ШТАММ БАКТЕРИЙ SALMONELLA INFANTIS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ В КАЧЕСТВЕ ПОЛОЖИТЕЛЬНОГО КОНТРОЛЯ ДЛЯ МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИХ, А ТАКЖЕ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ, СВЯЗАННЫХ С ОПРЕДЕЛЕНИЕМ ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ МИКРООРГАНИЗМОВ К АНТИБАКТЕРИАЛЬНЫМ ПРЕПАРАТАМ Российский патент 2022 года по МПК C12N1/20 

Исследование относится к области микробиологии, молекулярной биологии и касается раздела определения чувствительности микроорганизмов к противомикробным препаратам, а также обнаружения механизмов резистентности на молекулярном уровне и может быть использовано в качестве положительного контроля при микробиологических исследованиях по определению чувствительности бактерий к следующим антибактериальным препаратам: ампициллин, амоксициллин, цефотаксим, ципрофлоксацин, левофлоксацин, стрептомицин, доксициклин, хлорамфеникол, флорфеникол, сульфаметоксазол, триметоприм, а также в качестве контроля при детекции генов (bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sul1, sul2, dfrA), кодирующих устойчивость к данным противомикробным препаратам.

Похожими свойствами обладает штамм Escherichia coli NCTC 13353, имеющий ген устойчивости к бета-лактамным антибиотикам, штамм Neisseria gonorrhoeae CCUG 57600, проявляющий устойчивость к ципрофлоксацину, пенициллину, а также тетрациклину, штамм Salmonella enterica subsp.enterica serovar Typhi 19214, резистентный к хлорамфениколу, стрептомицину, тетрациклину, а также сульфаниламидам, штамм SALMONELLA ENTERICA VGNKI-11 (ВКШМ-Б-848М), проявляющий устойчивость к цефалоспоринам, фторхинолонам, тетрациклинам, аминогликозидам, сульфаниламидам, триметоприму. Предлагаемый в качестве изобретения штамм имеет более широкий спектр устойчивости к различным антибактериальным препаратам, что делает его применение в микробиологических и молекулярно-генетических исследованиях более универсальным.

Устойчивость к антибактериальным препаратам штамма обусловлена наличием соответствующих генетических факторов резистентности. При тестировании методом полногеномного секвенирования изолята Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М выявлены следующие биохимические механизмы устойчивости к антибиотикам различных классов:

модификация мишени действия - обуславливается генами dfrA, sull или мутациями в гене gyrA (p.S83Y),;

защита мишени действия - обуславливается генами qnrE, floR;

инактивация антибиотика - обуславливается генами bla_CTX-м-14, aadA2, ААС(6')-Ib3;

активное выведение антибиотика из микробной клетки (эффлюкс) - обуславливается генами tetA/tetR/B.

Таким образом, устойчивость бактерии к антибиотикам может определяться целым рядом генов, кодирующих специфичные белки, а также мутациями генов, кодирующих мишени действия антибиотиков.

В плазмидных контигах штамма были обнаружены гены резистентности к тетрациклинам: tetA, tetR, данные гены в комплексе представляет собой белковую трансмембранную транспортную систему, осуществляющую выведение (эффлюкс) тетрациклинов из бактериальной клетки путем активного транспорта. Эффлюкс система tetA относится к суперсемейству основных транспортеров MFS (major facilitator superfamily), использующих для транспорта антибиотиков энергию протонового градиента или градиента ионов Na⁺. Приобретенный ген dfrA (12, 14) объясняет наблюдаемую устойчивость к триметоприму. Изолят демонстрирует устойчивость к фторхинолонам, которая обеспечена мутацией в хромосомном гене gyrA (S83Y). Штамм имеет приобретенный ген аас6-1у, который ассоциирован с резистентностью к аминогликозидам.

С помощью программы IntegronFinder обнаружены интегроны 1 и 2 класса (фиг. 1) В изоляте выявлены мобильные элементы для горизонтального переноса генов: интегроны 1 (Intl, attl, dfrA12, attC, aadA2, attC, qacEA1, sul1) и 2 (Int2, attI, dfrAH, lsp, attC) классов, несущие гены резистентности к аминогликозидам (aadA), сульфаниламидам (sull), триметприму (dfrA).

