ШТАММ ВИРУСА ГРИППА ПТИЦ A/CHICKEN/KURGAN/05/2005 СУБТИП H5N1 ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛЕЧЕБНЫХ И ПРОФИЛАКТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ ПРОТИВ ВИРУСА ГРИППА Российский патент 2009 года по МПК C12N7/00 A61K39/145 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к получению нового штамма вируса гриппа, субтипа H5N1, для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа

Известен штамм A/duck/Novosibirsk/56/05 субтип H5N1 вируса гриппа птиц (аналог), выделенный на территории Западной Сибири, который используется для моделирования вирусной инфекции в научных экспериментах при изучении эффективности противовирусных препаратов на культурах клеток (Патент RU 2309983, МПК С12N 7/00, опубл. 27.05.2007 г.).

Однако указанный штамм имеет следующие недостатки: штамм имеет пониженную продуктивность при культивировании на клетках МДСК - максимальная концентрация вируса 6,5 lg ТЦД₅₀/мл. Штамм предназначен для производства профилактических и диагностических препаратов и, исходя из представленных данных о патогенности для культур клеток и отсутствия данных о патогенности для животных, в т.ч. мышей, может быть использован для оценки противовирусной активности различных соединений только на культуре клеток.

Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм А/БАК/РОССИЯ/05 (субтип H5N1) вируса гриппа птиц (Патент RU 2300564, МПК С12N 7/00, опубл. 10.06.2007 г.). Однако указанный штамм может быть использован только для получения антигена и создания вакцинных и диагностических препаратов. Данных о патогенных свойствах штамма для лабораторных животных, в т.ч. мышей, нет.

Техническим результатом предлагаемого изобретения является получение нового штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц (субтип H5N1) для моделирования инфекции, вызываемой вирусом гриппа птиц субтипа H5N1, на мышах в экспериментах по изучению активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин. Указанный технический результат достигается путем получения нового штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц (субтип H5N1) для использования в эксперименте по изучению специфической активности противовирусных (противогриппозных) препаратов и эффективности вакцин в экспериментах in vivo на модели беспородных (б/п) белых мышей.

Штамм высокопродуктивен: при культивировании на культуре клеток MDCK титры составляют 8,7±0,6 lg ТЦД₅₀/мл. Штамм вызывает заболевание с летальным исходом у мышей при аэрозольном, интраназальном, внутримозговом, внутримышечном заражении. Штамм высокопатогенен для мышей: при аэрозольном или интраназальном заражении (ЛД₅₀ для б/п мышей = 10-20 ЭИД₅₀/мышь) штамм вызывает у мышей заболевание, которое по клиническим признакам, патоморфологической картине и размножению вируса в органах-мишенях наиболее адекватно моделирует гриппозную инфекцию у птицы и человека.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 относится к вирусу гриппа птиц род Innuenzavirus А семейство Orthomyxoviridae. Заявляемый штамм выделен от больной курицы при вспышке заболевания среди птиц в г.Кургане. Штамм депонирован в коллекцию культур микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор») Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-349 (дата регистрации май 2005 г.).

Источник получения. Из клинического материала, полученного от погибшей птицы из частного хозяйства в Курганской области (трахея, гортань, легкое), был выделен изолят вируса гриппа птиц, который был назван A/Chicken/Kurgan/05/2005. Вирус был выделен при заражении гомогенатами органов погибшей курицы культуры клеток MDCK и куриных эмбрионов уже после первого пассажа. Штамм агглютинировал человеческие и куриные эритроциты: показатели гемагглютинирующей активности составляли 1:64-1:128 ГАЕ/0,2 мл (в культуре зараженных штаммом клеток MDCK). Инфекционная активность выделенного вируса составляла 7-8 lg ТЦД₅₀/0,2 мл в культуре клеток MDCK и 8-8,5 lg ЭИД₅₀/0,2 мл в куриных эмбрионах.

Подлинность штамма. Вирусная РНК была выделена из аллантоисной жидкости КЭ с помощью набора «РИБО-золь-А (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора) в соответствии с инструкцией производителя. Ревертазную реакцию проводили с использованием фермента M-MuLV (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора). Для построения кДНК и определения нуклеотидной последовательности амплификационных фрагментов были использованы олигонуклеотидные праймеры, предложенными E.Hoffmann et at. Archives of Virology, 2001. - 146:2275-2289.

