как хлорамфеникол, канамицин, ампициллин, стрептомицин, тетрациклин, миноциклин, сульфониламиды, при этом детерминанты устойчивости к антибиотикам были локализованы на конъюгативной плазмиде, которая с высокой частотой могла передаваться между штаммами возбудителя (Smith et al., 1995; Galimand et al., 1997, Hinnebusch et al., 2002). В том же году на той же территории был выделен другой антибиотикоустойчивый штамм Y.pestis с высоким уровнем резистентности к стрептомицину. Установлено, что резистентность была также обусловлена наличием коньюгативной плазмиды (Guiyoule et al., 2001).

Появление в природе устойчивых к антибиотикам штаммов возбудителя чумы и возможность их применения в качестве бактериологического оружия в биотеррористических актах обусловило необходимость проведения мониторинга выделяемых штаммов Y.pestis по их антибиотикоустойчивости и потребовало разработки простых и эффективных методов их идентификации.

Большой эффективностью и быстротой получения результатов отличается метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), предназначенный для детекции различных генов. До настоящего времени данный метод использовали для выявления у возбудителя чумы генов вирулентности или видоспецифических участков ДНК, например caf, pla, lcrV, 3а, irp-2 (Neubauer H. et al., 2000; Rahalison L. et al., 2000; Hongwei Z.J.L, 2000; Балахонов C.B. с соавт. 2000; Гаранина С.Б. с соавт., 2001; Сучков И.Ю. с соавт., 2001; Radnedge L. et al., 2001; Савостина Е.П., 2004; Kuske C.R. et al., 2006; Куклев В.Е. с соавт. 2006).

Известен способ быстрой детекции Y.pestis (DE 10124342 (A1), опубл. 28.11.2002 г.), который предусматривает двухэтапную детекцию ДНК возбудителей чумы и псевдотуберкулеза: методом ПЦР и методом гибридизации со специфическими зондами. Однако этот способ не позволяет проводить выявление антибиотикоустойчивых штаммов Y.pestis.

Известен способ детекции бактерий рода Yersinia и дифференциации патогенных для человека видов иерсиний методом полимеразной цепной реакции (патент RU 2354700, опубл. 10.05.2009 г.), предназначенный для выявления возбудителя чумы и разделения видов на основе использования последовательности участка гена ompF порина. Этот способ позволяет выявлять возбудителя чумы и разделять виды патогенных иерсиний, но он не позволяет проводить детекцию антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя чумы.

В ряде работ установлена перспективность применения метода ПЦР для определения резистентности возбудителей опасных инфекционных болезней к антибактериальным препаратам. G.J.Vora et al. разработали мультилокусную ПЦР и ДНК-чип для определения резистентности к антибактериальным препаратам - триметаприму, хлорамфениколу, стрептомицину, сульфаметаксазолу, канамицину, тетрациклину, цефалоспоринам для четырех видов вибрионов (Vora G.J., Meador C.E., Bird M.M., Ворр С.А., Andreadis J.D., Stenger D.A. Microarray-based detection of genetic heterogeneity, antimicrobial resistance, and the viable but nonculturable state in human pathogenic Vibrio spp.// PNAS. - 2005. - V.102, N.52. - P.19109-19114). Однако созданная этими авторами мультилокусная ПЦР используется для выявления резистентных к лекарственным препаратам штаммов вибрионов и не предусматривает возможности детекции антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя чумы.

Метод ПЦР также используется для выявления интегронов, кодирующих устойчивость к антибиотикам у буркхолдерий (Акимов Р.И., Захарова И.Б., Викторов Д.В., Меринова О.А. Обнаружение интегронов у патогенных и условно-патогенных представителей рода Burkholderia // Проблемы особо опасных инф. - 2004. - Вып.88. - С.27-29), но этот способ не предназначен для детекции генов устойчивости к антибиотикам у штаммов Y.pestis.

Выпускается ряд коммерческих тест-систем для определения резистентности микроорганизмов к антибиотикам методом ПЦР и секвенирования. В том числе «Набор реагентов для выявления устойчивости микобактерий псевдотуберкулеза к рифампицину» (Интерлабсервис, г.Москва, Россия; «Устойчивость к тетрациклинам» (НПО «Литех», г.Москва, Россия); «Резистентность Enterobacteriaceae к цефалоспоринам и фторхинолонам» (НПО «Литех», г.Москва, Россия), но эти тест-системы либо не предназначены для определения генов антибиотикоустойчивости у штаммов возбудителя чумы, либо имеют к этому достаточно косвенное отношение.

