СПОСОБ ПРОФИЛАКТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЯ, ВЫЗВАННОГО ВИРУСОМ ГРИППА ПТИЦ А/Н5N1 Российский патент 2010 года по МПК A61K38/21 A61P31/16 

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, иммунологии, фармакологии, и касается способов профилактики вирусных заболеваний, в частности вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, препаратом на основе альфа-2 интерферона человека в липосомальной форме, обладающего противовирусным действием.

Актуальность разработки заявляемого способа. Новые эпидемичные штаммы вируса гриппа типа А возникают каждые 1-2 года в результате точечных мутаций в двух поверхностных белках - гемагглютинине (НА) и нейраминидазе (NA). В декабре 2003 года и первом квартале 2004 года новый вариант субтипа H5N1 вируса гриппа типа А стал причиной заболевания у людей в 8 странах Юго-Восточной Азии. Во время вспышки во Вьетнаме и Таиланде тяжело заболели 34 человека, более чем в 60% случаев заболевания закончились смертельными исходами. В настоящее время заболевание среди людей, вызванное вирусом гриппа птиц A/H5N1, зарегистрировано уже в 15 странах, и общее количество заболевших, по данным ВОЗ, на 19 июля 2008 года составило 385 человек, 243 из них (63%) скончались. Многие эксперты считают, что некоторые варианты вируса гриппа птиц А/H5N1 могут стать пандемичными, и одной из приоритетных задач здравоохранения в настоящее время является разработка эффективных профилактических и лечебных препаратов против заболевания, вызванного вирусом гриппа A/H5N1.

Известно использование препаратов типа амантадина и ремантадина в качестве профилактических и лечебных средств, которые обладают низкой противовирусной активностью в отношении штаммов вируса гриппа птиц [Watts J. Asian nations step up action to curb spread of avian influenza. Lancet, 2004; 363(9406): 373]. Это связано с мутациями в гене, кодирующим белок М2, которые делают вирус устойчивым к этому классу соединений [Li K.S., Guan Y., Wang J., Smith G.J.D., Xu K.M., Duan L., Rahardjo A.P., Puthavathana P., Buranathai C., Nguyen T.D., Estoepangestle A.T.S., Chaisingh A., Auewarakul P., Long H.T., Hanh N.T.H., Webby R.J, Poon L.L.M, Chen H., Shortridge K.F., Yuen K.Y., Webster R.G., Peiris J.S.M. Genesis of a highly pathogenic and potentially pandemic H5N1 influenza virus in eastern Asia. Nature, 2004; 430(6996): 209-213], эти мутации возникают примерно в 30% случаев.

Разработан новый противогриппозный препарат Тамифлю (озельтамивир фосфат, oseltamivir), являющийся ингибитором нейраминидазы вирусов гриппа субтипов А и В, который, соединяясь с гидрофобным участком активного участка нейраминидазы вируса гриппа, блокирует способность последнего отщеплять остатки сиаловой кислоты с поверхности инфицированной клетки, тем самым подавляя выход из нее новых сформировавшихся вирионов.

Однако в литературе опубликованы данные о том, что вирус гриппа, вызвавший инфекцию у детей, которых лечили озельтамивиром, может приобретать устойчивость к этому препарату [Kiso M., Mitamura К., Sakai-Tagawa Y., Shiraishi К., Kawakami С., Kimura К., Hayden F.G., Sugaya N., Kawaoka Y. Resistant influenza A viruses in children treated with oseltamivir: descriptive study. Lancet 2004; 364(9436): 759-765], и дальнейшее его применение может оказаться менее эффективным. Кроме того, есть данные уже о появлении штаммов вируса гриппа субтипа H5N1, устойчивых к действию озельтамивира.

Известен способ повышения резистентности организма при вирусных инфекциях путем введения в организм сублингвально гранул, содержащих по 2000 ME реаферона, которые применялись по следующей схеме: 5 гранул (10000 ME) 1 раз в день утром за 30 минут до еды в течение 10 дней. Препарат предлагается использовать для повышения резистентности к инфицированию вирусами и другими инфекционными агентами: вирусы гриппа, парагриппа, аденовирусы, простого герпеса, Эпштейна-Бара, короновирусы, энтеровирусы, риновирусы, респираторно-синтициальный вирус, а также хламидии, микоплазмы. (Патент РФ 2191594, МПК А61К 38/21, опубл. 27.10.02).