Условия проведения ПЦР: 95°С - 2 мин, затем 94°С - 10 с, 58°С - 30 с, с понижением температуры на 1°С за цикл, 72°С - 1 мин 6 циклов, затем 94°С - 10 с, 52°С - 15 с, 72°С - 40 сек 35 циклов и затем 72°С - 7 мин.

ПЦР проводили в присутствии 0,2 mM каждого из дезоксинуклеозидгрифосфатов, 1,5 mM MgCl₂, 30 mM Трис-НСl (рН 8,5 при +25°С), 16 mM (NH₄)₂SO₄, 0,1% Nonidet P40 ("Sigma"), no 0,15 μM олигонуклеотидных праймеров и 1,5 U/30 μl Hot Start Taq ДНК полимеразы (ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора).

ПЦР фрагменты анализировали гель-электрофорезом в 2% агарозе и очищали для последующего определения нуклеотидной последовательности.

Определение нуклеотидной последовательности выделенных фрагментов проводили на приборе Beckman Coulter CEQ2000XL DNA Analysis System ("Beckman Coulter, Inc.") с использованием наборов "Beckman sequencing Kit". Полученные нуклеотидные последовательности и филогенетический анализ проводился с использованием прикладных программ VECTOR NTI 8.0 («InforMax») и Mega 2.1. Матрицу расстояний вычисляли по алгоритму Р-дистанции. Филогенетичекое дерево строили с использованием метода «ближайшего соседа» (neighbor-joining). Достоверность проверялась методом «бутстреп») (bootstrap), с 500 репликациями. Достоверным считали «бутстреп» индекс >75. Для построения филогенетических деревьев использовали нуклеотидные последовательности генов вируса гриппа А, депонированных в международной базе данных GenBank.

Все полученные первичные последовательности были депонированы в базу GenBank. Номера депонирования генов вируса гриппа штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 представлены в таблице 1.

ТАБЛИЦА 1.
Номера депонирования генов вируса гриппа штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 в международной базе данных GenBank Штамм вируса гриппа Ген вируса гриппа и номера депонирования в GenBank HA NA PB2 PB1 PA NP М NS A/chicken/
Kurgan/05/2005 DQ44
9632 DQ44
9634 DQ44
9639 DQ44
9638 DQ44
9637 DQ44
9635 DQ44
9633 DQ44
9636

Филогенетический анализ нуклеотидной последовательности генов показал принадлежность штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 к субтипу H5N1. Штамм наиболее близок к цинхайской группе субтипов H5N1 вируса гриппа.

Культуральные свойства. Штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 при культивировании на монослое клеток МДСК вызывает цитопатическое действие (ЦПД) на 2-4 сут (температура культивирования 37°С, в атмосфере 5% СО₂). Максимальные титры вируса регистрировали на 4-6 сутки после заражения монослоя клеток МДСК их величина составляла 7,7±0,6 lg ТЦД₅₀/мл.

Патогенность для человека. Штаммы вируса гриппа птиц субтипа H5N1 являются патогенными для человека: летальность для человека составляет около 60%.

Патогенность для птицы. Штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 относится к высокопатогенным вариантам вируса гриппа птиц: интравенозный индекс патогенности = 3.0.

Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствора желатина и сахарозы (САЖ). Лиофилизация с добавлением САЖ в соотношении 1:4 позволяет сохранить стабильную инфекционную активность вируса в течение 2-х и более лет при температуре хранения -70°С.

Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ×2АВК, среда 199, ДМЭМ, содержащие 2 мкг/мл трипсина, 2 ммоль/л глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и 100 МЕ/мл стрептомицина.

Пример 1. Изучение патогенных свойств штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005

Были сформированы стоки штаммов вируса гриппа птиц субтипа H5N1, выделенных на территории РФ, и в экспериментах in vivo были изучены патогенные свойства штаммов для беспородных белых мышей, кур и куриных эмбрионов (КЭ). Результаты экспериментов приведены в таблице 2.