Для выявления антибиотикоустойчивых штаммов возбудителя чумы в настоящее время используют микробиологические методы, предусматривающие обязательный этап культивирования возбудителя с антибиотиком. Для проведения анализа требуется значительное количество времени (не менее 48 часов), что затрудняет своевременный выбор лекарственного препарата для лечения больного.

Задачей изобретения является разработка простого, быстрого и надежного способа выявления генов антибиотикоустойчивости у штаммов возбудителя чумы.

Заявляемый способ основан на использовании в качестве ДНК-мишеней генов устойчивости к стрептомицину, хлорамфениколу и канамицину. Эти гены достаточно широко распространенные среди бактерий и расположены в основном на мобильных генетических элементах. Гены strA, strB имеют плазмидную локализацию и кодируют белки А и В устойчивости к стрептомицину. Ген cat кодирует хлорамфеникол ацетилтрансферазу и также имеет преимущественно плазмидную локализацию, а ген npt, продуктом которого является белок резистентности к канамицину входит в состав транспозона Tn5.

Все эти гены могут передаваться с помощью горизонтального переноса генетической информации в штаммы различных бактерий, в том числе и в штаммы Y.pestis, что может привести к возникновению множественной антибиотикоустойчивости штаммов возбудителя чумы.

Впервые предложен способ детекции генов антибиотикоустойчивости у штаммов Y.pestis, основанный на выявлении генов strA, strB, cat и npt, кодирующих устойчивость к стрептомицину, хлорамфениколу и канамицину методом полимеразной цепной реакции.

Технический результат заключается в выявлении в короткие сроки генов антибиотикоустойчивости.

Технический результат достигается способом детекции генов антибиотикоустойчивости у штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции, характеризующимся тем, что ПЦР с амплификацией фрагментов генов устойчивости к стрептомицину, хлорамфениколу и канамицину - strA, strB, cat и npt у исследуемого штамма возбудителя чумы проводят с использованием олигонуклеотидных праймеров следующего состава:

strA-S CATTCTGACTGGTTGCCTG

strA-As ATTGCGGGACACCACATCA;

strB-S ACCTGTTCTCATTGCGGAC

strB-As GAAAGGCACCCATAAGCGT;

cat-S ATTCACATTCTTGCCCGCC

cat-As ATCAGCACCTTGTCGCCTT;

Tn5-S ATTCGGCTATGACTGGGCA

Tn5-As ATGTTTCGCTTGGTGGTCG;

с последующим выявлением генов strA, strB, cat и npt по наличию амплификатов с размерами соответственно 387, 705, 377 и 361 п.н.

Способ осуществляют следующим образом.

Выделение ДНК чумного микроба проводят по стандартной методике в соответствии с МУ 1.3.1794-03 «Организация работы при исследовании методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности».

Полимеразную цепную реакцию осуществляют по стандартной методике (МУ 1.3.1794-03) с применением праймеров на гены strA, strB, cat и npt. Олигонуклеотидные праймеры, используемые для детекции этих генов, рассчитаны нами на основе нуклеотидных последовательностей генов strA, strB, cat и npt, представленных в базе данных NCBI GenBank. С помощью указанных праймеров проводят в ПЦР амплификацию фрагментов генов strA, strB, cat и npt, определяют наличие амплификатов и их размеры.

Праймеры на гены strA, strB, cat и npt имеют следующие последовательности:

strA-S CATTCTGACTGGTTGCCTG

strA-As ATTGCGGGACACCACATCA;

strB-S ACCTGTTCTCATTGCGGAC

strB-As GAAAGGCACCCATAAGCGT;

cat-S ATTCACATTCTTGCCCGCC

cat-As ATCAGCACCTTGTCGCCTT;

Tn5-S ATTCGGCTATGACTGGGCA

Tn5-As ATGTTTCGCTTGGTGGTCG.

Полимеразную цепную реакцию с амплификацией фрагментов генов strA, strB, cat и npt осуществляют по следующей программе: 1 цикл - 94°С 5 мин, затем 35 циклов при 94°С 45 с, 60°С 1 мин, 72°С 45 с и завершающий цикл 72°С 3 мин. Определение наличия амплификата и его размера проводят методом электрофореза в 1-2% агарозном геле относительно стандарта маркеров молекулярных масс размером от 100 до 1000 п.н. У штаммов Y.pestis, содержащих гены strA, strB в ПЦР образуются амплификаты размером 387 и 705 соответственно, cat - размером 377 п.н. У штаммов, содержащих ген npt, в ПЦР с праймерами на этот ген образуется фрагмент размером 361 п.н. У штаммов возбудителя чумы, которые не содержат генов strA, strB, cat и npt, в ПЦР с праймерами на эти гены амплификаты не образуются.