Таким образом система высокопроизводительного полногеномного секвенирования не выявила ни одного гена антибиотикорезистентности, который не имел бы соответствующего микробиологического признака антибиотикорезистентности.

Наиболее близким по сущности к заявленному изобретению относится штамм SALMONELLA ENTERICA SUBSP. ENTERICA SEROVAR NEWPORT B-9044, обладающий множественной устойчивостью к антибактериальным препаратам, характеризующийся устойчивостью к ампициллину, цефтазидиму, цефотаксиму, цефокситину, тетрациклину и хлорамфениколу. Предлагаемый в качестве изобретения штамм имеет больший спектр устойчивости к противомикробным препаратам, что делает его использование более универсальным в лабораторной практике.

Изобретение направлено на разработку контрольного штамма Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М, необходимого для контроля устойчивости к широкому спектру антибактериальных препаратов, при этом имеющего достоверно подтвержденные генетические факторы резистентности.

Задача настоящего изобретения - создание стабильно-сохраняющего свойства референтного штамма для контроля молекулярно-генетических и микробиологических исследований, связанных с определением чувствительности к антибактериальным препаратам, а также выявлением специфических участков генов, кодирующих эту устойчивость Штамм депонирован во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-896М.

Штамм Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М для микробиологических исследований для контроля устойчивости микроорганизмов к ампициллину, амоксициллину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, стрептомицину, доксициклину, хлорамфениколу, флорфениколу, сульфаметоксазолу и триметоприму, а также для молекулярно-генетических исследований при выявлении генов устойчивости (bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sull, sul2, dfrA) к данным антимикробным препаратам.

Характеристика штамма Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М

Данный штамм выделен из биологического материала - фекалии птицы (курица).

Морфологические свойства: подвижные, прямые, грамотрицательные палочки с закругленными концами, спор и капсул не образуют.

Патогенные свойства: штамм патогенный для человека, 4 группа патогенности согласно СП 1.2.036-95 и СП 1.3.2322-08 (с изм от 29.06.2011).

Культуральные свойства: оптимальное время инкубации 18-24 часа, при температуре (37±1)°С, рН среды 7,2. Формируют на мясо-пептоном агаре плоские, светло-белые, круглые колонии, диаметром 2-3 мм; на агаре Эндо бледно-розовые, плоские, полупрозрачные, круглые колонии, диаметр 2-3 мм; на XLD-arape бесцветные (в цвет агара) с черным центром колонии, плоские круглые, с ровными краями, диаметр 2-3 мм; на висмут-сульфит агаре формирует черные, плоские, круглые, с ровными краями колонии с характерным металлическим блеском и почернением среды под колонией диаметр 1,5-2 мм; на хромогенном агаре Рамбах образуют круглые, плоские колонии, с характерным красным цветом диаметр 2-3 мм; рост на жидких питательных средах характеризуется диффузным помутнением среды.

Антигенная структура: штамм агглютинируется сыворотками 07,06; Н-r; Н-1,5.

Ферментативные свойства: ферментирует с образованием кислоты и газа лизин, аргинин, орнитин, инозит, цитрат, сорбит, маннит, агматин, фруктозу, трегалозу, арабинозу, мальтозу, ксилозу. Не ферментирует лактозу, сахарозу, не образует индол, образует сероводород.

Особенности штамма:

Выраженная полирезистентность (устойчивость к ампициллину, амоксициллину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, стрептомицину, доксициклину, хлорамфениколу, флорфениколу, сульфаметоксазолу и триметоприму.

Наличие генов bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sul1, sul2, dfrA.

Для поиска генов антибиотикорезистентности в бактериальном геноме использовали сервис ResFinder и базы данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, The Comprehensive Antibiotic Resistance Database и NCBI Bacterial Antimicrobial Resistance Reference Gene Database (табл. 1). Подтверждено наличие генетических факторов резистентности bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sul1, sul2, dfrA) (таблица 1).