ТАБЛИЦА 2.
Изучение патогенности штаммов вируса гриппа птиц в экспериментах in vivo Штамм вируса гриппа птиц Патагенные свойства (M±S_m) Для КЭ (lg ЭИД₅₀/мл) Для кур (ИВИИП*) Для б/п белых мышей ИД₅₀ (lg ЭИД₅₀/мл)и/н** ЛД₅₀ (lg ЭИД₅₀)и/н** ЛД₅₀ (lg ЭИД₅₀)в/м*** A/Chicken/Kurgan/05/2005 8,5±0,5 3,0 1,0±0,9 1,1±0,4 2,3±0,6 A/Chicken/Crimea/04/2005 8,8±0,5 3,0 н.о. 1,3±0,3 2,8±0,5 A/Chicken/Omsk/06 9,2±0,3 3,0 н.о. 2,2±0,4 н.о. A/Chicken/Dagestan/06 7,9±0,6 3,0 н.о. 2,7±0,6 н.о. A/Chicken/Krasnodar/02/06 7,5±0,5 3,0 н.о. 3,0±0,6 н.о. A/Duck/Kurgan/08/2005 9,0±0,3 н.о. н.о. 4,7±0,6 н.о. A/Turkey/Suzdalka/Nov-1/2005 8,2±0,3 2.7 н.о. 6,6±0,7 >8,0 A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 8,4±0,5 н.о. н.о. 6,7±0,7 >8,0 * - интравенозный индекс патогенности (Capua,et al.,Avian Pathol.1999,28(5):455-460)
** - при интраназальном заражении
*** - при внутримышечном заражении
н.о. - не определялось

Из результатов, приведенных в таблице 2 следует, что штамм A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц является наиболее патогененным для б/п белых мышей среди изученных штаммов вируса гриппа птиц субтипа H5N1, которые были выделены при вспышках заболевания на территории Российской Федерации.

Пример 2. Изучение клинических проявлений заболевания у б/п белых мышей при интраназальном заражении штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005

По результатам изучения патогенности для мышей были выбраны 3 штамма вируса гриппа птиц (H5N1): A/Chicken/ Kurgan/05/2005 - высокопатогенный штамм, A/Duck/Kurgan/08/2005 - обладает средней патогенностью и A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 - низкопатогенный (апатогенный) для мышей штамм.

Изучение патогенеза заболевания проводили на беспородных белых мышах весом 12-14 г при интраназальном заражении дозой 10 ЛД₅₀/мышь для штаммов A/Chicken/ Kurgan/05/2005 и A/Duck/Kurgan/08/2005, и дозой 6,0 lg ЭИД₅₀/мышь для штамма A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005. На 5-7 день после заражения у мышей, зараженных штаммами A/Chicken/Kurgan/05/2005 и A/Duck/Kurgan/08/2005, наблюдались следующая клиническая картина: признаки общей интоксикации (снижение активности, отказ от пищи и воды), выраженная дыхательная недостаточность. Смерть наступала на 7-8 сутки. У мышей, зараженных штаммом A/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005, клиническая картина заболевания либо отсутствовала либо была стерта.

При изучении гистоморфологической картины поражения легких мышей, интраназально зараженных штаммом A/Chicken/ Kurgan/05/2005 выявлены патологические изменения во всех компартментах легкого. Для воздухопроводящего компартмента характерно поражение эпителиальной выстилки бронхов с развитием дистрофически-некротических изменений эпителиоцитов и их десквамации. В респираторном отделе легкого происходит развитие дис- и ателектазов, появляются интраальвеолярные кровоизлияния, наблюдаются выраженные нарушения микроциркуляции. Для сосудистого компартмента характерно развитие дистонии сосудов, альтерация всех слоев сосудистой стенки, внутрисосудистое тромбообразование. В целом, выявленные изменения (десквамация эпителия бронхов, расстройства гемодинамики) аналогичны таковым при повреждении легких людей вирусом гриппа, однако при инфекции данным штаммом эти изменение сопровождаются развитием респираторного дистресс-синдрома (расстройства кровообращения принимают более выраженный характер, развиваются ателектазы и отек легкого, появляются признаки ДВС-синдрома, формируется бронхолегочная дисплазия). В периферической крови мышей наблюдается выраженная относительная лейкопения и патологические изменения эритроцитов.

Примечания к таблице 3:

¹ Синдром катарального воспаления включает в себя поражение слизистой оболочки верхних дыхательных путей, конъюнктивы глаз.

