ПАНЕЛЬ СЫВОРОТОК, СОДЕРЖАЩИХ АНТИТЕЛА К АНТИГЕНАМ HCV РАЗНЫХ СУБТИПОВ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к области биотехнологии, иммунологии и вакцинологии и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток, содержащих антитела к вирусам наиболее социально опасных инфекций.

Формируют коллекцию образцов плазмы инфицированных лиц из разных регионов России. Образцы плазмы в России обязательно скринируют на присутствие HBsAg и анти-HIV 1+2, анти-HCV и анти-Тр антител. Приблизительно 2% всех образцов посылается на повторное подтверждение в контрольные лаборатории. Однако эффективность подтверждения результатов зависит не только от качества тест-систем, но и от наличия в контрольных лабораториях стандартных препаратов на анализируемые инфекционные маркеры Recommendations agreed by the Group для серологической диагностики гепатита С.

Приготовить anti-HCV genotype reference panel. Все компоненты панели должны быть инактивированы и должны быть приготовлены из образцов плазмы (сывороток) генотипов 1, 2 и 3. В последующем по мере накопления материала в эту панель можно добавлять реактивные образцы генотипов 4, 5 и в состав панели следует включать образцы, предельно разбавленные в рекальсифицированной плазме, отрицательной на HBsAg, anti-HCV и anti-HIV 1+2 и отрицательные в ПНР анализах на HCV RNA, HIV RNA и HBV DNA [Совещания ECBS WHO 1996, 2000].

При решении проблемы оценки качества диагностики вирусных инфекций в России следует создать Коллекцию плазмы пациентов с установленным диагнозом, главным образом из региональных инфекционных клиник. И на основе этого материала формировать национальные панели сывороток. Этот вывод имеет и статистическое обоснование, т.к. постановка диагноза требует значительных затрат времени и участия квалифицированного персонала.

В соответствии с рекомендациями ECBS национальные панели должны включать образцы плазмы с генотипами и субтипами, характерными для России.

Использование в каждодневной работе препаратов различных субтипов ВГС позволит расширить спектр диагностируемых маркеров и использовать эти материалы для контроля качества выполнения анализов препаратов крови на выявление заражения гепатитом С.

Внешний контроль качества лабораторных исследований является неотъемлемой частью обеспечения информативности и достоверности лабораторной диагностики. Серологическая диагностика анти-ВГС - основной инструмент контроля и профилактики гепатита С. Выявление антител к каждому из антигенов вируса гепатита С имеет самостоятельное диагностическое значение.

Для этой цели наиболее широко используется при скрининге иммуноферментный анализ (ИФА). Для выполнения ИФА используют тест-системы, представляющие собой многокомпонентные наборы антигенов вируса. На эффективность проведения ИФА влияет не только качество этих антигенов, но и профессиональная подготовленность лабораторного персонала, обеспечивающего выполнение теста [4]. Для обеспечения объективной внешней оценки качества лабораторного исследования крайне необходимы специально приготовленные и аттестованные референс материалы.

Известна мастер панель HBsAg. Описан МП. Для формирования панели необходимо иметь представительную выборку плазмы или сывороток, составленную из образцов различных регионов России, и аттестованных по генотипу ВГВ и серотипу HBsAg [2].

Известна национальная панель сывороток (НПС) анти-ВГС [3, прототип]. Активными компонентами набора являются антитела к ВГС, вступающие в реакцию с участками белков разных субтипов ВГС, кодируемыми структурной (core) и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областью генома ВГС, образцы разведены в стабилизированной дефибринизированной плазме.

В набор входят 20 образцов сыворотки крови человека, содержащих и не содержащих антитела к субтипам 1a, 1b, 2 и 3а вируса гепатита С, которые можно использовать для контроля качества как скрининговых, так и подтверждающих иммуноферментных тест-систем. Активными компонентами набора являются антитела к ВГС, вступающие в реакцию с участками белков разных субтипов ВГС, кодируемыми структурной (core) и неструктурной (NS3, NS4, NS5) областью генома ВГС, образцы разведены в стабилизированной дефибринизированной плазме.

Основным недостатком контрольной панели является малая выборка образцов. 16 положительных образцов НПС не позволяют отобразить все многообразие генотипического и антигенного представительства ВГС в России, что снижает качество контроля тест-систем. Аналогично и специфичность тест-систем должна тестироваться на представительной выборке отрицательных образцов, включая донорские сыворотки и сыворотки лиц из групп риска.