Данные, полученные при помощи NGS на Miseq, и данные функциональных микробиологических тестов хорошо согласуются между собой (таблица 2).

Молекулярный механизм устойчивости - элементы устойчивости к антимикробным препаратам bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sul1, sul2, dfrA).

Стабильность наличия генетических детерминант устойчивости контрольного штамма Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М подтверждалась повторным секвенированием ДНК штамма и анализом нуклеотидной последовательности после хранения штамма в течение 6 месяцев в лиофилизированном виде в ампулах под вакуумом при температуре 2-8 С°. Изобретение реализуется следующим образом:

Пример 1

Контроль качества при определении чувствительности к антимикробным препаратам методом серийных разведений.

Тестирование проводили согласно: МУК 4.2.1890-04 «Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам»; VET01-A4 Performance Standards for Antimicrobial Disk and Dilution Susceptibility Tests for Bacteria Isolated From Animals, Approved Standard -Fourth Edition.

Тестирование проводили микрометодом (величина конечного объема 100 мкл) с использованием 96-ти луночных планшетов.

Для исследования готовили инокулюм мутностью 0,5 стандарта McFarland. Для этого использовали суточную культуру, отбирали 3-5 колоний и растворяли их в 0,9% физиологическом растворе, разбавляли в бульоне (бульон Мюллера-Хинтона с добавлением ионов кальция и магния) и вносили в 96-ти луночные планшеты, в которые предварительно были добавлены исследуемые антибактериальные субстанции. После этого планшеты инкубировали 24 часа при 37°С. Учет результатов проводили визуально. За минимальную подавляющую концентрация антибактериального препарата принимали первую лунку, в которой не наблюдалось видимого роста микроорганизма (помутнение среды).

Контрольный штамм проявил выраженную устойчивость к ампициллину, амоксициллину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, стрептомицину, доксициклину, хлорамфениколу, флорфениколу, сульфаметоксазолу и триметоприму, уровень устойчивости расценивался как высокий.

Пример 2

Контроль качества определения механизма устойчивости к антимикробным препаратам, ассоциированных с генетическими факторами устойчивости bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sull, sul2, dfrA.

Выделение геномной ДНК из жидкой суточной бактериальной культуры Salmonella infantis проводили с использованием наборов в соответствии с инструкцией производителя: «PureLink Genomic DNA» (Invitrogen) или «АмплиПрайм ДНК-сорб-В» (ФБУН ЦНИИЭ). Концентрацию ДНК измеряли на флуориметре Quantus (Promega) с использованием набора реагентов QuantiFluor® ONE dsDNA System (Promega Corporation, США).

Для проверки качества выделенной ДНК проводили электрофорез согласно стандартной процедуре в ТАЕ буфере в 0,8% агарозном геле (напряжение 240 В, длительность 20 мин, маркер длин «1 kb DNA Ladder», Евроген). Визуализацию результатов электорфореза проводили при помощи ультрафиолетового трансиллюминатора с видеосистемой гель-документирования Infinity 1500/36М Xpress (Vilber Lourmat). Качество геномной ДНК оценивалось по наличию узкой высокомолекулярной полосы длиной около 15-20 тыс.п.н.

Оценку качества геномной ДНК, расчет молярной концентрации также можно проводить с использованием системы микрокассетного электрофореза TapeStation 4200 согласно руководству по эксплуатации прибора и инструкцям G2991-90040.

Подготовку библиотек проводили с использованием набора для NGS Nextera XT DNA Sample Preparation Kit, набора индексов Nextera XT Index Kit, магнитных шарики для очистки ампликонов (Agencourt AMPure ХР, Beckman Coulter, США), набор реагентов для секвенирования MiSeq® Reagent Kit v2/v3 согласно стандартному протоколу производителя. Секвенирование геномов исследуемых штаммов и контрольного штамма проводили на приборе MiSeq с использованием наборов реагентов MiSeq® Reagent Kit v2/v3 (США).

