СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ КОМПОНЕНТА С9 КОМПЛЕМЕНТА ЧЕЛОВЕКА ПО КЛАССИЧЕСКОМУ ПУТИ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/573 C12Q1/68 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Способ определения функциональной активности компонента С9 до настоящего времени не описан.

Задачей заявленного изобретения является разработка способа и набора на основе иммуноферментного метода, позволяющего определять функциональную активность компонента С9 комплемента человека с использованием доступного и хорошо сохраняемого в обычных условиях коммерческого препарата для использования в качестве активатора классического пути комплемента.

Поставленная задача достигается путем разработки способа определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека по классическому пути и набора для его осуществления. Способ определения предусматривает сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината, представляющего собой дезоксирибонуклеат натрия, хорошо сохраняемого в обычных условиях, затем внесение в лунки микропланшета сыворотки морской свинки как источника всех активных компонентов комплемента и анализируемой пробы, содержащей компонент С9 с неизвестной активностью, и проведение инкубации для активации комплемента, в ходе которой происходит формирование и сорбция на поверхности лунок микропанели мембраноатакующего комплекса C5b6789, содержащего в своем составе, наряду с компонентом С9 морской свинки, активный компонент С9 человека в количествах, зависящих от концентрации функционально активного определяемого компонента С9 в анализируемой пробе. Количество связавшегося в результате активации комплемента компонента С9 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к С9 - фракции иммуноглобулинов G, конъюгированных с ферментом. Способ основан на способности функционально активного компонента С9 образовывать мембраноатакующий комплекс в результате активации комплемента. Тем самым достигается определение функциональной активности С9 иммуноферментным методом, пригодным для стандартизации.

Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и донорскую сыворотку крови в качестве стандарта.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения функциональной активности компонента С9 по классическому пути, обладающих хорошей воспроизводимостью результатов.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата компонента С9 по классическому пути. Растворяют аптечный препарат дерината в вероналовом буферном растворе, pH 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS²⁺), в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°C. Содержимое лунок выливают, трижды отмывают планшет тем же буфером, затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора VBS²⁺, содержащего препарат морской свинки в количествах, соответствующих 0,05 мкл сыворотки морской свинки, и анализируемую пробу, содержащую компонент С9 с неизвестной активностью. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20 (ЗФР-Т) и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента С9 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°C, отмывки ЗФР-Т и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера с ТМБ (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0 и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 5-10 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Функциональную активность препарата С9 рассчитывают по стандартной кривой (рис. 1).

Пример 2. Набор для определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат пероксидазы с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С9.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного компонента С9 с коэффициентом корреляции R²=0,998, что позволяет достоверно определять функциональную активность компонента С9 описанным способом с использованием описанного набора.

Изобретение относится к области медицины. Предложены способ и набор для определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека по классическому пути. Проводят сорбцию в лунках микропанели аптечного препарата дерината. Затем в лунки вносят анализируемую пробу, содержащую компонент С9 с неизвестной активностью и комплемент морской свинки. Проводят инкубацию и после отмывки и осушения планшета в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С9 комплемента человека и субстрат этого фермента. Проводят расчет активности компонента С9 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и стандарт с известной активностью С9. Изобретение позволяет определять компонент С9 с использованием препарата деринат в качестве активатора классического пути комплемента. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека по классическому пути, предусматривающий сорбцию в лунках микропанели для иммуноферментного анализа аптечного препарата деринат, внесение в лунки микропанели анализируемой пробы, содержащей компонент С9 комплемента человека с неизвестной активностью и препарат комплемента морской свинки, инкубацию и после осушения планшета и отмывки внесение в лунки конъюгата фермента с антителами против компонента С9 человека и субстрата этого фермента с последующим проведением расчета активности компонента С9 по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для определения функциональной активности компонента С9 комплемента человека, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным деринатом, конъюгат фермента с антителами к компоненту С9 комплемента человека, комплемент морской свинки, субстратный буфер и стандарт с известной активностью компонента С9.