Однако указанный препарат имеет следующие недостатки: сублингвальные гранулы содержат рекомбинантный человеческий ИФНα2а в дозе от 2000 до 4000 МЕ /гранулу, по этой причине, как указано в патенте, даже для профилактики заболевания необходимо единомоментно использовать до 5 гранул и для достижения эффекта принимать их 1-3 раза в день. Данные об эффективности сублингвальных гранул, содержащих низкие дозы рекомбинантного человеческого ИФНα2а, при использовании для лечения заболевания отсутствуют. Кроме этого препарат проявляет заявляемый эффект при совместном использовании с иммуномодуляторами ридостин, ларифан, полудан, амиксин, циклоферон, кагоцел, неовир, дибазол, курантил и др. Кроме того, нет сведений о профилактическом действии препарата в отношении заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц А/Н5Н1.

Известен препарат Реаферон-ЕС-липинт, который производит российская фармацевтическая компания ЗАО «Вектор-Медика» на основе лицензионного договора на передачу прав (по патенту РФ №2123328, МПК А61К 38/21, опубл. 20.12.98) с ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора. Известно, что указанный препарат рекомендован для профилактики гриппа и ОРЗ в дозе 0,5 млн. ME один раз в сутки 2 раза в неделю в течение 1 месяца, а при терапии гриппа и ОРЗ препарат назначают по 0,5 млн. ME ежедневно 2 раза в сутки в течение 3 дней.

Однако для профилактики и лечения заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, такая схема препарата не дает надежного эффекта и требует разработки иной схемы применения данного липосомального препарата (Оlson F., Hunt C.A. Preparation of liposomes of defined size distribution by extrusion through policarbonate membranes. Biohim. et Biophys. Acta. 1979, 557: 9-23).

Наиболее близким способом профилактики и лечения вирусных заболеваний (прототип) является природный человеческий α-интерферон, который используется для лечения тяжелого острого респираторного синдрома (ТОРС) и гриппа птиц, в частности заболеваний, вызванных штаммом A/Duck/MN/1525/81 (H5N1). Для профилактики и лечения этих заболеваний препарат природного α-интерферона предлагают вводить в организм совместно с рибавирином и дсРНК перорально или сублингвально, или субконъюктивально в дозе 3 ME на фунт веса (Заявка США №20060035859, МПК А61К 48/00, опубл. 16.02.06).

Однако проведение противогриппозных лечебно-профилактических мероприятий с использованием данного природного препарата требует больших затрат: стоимость его ежедневной лечебной дозы в 3-8 раз выше стоимости ежедневной лечебной дозы рекомбинантного интерферона. Кроме того, противовирусные свойства препарата исследовались, в частности при использовании вируса гриппа птиц H5N1 только на культурах клеток животных Vero или MDCK, что недостаточно для обоснования возможности использования этого препарата для животных и людей при гриппе птиц.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание более дешевого и надежного способа профилактики заболеваний, вызванных вирусом гриппа птиц A/H5N1, путем применения препарата на основе рекомбинантного альфа-2 интерферона человека в липосомальной форме.

Указанный технический результат достигается тем, что в способе профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц A/H5N1, включающем введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека, согласно изобретению в качестве препарата альфа-2 интерферона человека используют Реаферон ЕС - липинт, полученный включением рекомбинантного альфа-2 интерферона в липосомы, который вводят в организм сублингвально или перорально при профилактике заболевания в дозе не менее 5000-10000 МЕ/кг веса один раз в сутки через 2 дня в течение 6 дней, затем в той же дозе один раз в сутки через 3-4 дня в течение не более 3 недель, а при экстренной профилактике - в дозе 10000-20000 МЕ/кг ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов в течение 6 дней.

Взрослым и детям старше 15 лет для профилактики заболевания препарат назначают за 30 мин до еды в дозе 10000 МЕ/кг, а детям с 3 до 15 лет - в дозе 5000 МЕ/кг и экстренной профилактике - по 10000 МЕ/кг..

Характеристика липосомального препарата, используемого в заявляемом способе. Препарат Реаферон ЕС - липинт представляет собой липосомальную форму рекомбинантного альфа-2 интерферона при следующем количественном соотношении компонентов, мг/мл:

фосфатидилхолин 80-100; холестерин 12-20.