Сущность изобретения поясняется примерами.

Пример 1. Детекция генов антибиотикоустойчивости у штамма Y.pestis №1 (модельный эксперимент).

Выделение ДНК штамма №1 проводят стандартным методом с помощью лизирующего раствора на основе 6М гуанидинизотиоцианата с предварительным обеззараживанием культуры путем добавления мертиолята натрия до концентрации 1:10000 с последующим прогреванием при температуре 56°С в течение 30 мин. (Организация работы при исследованиях методом ПЦР материала, инфицированного микроорганизмами I-II групп патогенности. МУ 1.3.1794-03).

Полимеразную цепную реакцию проводят в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержит: 1х буфер (10х ПЦР-буфер - 2,5 мкл), MgCl₂ - 2,0 мМ, смесь dNTP - 0,3 мМ, олигонуклеотидные праймеры - 2 пмоль, Taq DNA полимераза - 0,1 ед., исследуемой ДНК - 10 мкл. Продукты амплификации анализируют в 1-2% агарозном геле с добавлением этидиум бромида и просматривают в УФ свете.

В ПЦР с праймерами на гены strA и strB у штамма Y.pestis №1 образуются амплификаты размером 387 и 705 п.н. Таким образом, штамм №1 содержит гены strA и strB устойчивости к антибиотику стрептомицину.

Пример 2. Детекцию генов антибиотикоустойчивости у штамма Y.pestis №2 проводят аналогично примеру 1.

В ПЦР с праймерами на ген cat у штамма №2 образуется амплификат размером 377 п.н. Таким образом, штамм содержит ген cat устойчивости к хлорамфениколу.

Пример 3. Детекцию генов антибиотикоустойчивости у штамма Y.pestis №3 проводят аналогично примеру 1.

ПЦР с праймерами на ген npt у штамма №3 образуется амплификат размером 361 п.н. Таким образом, штамм №3 содержит ген npt устойчивости к канамицину.

Пример 4. Детекцию генов антибиотикоустойчивости у штамма Y.pestis №4 проводят аналогично примеру 1.

В ПЦР с праймерами на гены strA, strB, cat, npt у штамма №4 амплификаты не образуются. Таким образом, у штамма №4 отсутствуют гены strA, strB, cat, npt.

Как следует из вышеизложенного, заявленный способ позволяет быстро, эффективно и надежно выявлять гены устойчивости к антибиотикам у штаммов возбудителя чумы.

Способ предусматривает выделение ДНК исследуемого штамма возбудителя чумы, проведение ПЦР с использованием олигонуклеотидных праймеров на гены устойчивости к стрептомицину, хлорамфениколу и канамицину - strA, strB, cat и npt (нуклеотидные последовательности праймеров приведены в описании). Детекцию генов антибиотикоустойчивости проводят по наличию амплификатов фрагментов генов strA, strB, cat и npt, имеющих размер соответственно 387, 705, 377 и 361 п.н. Использование изобретения позволяет эффективно и надежно выявлять гены устойчивости к антибиотикам у штаммов возбудителя чумы. 4 пр.

Способ детекции генов антибиотикоустойчивости у штаммов возбудителя чумы методом полимеразной цепной реакции, характеризующийся тем, что ПЦР с амплификацией фрагментов генов устойчивости к стрептомицину, хлорамфениколу и канамицину - strA, strB, cat и npt проводят с использованием олигонуклеотидных праймеров следующего состава:
strA-S CATTCTGACTGGTTGCCTG;
strA-As ATTGCGGGACACCACATCA;
strB-S ACCTGTTCTCATTGCGGAC;
strB-As GAAAGGCACCCATAAGCGT;
cat-S ATTCACATTCTTGCCCGCC;
cat-As ATCAGCACCTTGTCGCCTT;
Tn5-S ATTCGGCTATGACTGGGCA;
Tn5-As ATGTTTCGCTTGGTGGTCG,
с последующим выявлением генов strA, strB, cat и npt по наличию амплификатов с размерами соответственно 387, 705, 377 и 361 п.н.