Поиск генетических факторов, обеспечивающих резистентность к антибиотикам, вели при помощи нескольких ресурсов: онлайн-ресурс ResFinder, находящегося на сервере Центра геномной эпидемиологии Датского технического университета; база данных Antibiotic Resistance Gene-ANNOTation, база данных The Comprehensive Antibiotic Resistance Database. Аннотация геномов была выполнена с помощью сервера RAST на открытой платформе для сравнительного анализа геномов SEED.

Контрольный штамм Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М проявлял заявленные свойства: стабильно обнаруживались элементы устойчивости к антимикробным препаратам (bla _стх-м-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sul1, sul2, dfrA)

Для обеспечения достоверной идентификации устойчивых к антимикробным препаратам микроорганизмов необходимо проводить контроль качества на каждом этапе исследования. Предлагаемый штамм Salmonella infantis ВКШМ-Б-896М обладает стабильными свойствами, позволяющими контролировать этап определения механизма устойчивости микробиологическими и молекулярно-генетическими методами.

Литературные источники

1. Ramirez M.S., Tolmasky M.E. Aminoglycoside modifying enzymes. Drug Resist Updat. 2010; 13(6): 151-71. doi: 10.1016/j.drup.2010.08.003.

2. Aviv et al. (2014) A unique megaplasmid contributes to stress tolerance and pathogenicity of an emergent Salmonella enterica serovar Infantis strain. Environmental Microbiology, 16(4), 977-994.

3. Jiang, L., Olesen, I., Andersen, Т., Fang, W., & Jespersen, L., 2010. Survival of Listeria monocytogenes in simulated gastrointestinal system and transcriptional profiling of stress-and adhesion-related genes. Foodborne Pathog. Dis. 7(3), 267-274.

4. Xu Q. et al. Prevalence and characterization of Salmonella serovars isolated from farm products in Shanghai // Food Control. - 2018. - T. 85. - C. 269-275.

5. Wang Y. et al. Distribution and antimicrobial susceptibility of foodborne Salmonella serovars in eight provinces in China from 2007 to 2012 (except 2009) // Foodborne pathogens and disease. - 2017. - T. 14. - №. 7. - C. 393-399.

6. Holzel, C.S. [et al] Phenotypic and genotypic bacterial antimicrobial resistance in liquid pig manure is variously associated with contents of tetracyclines and sulfonamides / C.S. Holzel [et al] // J. Appl. Microbiol. - 2010. - Vol. 108. - P. 1642-1656.

7. Супотницкий M.B. Механизмы развития резистентности к антибиотикам у бактерий / М.В. Супотницкий // БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение. - 2011. - №. 2 (42). - С. 4-11.

Изобретение относится к области биотехнологии. Изобретение представляет собой штамм бактерий Salmonella infantis, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-896М, обладающий множественной резистентностью к антимикробным препаратам, а также выявленными генетическими детерминантами устойчивости для микробиологических исследований в качестве контрольного штамма для контроля устойчивости микроорганизмов к ампициллину, амоксициллину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, стрептомицину, доксициклину, хлорамфениколу, флорфениколу, сульфаметоксазолу, триметоприму и молекулярно-генетических исследований, в качестве контрольного для обнаружения генов резистентности bla _CTX-M-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sull, sul2, dfrA, кодирующих устойчивость к данным противомикробным препаратам. 1 ил., 3 табл.

Штамм бактерий Salmonella infantis VGNKI-02108, депонированный во «Всероссийской коллекции штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве» под номером ВКШМ-Б-896М, обладающий множественной устойчивостью к антимикробным препаратам, с выявленными генетическими детерминантами устойчивости для микробиологических и молекулярно-генетических исследований в качестве контрольного штамма для определения резистентности микроорганизмов к ампициллину, амоксициллину, цефотаксиму, ципрофлоксацину, левофлоксацину, стрептомицину, доксициклину, хлорамфениколу, флорфениколу, сульфаметоксазолу и триметоприму и молекулярно-генетических исследований, а также для идентификации генов устойчивости к тем же антимикробным препаратам (blа _CTX-M-14, gyrA (p.S83Y), qnrE, tetA/R, tetB, aadA2, strA/strB, aac(6')-Ib3, floR, sul1, sul2, dfrA).