Кроме этого в препарат добавляют витамин Е, и, таким образом, в конечный состав препарата входят интерферон альфа-2 человеческий рекомбинантный (250000, 500000 или 1000000 ME) и вспомогательные вещества: натрия хлорид - 8,01 мг, натрия гидрофосфата додекагидрат - 4,52 мг, натрия дигидрофосфата дигидрат - 0,56 мг, лецитин или липоид С100 - 41,18 мг, холестерин - 4,53 мг, витамин Е - 0,56 мг, лактоза - 91,34 мг.

Пример 1. Способ профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц A/H5N1

Препарат Реаферон ЕС - липинт вводят в организм за 30 мин до еды детям с 3 до 15 лет перорально с целью профилактики заболевания в дозе 5000 МЕ/кг веса один раз в сутки через 2 дня в течение 6 дней, а затем в той же дозе один раз в сутки через 3 дня в течение не более 3 недель.

Препарат Реаферон ЕС - липинт вводят за 30 минут до еды в организм взрослым и детям старше 15 лет сублингвально с целью профилактики заболевания в дозе 10000 МЕ/кг веса один раз в сутки через 2 дня в течение 6 дней, а затем в той же дозе один раз в сутки через 4 дня в течение не более 3 недель.

Пример 2. Способ экстренной профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц A/H5N1

Препарат Реаферон ЕС - липинт вводят в организм детей с 3 до 15 лет за 30 мин до еды перорально при экстренной профилактике заболевания (начиная не более чем через 3 часа с момента предполагаемого заражения) в дозе 10000 МЕ/кг веса ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов в течение 6 дней. Препарат Реаферон ЕС - липинт вводят в организм взрослых и детей старше 15 лет за 30 мин до еды перорально при экстренной профилактике заболевания в дозе 20000 МЕ/кг веса ежедневно 2 раза в сутки через 12 часов в течение 6 дней.

Пример 3. Изучение эффективности профилактического и экстренно-профилактического действий препарата Реаферон ЕС - липинт при пероральном применении у мышей, инфицированных вирусом гриппа A/H5N1 в дозах 10 ЛД₅₀ и 5 ЛД₅₀

Для моделирования инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц A/H5N1, на мышах в экспериментах по изучению противогриппозной активности препарата Реаферон ЕС - липинт был использован штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц A/H5N1 [Заявка на патент №2008106698 от 20.02.08]. Биоконцентрация данного вирусного штамма составляла 8,7±0,3 lg 50%-x эмбриональных инфицирующих доз в 1 мл (ЭИД₅₀/мл). Вируссодержащий материал хранили при температуре минус 70°С.

Препарат Реаферон ЕС - липинт был использован по профилактической, экстренно-профилактической и лечебной схемам применения. В исследованиях использовали интактных беспородных разнополых белых мышей ICR массой 14-16 г, полученных из питомника ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора.

Обоснование выбора оптимальной дозы препарата Реаферон ЕС - липинт для проведения испытания его противовирусной активности на мышах. Рекомендованная лечебная доза препарата Реаферон ЕС - липинт для человека составляет 1 млн ед. У человека усредненного роста 160 см и усредненного веса (m) 60000 г поверхность тела (S) составляет 16000 см² коэффициент S/m=0,27. В тоже время у мыши с длиной тела 5 см и весом (m) 15 г, S=18-20 см², просчитанный коэффициент S/m=1,2. Исходя из того, что коэффициент S/m у мышей выше, чем у человека в 4 раза, можно сделать заключение, что интенсивность обмена веществ и скорость метаболизма введенного вещества у мыши в 4 раза выше, чем у человека. По этой причине доза препарата, вводимая мыши, на единицу веса должна быть в 4 раза больше, чем у человека.

Закон зависимости обмена веществ от массы тела отражает тенденцию к установлению соответствия между теплопродукцией и интенсивностью теплоотдачи в окружающее пространство. Потеря тепла на единицу массы тела оказывается тем больше, чем больше соотношение между поверхностью и объемом тела, при этом последнее соотношение уменьшается с увеличением размера тела. Кроме того, у мелких животных изолирующий слой тела более тонкий: интенсивность метаболизма у мыши на 1 г массы тела больше, чем у человека.