Техническим результатом данного изобретения является:

получение национальной панели сывороток, обеспечивающей более качественный контроль ИФА тест-систем: для практических ситуаций анализа образцов плазмы (сывороток) с наличием и отсутствием вируса гепатита С, с наличием и отсутствием антител к ВГС, но с установленным диагнозом гепатит С или здоровый пациент.

Технический результат достигается созданием панели лиофильно высушенных образцов плазм (сывороток), содержащих и не содержащих антитела к различным субтипам ВГС и к разным антигенам вируса, распространенных в различных регионах России.

Настоящая панель анти-ВГС построена на выборке из 100 первично анти-ВГС положительных образцов плазмы, генотипированных и субтипированных для HCV RNA, и 100 отрицательных образцов плазмы, взятых у здоровых доноров и лиц из групп риска с ревматоидным фактором и аутоиммунными антителами.

Положительная часть панели включает образцы плазмы пациентов, положительных на РНК ВГС, и формируется в виде набора блоков, содержащих отдельно антитела к NS5, NS4, NS3 и к Core антигенам (образцы №1-100).

Отрицательная часть панели включает образцы плазмы доноров, не содержащих антитела к ВИЧ-1/2, ВГВ, ВГС и к сифилису, и к HBsAg, из групп риска, не инфицированных HCV (образцы от №101-200). Для строгого контроля специфичности в отрицательный блок включены гетерофильные сыворотки с ревматоидным фактором (RF) и с аутоиммунными антителами.

Предлагается панель (П анти-ВГС) лиофильно высушенных сывороток, содержащих и не содержащих анти-ВГС, полученных от людей, инфицированных вирусом гепатита С, добровольцев и доноров крови. Положительная часть панели включает образцы плазмы лиц, инфицированных вирусом гепатита С (образцы от №1 до №100), отрицательная часть панели включает образцы плазмы доноров, лиц из групп риска и добровольцев, не инфицированных HCV (образцы от №101-200).

Положительная часть панели состоит из 4-х блоков образцов плазмы, большей частью положительных в ПЦР на РНК ВГС и имеющих высокие уровни аминотрансфераз.

Каждый блок положительной части панели имеет свои особенности.

Образцы блока 1 (№1-25) аттестованы по генотипу и субтипу HCV. Блок 1 включает сыворотки 1, 2 и 3 генотипов различных субтипов (1a, 1b, 2а и 3а), распространенных на территории России. При этом образцы блока 1 обязательно содержат антитела к NS5 антигену наряду с антителами к другим антигенам.

2-й блок сформирован из образцов плазмы, имеющих положительный результат в ПЦР, частично субтипированных. При этом образцы блока 2 обязательно содержат антитела к NS4 антигену наряду с антителами к другим антигенам.

3-й блок составлен из образцов плазмы, имеющих положительный результат в ПЦР, частично субтипированных. При этом образцы блока 3 обязательно содержат антитела к NS3 антигену наряду с антителами к другим антигенам.

4-й блок составлен из образцов плазмы, имеющих положительный результат в ПЦР, частично субтипированных. При этом образцы блока 4 обязательно содержат антитела к core - антигену наряду с антителами к другим антигенам.

Отрицательный блок панели составлен из образцов плазмы доноров, волонтеров и представителей групп риска.

В состав блока включены образцы с гетерофильными антителами, в том числе человечьи антитела к мышиным сывороткам, с ревматоидном фактором и аутоиммунными антителами. Такой состав отрицательного блока дает возможность для строгого контроля специфичности диагностикумов.

Каждый образец панели аттестован по иммунобиологическим и биохимическим свойствам. Спектр антител определяли путем постановки образцов панели с образцами панели низкотитражных сывороток PHV106 (7) на одном микропланшете.

Панель предназначена для выполнения государственного контроля качества каждой серии лицензированных анти-ВГС тест-систем и для сертификации вновь создаваемых диагностикумов.

Панель может быть использована при определении титра анти-HCV антител различных субтипов.

Панель сывороток должна храниться при температуре (2-6)°С.

Разведенные сыворотки панели хранятся при температуре (2-6)°С один месяц, при температуре минус 24°С - 6 месяцев. Допускается 3-кратное замораживание и оттаивание сывороток.

Панели сывороток, содержащих и не содержащих антитела к вирусу гепатита С, получают следующим образом.

