СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ Российский патент 1995 года по МПК C12Q1/04 

Изобретение относится к медицине, а именно к микробиологии.

Известен дискодиффузионный способ определения антибиотикочувствительности возбудителя чумы, который не позволяет получить результаты при исследовании проб с небольшой концентрацией возбудителя и обсемененных посторонней микрофлорой.

Наиболее близким к предлагаемому изобретению является иммунофлуоресцентный способ экспрессного определения чувствительности к антибиотикам и химио-препаратaм возбудителей опасных инфекционных заболеваний, включающий посев первичного исследуемого материала на пластинки твердой питательной среды, содержащие (опытные) и не содержащие (контрольные) испытуемые антибиотики с последующим термостатированием и изготовлением препаратов-отпечатков для иммунофлуоресцентного исследования.

Недостатками прототипа являются необходимость для его проведения высокой концентрации микробных клеток в исследуемой пробе (для возбудителя чумы 10⁷ микробных клеток в 1 мл); возможность несовпадения данных по чувствительности микробов к антибиотикам с клиническими наблюдениями, поскольку исследования проводят ин витро; невозможность определения антибиотикочувствительности возбудителей генетически измененных или покрытых оболочкой (инкапсулированных), поскольку они могут не давать роста на искусственных питательных средах.

Целью предлагаемого изобретения является повышение чувствительности способа.

Сущность изобретения состоит в том, что исследование нативного материала осуществляют путем введения опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотикам в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, причем суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1:1,4 с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана, мазки-отпечатки готовят с места введения, а антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках-отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных.

Отличительные признаки заключаются в том, что исследование нативного материала осуществляют путем введения опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотикам в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины 0,5-1 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, причем суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1: 1,4 с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана, мазки-отпечатки готовят с места введения, а антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках-отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных.

Изобретение осуществляется следующим образом.

Испытуемый антибиотик вводят по схеме лечения больных бубонной формой чумы 3 опытным белым мышам в лечебной дозе, рассчитанной для этих животных. Трем контрольным мышам антибиотик не вводят. Исследуемый материал в количестве 0,5-1 мл смешивают с желтком куриного яйца в соотношении 1:1,4. К полученной смеси добавляют поливинилпирролидон и циклофосфан из расчета 25 и 7 мг соответственно на одно животное. Полученную суспензию набирают в шприц и вводят подкожно в область спины 6 указанным белым мышам, начиная с контрольных.

По одному животному из контрольной и опытных групп вскрывают через 8,24,48 ч после введения исследуемого материала. Грызунов умерщвляют одним из известных способов и прикрепляют к вскрывочной доске спиной кверху. Отсепаровывают кожу спины и кожный лоскут отбрасывают на голову грызуна. При этом легко обнаруживают место введения, мазки-отпечатки которого фиксируют в хлороформе в течение 10-20 мин и окрашивают по Граму и чумной люминесцирующей сывороткой.

Обнаружение возбудителя чумы в какой-либо из указанных сроков у контрольных животных при отсутствии его у опытных свидетельствует об эффективности испытуемого антибиотика. При неэффективности антибиотика возбудитель чумы обнаруживают как в контроле, так и в опыте.

Результаты приведены в таблице.

При определении чувствительности возбудителя чумы в дозе от 10¹ до 10⁹ м.кл./мл к каждому из испытанных антибиотиков установлено, что для известного способа пороговая концентрация составляет 10⁷ м.кл./мл, предлагаемым же методом эффективность антибиотиков можно установить при всех указанных концентрациях (10¹-10⁹), при этом сроки выдачи результатов могут колебаться от 8 до 48 ч (в зависимости от дозы возбудителя в 1 мл).

Использование предлагаемого способа, в частности введение исследуемого материала биопробным мышам вместе с желтком куриного яйца, поливинилпирролидоном и циклофосфаном вызывает задержку, размножение и накопление микробных клеток чумы в первые двое суток только на месте введения, что облегчает поиск возбудителя. При этом создаются оптимальные условия для размножения возбудителя чумы и интенсивного синтеза видоспецифического антигена-фракции I, резко повышается чувствительность биологического метода. Так, иммунофлуоресцентным методом чумной микроб при его концентрации 10⁹-10⁷ в 1 мл может быть обнаружен через 6-8 ч, а при концентрации 10⁶-10² и 10¹ соответственно через 24 и 48 ч. Такая высокая чувствительность помимо того, что дает возможность проводить индикацию, позволяет определять антибиотикочувствительность возбудителя чумы в живом организме (ин виво). При этом при больших концентрациях (10⁹-10⁷) результат можно получить уже через 6-8 ч (экспрессное определение). Применение предлагаемого способа позволяет проводить экспрессное определение антибиотикочувствительности возбудителя чумы при его минимальной (10²-10¹ м.кл./мл) концентрации в исследуемом нативном материале; исключает несовпадение данных по чувствительности микробов чумы к антибиотикам с клиническими наблюдениями, поскольку исследования проводят ин виво; дает возможность определения антибиотикочувствительности возбудителей генетически измененных или покрытых оболочкой (инкапсулированных), которые могут не расти на искусственных питательных средах и поэтому их чувствительность к антибиотикам не может быть определена в опытах ин витро.

Использование: медицина, микробиология. Сущность изобретения: опытных белых мышей обрабатывают испытуемым антибиотиком в лечебной дозе. Контрольным мышам антибиотик не вводят. Затем всем мышам вводят подкожно в область спины 0,5 1 мл суспензии исследуемого нативного материала в физиологическом растворе, предварительно смешанной с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1 1,4, с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана. С места введения готовят мазки отпечатки, фиксируют их и подвергают иммунофлуоресцентному анализу. Антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках-отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных. Способ позволяет проводить определение антибиотикочувствительности при концентрации возбудителя чумы 10²-10¹ микр. кл/мл. 1 табл.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИБИОТИКОЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ВОЗБУДИТЕЛЯ ЧУМЫ, включающий исследование нативного материала, изготовление и фиксацию мазков-отпечатков с последующим их иммунофлуоресцентным анализом, отличающийся тем, что, с целью повышения чувствительности способа, исследование нативного материала осуществляют путем введения опытным белым мышам, обработанным испытуемым антибиотиком в лечебной дозе, и контрольным мышам подкожно в область спины 0,5 1,0 мл суспензии исследуемого материала в физиологическом растворе, причем суспензию предварительно смешивают с желтком куриного яйца в объемном соотношении 1 1,4 с 25 мг поливинилпирролидона и с 7 мг циклофосфана, мазки-отпечатки готовят с места введения, а антибиотикочувствительность определяют по отсутствию возбудителя чумы в мазках-отпечатках опытных мышей при обнаружении его у контрольных.