Исходя из соображений, что оптимальная доза Реаферон ЕС - липинт для человека со средней массой тела 60 кг составляет 16700 ед./кг массы, оптимальная доза для мыши (средняя масса тела 15 г) составит, с учетом рекомендуемого увеличения дозы в 4 раза, приблизительно 1000 ед./мышь.

При изучении профилактического действия препарата Реаферон ЕС - липинт первой опытной группе мышей (20 голов) до заражения (д/з) вирусом гриппа ежедневно 2 раза в сутки в течение 4 дней и за 1 час д/з перорально вводили препарат в дозе 1000 ед. в объеме 0,2 мл.

При изучении экстренно-профилактического действия препарата Реаферон ЕС - липинт второй опытной группе мышей (20 голов) сразу после заражения (п/з) вирусом гриппа и через 4 часа п/з, а далее ежедневно 2 раза в сутки в течение 6 дней перорально вводили препарат в дозе 1000 ед. в объеме 0,2 мл.

При изучении лечебного действия препарата Реаферон ЕС - липинт третьей опытной группе мышей (20 голов) через 3 суток п/з вирусом гриппа и далее ежедневно в течение 6 дней дважды в сутки перорально вводили препарат в дозе 1000 ед. в объеме 0,2 мл.

Четвертой группе животных, являющейся положительным контролем (20 голов), за 1 час д/з вирусом гриппа и через 4 часа п/з, а далее дважды в течение 6 суток вводили перорально препарат Тамифлю в дозе 0,1 мг в объеме 0,2 мл.

Пятой группе животных, являющейся отрицательным контролем (20 голов), за 4 суток д/з вирусом гриппа и в течение 10 суток п/з вводили перорально 2 раза в сутки дистиллированную воду в объеме 0,2 мл.

Инфицированных мышей наблюдали ежедневно в течение 15 суток п/з, отмечая количество погибших и живых мышей. Данные по гибели животных использовали для оценки параметров средней продолжительности жизни (СПЖ) и процента выживших животных. Для определения СПЖ оценивали среднее значение времени гибели мышей с момента заражения среди павших мышей в каждой из пяти групп. Для определения % выживших мышей использовали формулу:

% выживших животных=(количество выживших мышей/общее количество мышей в группе)×100%.

Для определения коэффициента защиты (КЗ) использовали формулу:

КЗ (в %)=% выживших животных в опытной группе или положительном контроле - % выживших животных в отрицательном контрольной группе.

Результаты изучения эффективности противовирусного действия препарата Реаферон ЕС - липинт при использовании различных схем применения у мышей, интраназально инфицированных штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вируса гриппа в дозе 10 ЛД₅₀, представлены в таблице 1.

Таблица 1 - Эффективность противовирусного действия различных схем применения препарата Реаферон ЕС - липинт у мышей, интраназально инфицированных штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вирусом гриппа в дозе 10 ЛД₅₀ Схема применения препарата Кол-во животных в эксперименте СПЖ, (сут) % выживших животных Уровень значимости для выживаемости (р и рY) Коэффициент защиты (%) Профилактическая 20 9,3±1,7 45 р=0,013
pY=0,034 35 Экстренно-профилактическая 20 8,7±1,3 30 р=0,113
pY=0,236 20 Положительный контроль (Тамифлю) 20 8,5±1,6 65 р=0,001
pY=0,000 55 Отрицательный контроль (физ. р-р) 20 8,3±1,1 10 - - Примечание: СПЖ - средняя продолжительность жизни среди погибших животных; р - уровень значимости при сравнении относительных частот (мертвые, выжившие животные); pY - уровень значимости при сравнении относительных частот с поправкой Йетса.

Экспериментально установлено, что только при использовании профилактической схемы применения препарата Реаферон ЕС - липинт у мышей, интраназально инфицированных дозой 10 ЛД₅₀ штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вируса гриппа птиц, наблюдается достоверное увеличение выживаемости животных по сравнению с отрицательным контролем (КЗ=35%). При этом значимых отличий между результатами исследований, полученными при профилактическом введении препарата и в положительном контроле, обнаружено не было (р=0,20). Кроме того, профилактическое использование Реаферона ЕС - липинта создавало тенденцию к увеличению СПЖ по сравнению с таковой в отрицательном контроле. При применении препарата по схеме экстренной профилактики наблюдалась тенденция к увеличению выживаемости животных (КЗ=20%).