1. Поступление образцов плазмы.

Образцы плазмы поступают на производство в гемаконах CPDA-1 емкостью 250 мл, герметично укупоренные, замороженные.

Каждая плазма, поступающая на производство для изготовления панели, должна иметь паспорт с характеристиками - ИН (индивидуальный номер) донора, объем сыворотки, дату забора крови, предприятие-изготовитель, а также отвечать следующим требованиям: без признаков гемолиза и гиперлипидиемии, прозрачная, цвет - янтарный или светло-желтый, посторонние механические примеси, взвесь, осадок отсутствуют. Каждому гемакону присваивают кодирующий номер.

Инактивация сывороток здоровых доноров.

Гемаконы с плазмой помещают в термостат при температуре 56°С. Фиксируют время начала инактивации. Инкубирование плазмы проводят 3 ч. По истечении этого времени гемакон достают из термостата, фиксируют время окончания инактивации.

Измерение объема плазмы.

Измеряют объем каждой плазмы с помощью стерильного стеклянного мерного цилиндра.

Фасовка образцов плазмы.

Из каждого гемакона в стерильном боксе в ламинаре автоматической пипеткой отбирают 10 аликвот по (1±0,05) мл плазмы в пластиковые пробирки «Эппендорф» емкостью 1,5 мл для контроля по биохимическим показателям и для исследования вирусных маркеров в ПЦР и в ИФА. Пробирки закрывают, на каждой пробирке перманентным маркером пишут кодовый номер образца плазмы.

Оставшийся объем плазмы фасуют в стерильные пластиковые контейнеры емкостью 25 мл. На каждом контейнере перманентным маркером пишут кодовый номер.

Хранение образцов плазмы.

Гемаконы с донорской плазмой и их аликвоты помещают на хранение в морозильные камеры при температуре от минус 20°С до минус 35°С. Гемаконы до переработки хранят при этих условиях в течение до 10-ти лет. Допускается однократное замораживание и оттаивание сывороток.

Контроль аликвот плазмы методами ПЦР и ИФА.

По 2 аликвоты каждой плазмы передают в ИФА лабораторию для исследования образцов на содержание HBs антигена, антител к ВГС, ВИЧ-1,2 типов и анти-HBs. ИФА анализ проводят на импортных или отечественных, аттестованных ГИСК им. Л.А.Тарасевича, иммуноферментных тест-системах (Таблица 3).

Контроль биохимических показателей.

По одной аликвоте каждого образца плазмы в эппендорфе передают в биохимическую лабораторию для контроля биохимических показателей (цвет, уровень аминотрансфераз, общее содержание белка, рН). Содержание белка определяют микрометодом Лоури (Таблица 3).

Образцы плазм, не соответствующие требованиям по биохимическим показателям, отбраковываются и утилизируются.

Добавление к сыворотке раствора консерванта.

В каждый гемакон с плазмой добавляют 2% раствор мертиолята и гентамицина из расчета по 0,5 мл раствора каждого бактериостатика на 100 мл сыворотки и раствор хлористого кальция для осаждения балластных белков. Сыворотку (рекальсифицированную плазму) тщательно перемешивают. Конечная концентрация мертиолята в сыворотке составляет 0,01% и гентамицина 0,01%.

Приготовление пула донорских сывороток.

Из нативных сывороток крови, не содержащих маркеры вирусных инфекций, готовят пул не менее чем от 10 доноров.

Стабилизированный пул сывороток используют в качестве матрикса - разводящего раствора (РР) для приготовления положительных образцов МП. Доводят рН раствора до 6.8-7.2 при комнатной температуре с помощью 0.1 N NaOH или 0.1 N HCl. Растворы разливают стерильно в емкости по 250-500 мл и хранят при 2-8°С в течение не более 1 месяца. В замороженном виде при температуре минус 35°С растворы можно хранить в течение 10-ти лет.

1 Стабилизированный пул сывороток нормализуют по общему белку и вязкости относительно донорской сыворотки человека и получают РР. Контроль вязкости РР проводят с использованием стеклянного вискозиметра по классической методике с использованием калиброванного капилляра. Юстируют вязкость препаратов к вязкости НЧС с помощью 10%-ного раствора БСА или фосфатно-солевого буфера (ФСБ).

2. Титрование препаратов анти-ВГС.

