СПОСОБ И НАБОР ДЛЯ ИММУНОФЕРМЕНТНОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ С1 ИНГИБИТОРА ПО СПОСОБНОСТИ СВЯЗЫВАТЬСЯ С ДЕРИНАТОМ Российский патент 2012 года по МПК G01N33/53 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения количества и (или) функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

С1 ингибитор системы комплемента в качестве ингибитора сериновых протеиназ участвует в регуляции многих ферментов плазмы крови, таких как С1r, С1s - компонентов классического пути комплемента, калликреина калликреин-кининовой системы, а также факторов свертывающей и противосвертывающей систем - XIa, XIIa, XIIf и плазмина (фибринолизина). Главная биологическая роль С1 ингибитора заключается в регуляции сосудистой проницаемости, о чем свидетельствует ангионевротические отеки, наблюдающиеся у больных с дефицитом этого белка [1]. Известно, что взаимодействие полианионов с С1 ингибитором может играть жизненно важную роль в механизме ускорения реакции взаимодействия С1s с С1 ингибитором [2]. Было предположено, что способность взаимодействовать с С1 ингибитором могут проявлять и такие полианионы как ДНК и эта особенность С1 ингибитора может быть положена в основу иммуноферментного способа его определения. Для количественного определения С1 ингибитора способность связываться с ДНК ранее не использовалась. В качестве ДНК оказалось удобным использовать аптечный препарат деринат.

Задачей заявленного изобретения является создание способа и набора для иммуноферментного определения С1 ингибитора по способности связываться с деринатом.

Поставленная задача достигается путем разработки способа иммуноферментного определения С1 ингибитора, который предусматривает связывание в лунках микропанели дерината, инкубацию в лунках образцов проб, содержащих определяемый С1 ингибитор человека, и определение связавшегося С1 ингибитора с помощью конъюгата антител против С1 ингибитора комплемента человека с ферментом и субстрата для этого фермента. Для фиксации в лунках микропанели дерината проводят сорбцию его аптечного препарата.

Набор содержит плоскодонную микропанель со связанным деринатом, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт для С1 ингибитора.

Техническим результатом заявленного изобретения является разработка способа и набора для иммуноферментного определения С 1 ингибитора комплемента человека по способности связываться с деринатом с использованием аптечного препарата дерината.

Пример 1. Определение С1 ингибитора по способности связываться с деринатом. Растворяют аптечный препарат дерината в фосфатном буфере, рН 7,4, содержащем 0,15 М NaCl, в концентрациях 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонной полистироловой 96-луночной микропанели. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4°С. Содержимое лунок выливают, трижды отмывают планшет ЗФР-ЭДТА (фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 10 мМ ЭДТА), затем осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки микропанели вносят анализируемые пробы, содержащие С1 ингибитор с неизвестной концентрацией. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, двукратной отмывки фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% Твин-20, и осушения микропанели в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против С1 ингибитора человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37°С, пятикратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (3,3',5,5'-тетраметилбензидин в 15 мл цитратно-фосфатного буфера, рН 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 15-30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 450 нм. Количество компонента С1 ингибитора рассчитывают по стандартной кривой (рис.1).

На рис.1 изображено определение С1 ингибитора по способности связываться с деринатом методом иммуноферментного анализа.

Пример 2. Набор для определения С1 ингибитора по способности связываться с деринатом. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом дерината, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной концентрацией С1 ингибитора человека. Данный набор используется в соответствии с примером 1.

Из приведенных на рисунке результатов следует, что измеряемая оптическая плотность линейно зависит от концентрации активного С1 ингибитора с коэффициентом корреляции R²=0,998, что позволяет достоверно определять С1 ингибитор в концентрациях от 1 нг/мл описанным способом с использованием описанного набора.

ЛИТЕРАТУРА

1. Davis A.E. III; Lu F., Mejia P. С1 inhibitor, a multi-functional serine pro-tease inhibitor. Thrombosis and Haemostasis. 2010. V.104. №5. P.1-8.

2. Murray-Rust T.A., Kerr F.K., Thomas A.R., Wu., Yongqing Т., Ong P.C., Quinsey N.S., Whisstock J.C., Wagenaar-Bos I.C., Freeman C., Pike R.N. Modulation of the proteolytic activity of the complement protease С1s by polyanions: implications for polyanion-mediated acceleration of interaction between С1s and SERPING1. Biochem J. 2009. V.422. P.295-303.

Изобетение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний. Сущность способа: аптечный препарат деринат сорбируют в лунках микропанели для иммуноферментного анализа, в лунки микропанели вносят раствор пробы, содержащий С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной концентрацией, и проводят инкубацию. После осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрат этого фермента. Затем проводят расчет содержания С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции. Набор содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом дерината, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер этого фермента и стандарт для С1 ингибитора. Практическое использование изобретения позволяет достоверно определять С1 ингибитор в концентрациях от 1 нг/мл. 2 н.п. ф-лы, 1 ил., 2 пр.

1. Способ для иммуноферментного определения С1 ингибитора по способности связываться с деринатом, характеризующийся тем, что аптечный препарат деринат сорбируют в лунках микропанели для иммуноферментного анализа, затем в лунки микропанели вносят раствор анализируемой пробы, содержащий С1 ингибитор комплемента человека с неизвестной концентрацией, проводят инкубацию и после осушения планшета и отмывки в лунки вносят конъюгат фермента с антителами против С1 ингибитора и субстрат этого фермента, после чего проводят расчет содержания С1 ингибитора по количеству образовавшегося продукта ферментативной реакции.

2. Набор для иммуноферментного определения С1 ингибитора по способности связываться с деринатом, характеризующийся тем, что он содержит плоскодонную микропанель с сорбированным препаратом дерината, конъюгат фермента с антителами к С1 ингибитору человека, субстратный буфер и стандарт с известной концентрацией С1 ингибитора человека.