Результаты изучения эффективности противовирусного действия препарата Реаферон ЕС - липинт при использовании различных схем применения у мышей, интраназально инфицированных штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вируса гриппа в дозе 5 ЛД₅₀, представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Эффективность противовирусного действия различных схем применения препарата Реаферон ЕС - липинт у мышей, интраназально инфицированных штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вирусом гриппа в дозе 5 ЛД₅₀ Схема применения препарата Кол-во животных в эксперименте СПЖ, (сут) % выживших животных Уровень значимости для выживаемости (р и pY) Коэффициент защиты(%) Профилактическая 20 9,6±1,3 65 р=0,004
pY=0,010 45 Экстренно-профилактическая 20 8,4±1,1 55 р=0,022
pY=0,050 35 Положительный контроль (Тамифлю) 20 8,8±1,5 65 р=0,000
pY=0,000 45 Отрицательный контроль (физ. р-р) 20 8,3±1,6 20 - - Примечание: СПЖ - средняя продолжительность жизни среди погибших животных; р - уровень значимости при сравнении относительных частот (мертвые, выжившие животные); pY - уровень значимости при сравнении относительных частот с поправкой Йетса.

Экспериментально установлено, что при использовании профилактической и экстренно-профилактической схем применения препарата Реаферон ЕС - липинт у мышей, интраназально инфицированных дозой 5 ЛД₅₀ штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 (H5N1) вируса гриппа птиц, наблюдается достоверное увеличение выживаемости животных по сравнению с отрицательным контролем (КЗ=45 и 35% соответственно). Причем по своему профилактическому действию, оценивая показатель выживаемости, данный препарат проявил себя аналогично тому, как это наблюдалось в положительном контроле, в качестве которого был использован Тамифлю. Кроме того, профилактическое использование Реаферона ЕС - липинта создавало тенденцию к увеличению СПЖ по сравнению с таковой в отрицательном контроле. При применении препарата по лечебной схеме наблюдалась тенденция к увеличению выживаемости животных (КЗ=15%).

Таким образом, препарат Реаферон ЕС - липинт пероральном применении обладает выраженным профилактическим противовирусным действием и защищает мышей от заражения летальными дозами вируса гриппа птиц A/H5N1.

Следует отметить, что при применении у людей препарата Реаферон ЕС - липинт, приготовленного на основе альфа-2 интерферона человеческого происхождения, профилактический противогриппозный эффект может быть более выраженным по сравнению с таковым в экспериментах на мышах. Это обусловлено, по крайней мере, 2 обстоятельствами: более высокой эффективностью взаимодействия гомологичного препарата с рецепторами клеток человека и отсутствием иммунного ответа в человеческом организме против гомологичного альфа-2 интерферона.

Изобретение относится к медицине, а именно к вирусологии, и может быть использовано для профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц А субтипа H5N1. Для этого сублингвально вводят препарат альфа-2 интерферона человека «Реаферон ЕС - Липинт» в дозе не менее 5000-10000 МЕ/кг веса. Введение осуществляют один раз в сутки через 2 дня в течение 6 дней, а затем в той же дозе один раз в сутки через 3-4 дня в течение не более 3-х недель. Изобретение раскрывает новый эффективный способ профилактики данного заболевания. 1 з.п.ф-лы, 2 табл.

1. Способ профилактики заболевания, вызванного вирусом гриппа птиц А субтипа H5N1, включающий введение в организм препарата альфа-2 интерферона человека, отличающийся тем, что в качестве препарата альфа-2 интерферона человека используют «Реаферон ЕС - Липинт», полученный включением рекомбинантного альфа-2 интерферона в липосомы, который вводят сублингвально в дозе не менее 5000-10 000 МЕ/кг веса один раз в сутки через 2 дня в течение 6 дней, а затем в той же дозе один раз в сутки через 3-4 дня в течение не более 3 недель.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что взрослым и детям старше 15 лет препарат вводят за 30 мин до еды в дозе 10 000 МЕ/кг, а детям с 3 до 15 лет при профилактике заболеваний препарат назначают в дозе 5000 МЕ/кг,