Титрование препаратов анти-ВГС проводят с использованием РР на одном планшете в трех повторах в скрининге и в подтверждающих тестах - «Спектр анти-ВГС» компаний ЗАО Вектор Бест (Новосибирск), ЗАО МБС (Новосибирск) и НПК ДС (Н. Новгород) (фиг.1).

Референс-препараты анти-ВГС. Для выполнения аттестационных определений в работе используют панели анти-ВГС, аттестованные в относительных единицах в международных испытаниях:

- Низкотитражная панель сывороток PHV 106 BBI (Boston, USA).

3. Приготовление положительных образцов панели.

Для формирования 1, 2, 3 и 4 блоков положительной части панели изучают результаты исследований положительных образцов в ПНР, в скриннинговом и в подтверждающем ИФА, и определяют уровень содержания аминотрансфераз.

Образцы сывороток, содержащих анти-NS5 антитела и положительные в ПЦР (с определенным генотипом и субтипом ВГС), формируют блок 1; образцы сывороток, содержащие анти-NS4 антитела, положительные в ПЦР, формируют блок 2; образцы сывороток, содержащие анти-NSS антитела, положительные в ПЦР или с высоким уровнем аминотрансфераз, формируют 3-й блок; образцы сывороток, содержащие анти-Соге антитела, положительные в ПЦР или с высоким уровнем аминотрансфераз, формируют 4-й блок положительной части панели.

С помощью РР сыворотки блоков с 1-го до 4-го нормируют в диапазоне 1,5-5 ОП_крит для искомого антитела (фиг.1).

ОП_крит - На шкале оптического спектрометра весь диапазон значений оптической плотности (ОП) занимает от 0 до 4 о.е. Образцы сывороток крови человека разбивают этот диапазон на 2 области: область ОП здоровых доноров и область инфицированных пациентов. Граница между областью значений ОП доноров и инфицированных пациентов определяет значение ОП, при котором образец тестируемой крови (сыворотки) с равной вероятностью может быть аттестован как положительный (инфекционный), так и отрицательный (здоровый донор). Это граничное значение ОП называют в ИФА диагностике критическое ОП и обозначают сокращенно ОП_крит или в международном обозначении - Cut off.

В соответствии с этим определением все образцы панелей сывороток должны иметь в ИФА значение ОП>ОП_крит (положительные образцы) или меньше ОП_крит (отрицательные образцы).

При изготовлении кандидатов в положительные образцы низкотитражной стандартной панели разработчик подбирает коэффициенты разведения нативных сывороток такими, чтобы в ИФА ОП разведенных сывороток превышало ОП_крит в 1,5-2,0 раза.

Аналогично при выборе кандидатов в отрицательные образцы панели разработчик подбирает сыворотки с ОП<ОП_крит.

Вычисляют ОП_крит по формуле, приведенной в Инструкции по применению используемой тест-системы.

Всего таким образом подготавливают 120 образцов для положительной части панели.

4. Приготовление отрицательных образцов панели.

Для изготовления отрицательных образцов панели используют нативные сыворотки здоровых доноров, привитых и лиц из групп риска, стабилизированных и фильтрованных через 0,45 мкм. В состав МП включены 100 отрицательных сывороток (№201-301).

Очистка образцов панели фильтрацией.

Тонкую очистку образцов проводят в ламинарном боксе путем фильтрации с помощью одноразовых шприцов емкостью 10 мл и одноразовых шприцевых насадок Minisart с размером пор мембраны 0,8 и 0,45 мкм. Сыворотки каждого номера после фильтрации помещают в стерильный стеклянный флакон емкостью 150 см³ и укупоривают пробкой.

Розлив образцов панели во флаконы для лиофильного высушивания.

Из боксов в кассеты укладывают 350 флаконов вместимостью 2-3 см³. Кассеты помещают в ламинар-бокс, в котором производят розлив дозатором (Diluter model 203, Beckman, USA) сывороток во флаконы. Загрузочную емкость с сывороткой №1 помещают в ледяную баню и перемешивают сыворотку в процессе розлива. На шкале дозатора устанавливают объем дозы 0,8 мл. Далее сыворотку разливают во флаконы, помещенные в кассеты с надписью "сыворотка №1". После опорожнения загрузочной емкости дозатор и загрузочную емкость промывают от остатков сыворотки №1 и стерилизуют. В промытую стерильную загрузочную емкость загружают сыворотку №2 и начинают розлив во флаконы, помещенные кассеты с надписью "сыворотка №2". Таким образом разливают все 200 сывороток панели, предназначенные для одновременного лиофильного высушивания на установке. Флаконы с разлитой сывороткой прикрывают плотно резиновыми пробками для того, чтобы ограничить доступ воздуха во флаконы.