² Под респираторным синдромом понимаются дыхательные расстройства разной степени выраженности (трахеиты, бронхиты, вирусная пневмония, отек легких) с развитием дыхательной недостаточности или без нее.

³ Проявлениями общей интоксикации являются: повышение температуры тела, озноб, адинамия, анорексия, вегетативно-сосудистые расстройства, снижение массы тела у животных.

⁴ Геморрагический синдром чаще развивается при тяжелой или гипертоксической форме гриппа и может проявляться геморрагической экзантемой, кровоизлияниями в головной мозг и паренхиматозные органы, кровотечениями. Грубые нарушения в системе гемостаза ведут к таким осложнениям, как ДВС-синдром и токсический геморрагический отек легких.

⁵ Абдоминальный синдром: рвота, диарея, тошнота и боли в животе (у людей).

⁶ Неврологические расстройства включают в себя признаки нейротоксикоза (судороги, адинамия или возбуждение, угнетение сознания вполоть до развития комы); у людей появление неврологической симптоматики связывают с действием провоспалительных цитокинов и циркуляторными расстройствами, у животных возможно развитие нейроинфекции.

Пример 3. Использование штамма A/Chicken/Kurgan/05/2005 для проверки противовирусной активности препарата «Тамифлю» в экспериментах in vivo на модели мыши и курицы

Из литературных данных известно, что использование мыши в качестве модельного животного для проверки противовирусной активности препаратов при гриппозной инфекции широко распространено в научной практике (Droebner К., et al Antiviral. Res. 2007; 76(1): 1-10.; Serkedjieva J. et al. Antivir. Chem. Chemother. 2007; 18(2):75-82.; Yen H.L. et al. J. Virol. 2007; 81(22):12418-26). В перечисленных работах используются штаммы, полученные из Китая, Индонезии и т.д. Испытание препаратов и вакцин, проведенное на отечественных штаммах, позволит более адекватно оценить готовность учреждений Минзрдравсоцразвития и Минсельхоза к профилактике и ликвидации вспышек заболевания, вызванных вирусом гриппа птиц.

Мышей и кур инфицировали интраназально штаммом A/Chicken/Kurgan/05/2005 вируса гриппа птиц доза 1.0 ЛД₅₀/объект. При изучении лечебно-профилактического действия препарата Тамифлю первой опытной группе мышей (30 голов) ежедневно 2 раза в сутки (в день заражения ВГ и в течение 4 дней после заражения) интрагастрально вводили препарат в дозе 0,2 мг в объеме 0,2 мл на мышь. Контрольной группе животных (30 голов) по аналогичной схеме вводили дистиллированную воду. Результаты исследований представлены в таблице 4.

ТАБЛИЦА 4.
Лечебно-профилактическая активность препарата Тамифлю на модели гриппозной инфекции у мышей Препарат для лечения Противовирусный эффект птица породы White High Sех б/п белая мышь СПЖ (сут) коэффициент защиты (%) СПЖ (сут) коэффициент защиты (%) Тамифлю 4,2±1,0 34 9,3±1,0 48 Физ. р-р. 3,2±1,0 0 7,8±1,0 0

Примечание: СПЖ - средняя продолжительность жизни; данные СПЖ представлены в виде среднего значения±стандартное отклонение.

Таким образом, предлагаемый штамм вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 может быть успешно использован для изучения активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин против вируса гриппа птиц (субтип H5N1) на модели б/п белых мышей.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии. Штамма-продуцент вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 обладает высокой продуктивностью. Штамм депонирован в Коллекции микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером V-349. На основе штамма создана адекватная модель для изучения активности противовирусных препаратов и эффективности вакцин против вируса гриппа птиц (субтип H5N1) in vivo. Штамм вируса гриппа птиц может быть использован для изучения эффективности лечебных и профилактических препаратов против гриппа. 4 табл.

Штамм вируса гриппа птиц A/Chicken/Kurgan/05/2005 субтип H5N1 для изучения активности лечебных и профилактических препаратов против вируса гриппа на модели беспородных белых мышей, депонированный в Коллекции микроорганизмов Федерального государственного учреждения науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» Роспотребнадзора под регистрационным номером №V-349.