В кассету с флаконами помещают бирку, в которой указывают:

наименование препарата, объем раствора во флаконе, номер сыворотки, общее количество флаконов, дату, фамилию и роспись аппаратчика, производившего розлив. Кассеты с флаконами передают на стадию лиофилизации.

Лиофильное высушивание образцов панели.

Лиофильное высушивание образцов проводят на установке TG-50 (Германия). Включают компрессор установки для охлаждения конденсатора и полок сушильной камеры. Устанавливают на задатчике температуры полок температуру -35°С. По истечении 2,0-2,5 ч, при достижении температуры конденсатора минус (75-80)°С, а температуры полок минус (35)°С, в установку загружают кассеты с флаконами с растворами сывороток. Время загрузки кассет с флаконами в сушильную камеру должно быть минимальным и не должно превышать 10-15 минут.

На каждую полку помещают по флакону с сывороткой с погруженным в нее датчиком измерения температуры. Дверь камеры установки закрывают и закручивают запорные винты. Замораживание проводят в течение 8 ч. Температура в процессе замораживания поддерживается автоматически и контролируется аппаратчиком через каждый час с внесением данных температуры в журнал. По истечении времени процесса замораживания проводят стадию лиофильной сушки.

Управление температурным режимом сублимации производят вручную, задавая необходимую температуру полок с помощью регулятора температуры.

Заданная температура на всем протяжении сушки поддерживается автоматически с погрешностью 3-5°С. Значения температуры полки и температуры материала, а также температуры конденсатора записываются постоянно самописцем и периодически регистрируются аппаратчиком в журнале сушки 1 раз в час. Вакуум в камере контролирует по вакуумметру.

Через 8 ч после начала заморозки включают вакуум-насос установки. Температура материала в момент включения вакуум-насоса не должна превышать минус 30°С. Через четыре часа после того, как давление остаточного воздуха в камере достигнет значения 20 Па, включают нагрев полок и устанавливают на задатчике температуры полок температуру 0°С.

Через восемь часов после этого устанавливают задатчиком температуру полок плюс 10°С. Через два часа после достижения на полках температуры 10°С устанавливают задатчиком температуры полок температуру 25°С. Материал выдерживают при этой температуре 6-8 ч.

Контроль окончания процесса сушки осуществляют по показаниям датчика остаточного давления. При достижении в камере остаточного давления менее 20 Па процесс сушки считается законченным. Общая продолжительность сушки 32 ч.

Укупорка флаконов под вакуумом.

Укупорка флаконов производится внутри камеры лиофильной установки с помощью прижимных плит. По окончании процесса сушки прижимные плиты опускают с помощью гидравлического устройства вручную. Процесс укупорки контролируют визуально через смотровое окно двери камеры сушки. После звукового сигнала процесс опускания прижимных плит прекращают и поднимают прижимные плиты в исходное положение. Уравнивают давление в камере с атмосферным и открывают дверь сушильной камеры установки. Флаконы с сыворотками передают на операцию обжима флаконов колпачками.

Аттестация образцов панели, содержащих и не содержащих HBsAg.

По завершении получения лиофилизированных сывороток (200 образцов), предназначенных для формирования панели, изготовитель передает 2 набора панелей в ГИСК им Л.А.Тарасовича для государственных испытаний. Вместе с наборами изготовитель передает собственные результаты испытаний специфических и физико-химических свойств сывороток панели, а также данные изучения стабильности сывороток при различных температурных режимах.

Описание фигур

Фиг.1. Кривые титрования образцов панели в разводящем растворе.

Далее следуют примеры конкретного применения мастер-панели.

Пример 1. Получение панели.

1. Заготовка образцов плазмы инфицированных лиц с диагнозом гепатит В и здоровых доноров выполнялась в 7-ми удаленных регионах России. Образцы кодируются по городам:

Краснодар - 1

Нижний Новгород - 2

Горно-Алтайск - 3

С.Петербург - 4

Новосибирск - 5

Хабаровск - 6

Барнаул - 7.

Заготовку плазмы проводят методом плазмафореза с письменного согласия пациента.

2. Образцы плазмы кодируют, аттестуют по 10 показателям (табл.1), разливают во флаконы по 25 мл и переносят в специализированное хранилище. Плазму хранят до использования при -35°С.

3. По литературным прописям [10] плазму переводят в сыворотку, инактивируют и аттестуют в PCR и ИФА для приготовления анти-HCV панели.

4. По результатам 3-й аттестации образцы позитивных сывороток используют для формирования положительной части панели.

В блок 1 включают сыворотки, которые генотипируют и субтипируют и уверенно идентифицируют в ИФА по наличию 2-полос в иммуноблоте или «Спектре» [9], одна из которых обязательно анти-К85. Всего набирают 26 образцов (Таблица 1).

В блок 2 включают сыворотки, положительные или отрицательные в ПЦР, но имеющие повышенное содержание аминотрансфераз. В блок 2 включают сыворотки, которые уверенно идентифицируют в ИФА по наличию 2-полос в иммуноблоте или «Спектре», одна из которых обязательно анти-М84. Набирают 25 образцов (Таблица 2).

В блок 3 включают сыворотки, положительные или отрицательные в ПЦР, но имеющие повышенное содержание аминотрансфераз. В блок 3 включают сыворотки, которые уверенно идентифицируют в ИФА по наличию 2-полос в иммуноблоте или «Спектре», одна из которых обязательно анти-М84. Набирают 25 образцов (Таблица 4).

В блок 4 включают сыворотки, положительные или отрицательные в ПЦР, но имеющие повышенное содержание аминотрансфераз. В блок 4 включают сыворотки, которые уверенно идентифицируют в ИФА по наличию 2-полос в иммуноблоте или «Спектре», одна из которых обязательно анти-Core. Набирают 25 образцов.

Для включения в панель сыворотки каждого блока калибруют по результатам титрования образцов плазмы относительно каждого антигена: Core, NS3, NS4 и NS5. Высокотитражные образцы разводят в диапазоне от 5 до 1,5 ОП_крит. В качестве разводящего раствора используют пул отрицательных сывороток, стабилизированных введением ЭДТА, гентамицина и мертиолята в качестве бактериостатика (РР).

Пример 2. Применение панели для контроля качества иммуноферментных тест-систем для выявления анти-HCV антител.

Для сертификации тест-системы для выявления анти-HCV используют определенный набор образцов панели в соответствии с целью испытаний:

Испытания активности антигенов тест-системы. Используют набор образцов из 4-х блоков и несколько отрицательных образцов.

Испытания чувствительности тест-системы. Используют набор образцов с самым низким уровнем анти-HCV и несколько отрицательных образцов.

Испытания специфичности тест-системы. Используют набор образцов отрицательной части панели, не менее 90 штук.

В каждый флакон с лиофильно высушенной сывороткой панели вносят по 300 мкл дистиллированной воды. Содержимое флакона тщательно перемешивают до полного растворения сыворотки. Сыворотки выдерживают при комнатной температуре в течение 15 минут. Далее ИФА ставят в соответствии с Инструкцией по применению на аттестуемую тест-систему.

Учет результатов по образцам сывороток панели следует проводить только в том случае, если величины ОП контроля коньюгата, положительного (К+) и отрицательного (К-) контролей набора укладываются в пределы, регламентированные фармакопейной статьей на испытуемую тест-систему.

Социально-экономическая эффективность

1. Выявление инфекции гепатита С на более ранней стадии ускоряет излечение пациента и сокращает нетрудоспособный период пациента.

2. Использование панели значительно повышает уровень оценки качества лицензируемых тест-систем.

3. Национальная панель позволяет унифицировать процедуру лицензирования различных тест-систем, поступающих на российский рынок, и является юридической основой для государственного контроля.

4. Практическое значение имеет создание национальной панели сывороток для оценки качества иммуноферментных тест-систем по основным показателям: чувствительности к различным генотипам ВГС и к различным антигенам - процент выявляемое™ позитивных сывороток панели; специфичности - процент выявляемое™ отрицательных сывороток, и сроку годности - длительность времени сохранения неизменными специфических характеристик образцов панели, хранившейся при температуре (2-8)°С; разработать методику применения национальной панели сывороток для выполнения аттестационных испытаний качества тест-систем скриннинговых и подтверждающих для выявления антител к ВГС.

Источники информации

1. WHO Working Group on Reference Preparations for testing Diagnostic Kits used for detection of HBsAg, Anti-HCV and Anti-HIV antibodies in blood screening // Report of the third meeting: Geneva, Switzerland, 3-6 October 2003.

2. The principles for production and approval of international and other standards and reference biological preparations // WHO Expert Committee on Biological Standardization. Rep.37, WHO, Geneva, 1990.

3. WHO Working Group on Reference Preparations for testing Diagnostic Kits used for detection of HBsAg, Anti-HCV and Anti-HIV antibodies in blood screening // Report of the third meeting: Geneva, Switzerland, 17-19 January 2000.

4. Канев А.Н., Шалунова Н.В., Нетесов С.В и др. Разработка референс панелей ВГС с нормированным уровнем IgG антител // Вопросы вирусологии 2000, 45(4), 42-47.

5. Патент РФ №2314540 «Мастер панели сывороток, содержащих и не содержащих HBsAg, и способ ее получения».

6. Информационный бюллетень фирмы Boston Biomedica, Inc., Anti-HCV Low Titer Performance Panel. PHV 106. BBI Diagnostics. A Sera Care Company. 02.2006.

7. Потапова А.А., Богуш П.Г., Редченко Е.Б., Дронова В.М. Способы оптимизации внутрилабораторного контроля качества при массовом скриннинговом исследовании на антитела к вирусу гепатита С // Клин. Лабор. Диагностика 2008, 3, 35-38.

8. Alter MJ, Kuhnert WL, Finelli L. Guidelines for laboratory testing and result reporting antibody to hepatitis С virus. Centers for Disease Control and Prevention. MMWR Recomm Rep 2003, 52: 1013, 15.

9. Development of Control Serum for Microbial Antibody Tests // Biologicals (2001) 29, 39-43.

Постановки панели 1 высушенной

1. Вектор анти-ВГС от 02.06.09

2. Бест анти-ВГС - Спектр с.1838 от 05.06.09

3. ВГС - ДСМ скрин, с.31 от 17.09.09

Изобретение относится к области медицины, а именно биотехнологии и иммунологии, и может быть использовано в технологии изготовления панелей сывороток, содержащих антитела к вирусам гепатита С разных субтипов. Положительная часть панели включает образцы плазмы пациентов, положительных на РНК ВГС, и формируется в виде 4-х блоков, содержащих антитела к NS5, NS4, NS3 и к Core антигенам соответственно. Отрицательная часть панели включает образцы плазмы доноров, не содержащих антитела к ВИЧ-1/2, ВГВ, ВГС, сифилису, HBsAg, а также из групп риска, не инфицированных HCV, с дополнительным включением гетерофильных сывороток с ревматоидным фактором (RF) и с аутоиммунными антителами для строгого контроля специфичности. 4 з.п. ф-лы, 5 табл., 1 ил.

1. Панель сывороток, содержащая и не содержащая антитела к антигенам HCV различных субтипов, включающая положительную часть и отрицательную часть, отличающаяся тем, что положительная часть панели содержит образцы плазмы или сыворотки пациентов и состоит из первого блока, включающего сыворотки различных субтипов HCV 1a, 1b, 2а и 3а, содержащих антитела к NS5 антигену; второго блока, включающего положительно аттестованные сыворотки, содержащие анти-NS4, разведенные до средних и низких концентраций в диапазоне от 1,5 до 5,0 ОП_крит, третьего блока, включающего сыворотки со значениями ОП, близкими или ниже ОП_крит, положительные в ПЦР или имеющие высокие уровни аминотрансфераз, содержащие anti-NS3 антитела, и четвертого блока, содержащего анти -Core антитела, отрицательная часть панели включает образцы плазмы доноров и лиц из групп риска.

2. Панель сывороток по п.1, отличающаяся тем, что в качестве основы для приготовления образцов мастер-панели используют разводящие сыворотки, получаемые из стабилизированного пула сывороток с рН 6,8-7,2,

3. Панель сывороток по п.2, отличающаяся тем, что стабилизированный пул сывороток получают из нативных сывороток крови не менее чем от 10 доноров, не содержащих маркеры вирусных инфекций.

4. Панель сывороток по пп.1-3, отличающаяся тем, что для получения положительных образцов панели берут образцы сывороток с установленным генотипом и субтипом и положительные в ИФА, которые формируют блоки 1-4 по виду антител.

5. Панель сывороток по п.1, отличающаяся тем, что сыворотки второго блока разводят в основе до концентрации от 1,5 до 5,0 ОП_крит.