Способ микроклонального размножения кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.) Российский патент 2023 года по МПК A01H4/00 

Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для размножения редких и лекарственных древесных видов рода кирказоновые (Aristolochia L.), в том числе для кирказона маньчжурского (A. manshuriensis Kom.).

Кирказон маньчжурский - древесная лиана из рода Aristolochia (сем. Aristolochiaceae), эндемик небольшой части Восточной Азии; его ареал ограничен юго-западом Приморского края, п-овом Корея и Мукденской провинцией Восточного Китая. Уязвимый вид на границе ареала. Природные популяции A. manshuriensis находятся в угнетенном состоянии, самовозобновление вида незначительное. Вид внесен в Красные книги РСФСР (1988), Российской Федерации (2008) и Приморского края (2008).

Учеными определено, что вещества, выделенные из A. manshuriensis, обладают лекарственными свойствами [1]. Арисканин А ингибирует агрегацию тромбоцитов; р-кумаровая кислота обладает противобактериальным, противогрибковым, антигепатотоксическим, противогиперхолестериновым, нейрозащитным и желчегонным действием. Феруловая кислота показывает противомитотическое, противотуберкулезное, цитотоксическое, противогрибковое, противоэстрогенное, противогепатоксическое свойство, также ингибирует агрегацию тромбоцитов, является антиоксидантом; p-гидроскибензойная кислота активирует синтез простогландинов, замедляет действие эритроцитов, является противоядием, антимутагеном. Магнофлорин - ганглионарный блокатор, препятствует повышению артериального давления. Олеанолевая кислота обладает противоопухолевым, кардиотоническим, мочегонным, гипогликемическим, противотуберкулезным, противоплазмодиевым и противомалярийным действием, снижает проницаемость капилляров крови, способствует восстановлению и появлению гепатоцитов, ингибирует агрегацию тромбоцитов, запускает апоптоз, является малотоксичным. β-цитостерол имеет противоопухолевый, противовоспалительный, противокашлевый эффект, препятствует повышению холестерина, ингибирует склеивание тромбоцитов и тирозиназу. Стигмастерол проявляет противоопухолевое, противолейшманивое, противомалярийное, противовирусное действие. Ванильная кислота обладает противобактериальными, противогрибковыми, противовоспалительными, противоглистными свойствами, является антиоксидантом [1].

В тибетской медицине применяют подземные части, древесину используют в корейской и китайской медицине как мочегонное; настой пьют при ревматизме и радикулите [2, 3, 4]. Из стеблей A. manshuriensis был создан препарат, влияющий в разных дозах на частоту сердечных сокращений [5]. Применяется при сердечных и почечных отеках, воспалениях мочевыводящих путей. Назначают также для снижения температуры и увеличения лактации [3]. Кирказон маньчжурский издавна применяют наружно как болеутоляющее средство, а также используют при укусах змей, при териотоксикозах, также при стоматите, диуретических явлениях, гематурии [1,2].

В настоящее время проблема сохранения и восстановления природных популяций кирказона маньчжурского стоит остро в связи с неконтролируемым сбором лианы на лекарственное сырье. Подбор методов массового размножения растений для их дальнейшего доращивания и высаживания в природные популяции - путь для восстановления истощенных по численности. Метод микроклонального размножения позволяет получить генетически однородные растения-регенеранты в больших количествах. Микрорастения могут быть использованы в фармакологии как источник ценных биологически активных веществ и для интродукции и реинтродукции.

Известен метод микроклонального размножения A. manshuriensis [6], включающий культивирование на питательной среде, содержащей минеральные макро- и микросоли по прописи Мурасиге и Скуга (MS) [7], а также различные вещества с цитокининовой и ауксиновой активностью. В качестве цитокининов использовали 6-бензиламинопурин (6-БАП), N6-(2-изопентил) аденин (2ip), 6-фурфуриламинопурин (кинетин), а также применяли препараты Дропп, Цитодеф, Мицефит. Из веществ с ауксиновой активностью использовали альфа-нафтилуксусную кислоту (НУК), индолилмасляную кислоту (ИМК), 3-индолилуксусную кислоту (ИУК) и 2,4-дихлорфеноксиуксусную кислоту (2,4-Д). Для снижения фенольной нагрузки на микропобеги дополнительно вводили в питательную среду активированный уголь.

Недостатком известного способа является многовариантность используемых веществ, что приводит к удлинению периода субкультивирования, увеличению материальных и трудовых затрат. Несмотря на присутствие в составе активированного угля во всех вариантах отмечалось побурение среды, вероятно, из-за большего выделения фенольных соединений. Таким образом, даже дополнительное внесение веществ в состав питательной среды не позволило авторам получить жизнеспособные микрорастения - через 2-3 пассажа сформировавшиеся микропобеги погибали.

Также известен способ микроклонального размножения A. manshuriensis [8], включающий стерилизацию первичных эксплантов хлоридом ртути (II), посадка первичных эксплантов на 10 вариантов питательных сред с макро- и микросолями по прописи WPM [9] и MS с добавлением витаминов: никотиновой кислоты - 0.5 и 1.0 мг/л, пиридоксина - 0.5 и 1.0 мг/л, глицина - 1.0 мг/л, аскорбиновой кислоты - 0.5 мг/л, тиамин - 0.5 мг/л, гидролизата казеина - 80.0 мг/л, мезо-инозитола - 50.0 мг/л, кинетина - 0.2 мг/л; фитогормонов: ИМК - 0.5, 1.0 и 1.5 мг/л и ИУК - 0.5, 1. 1.5, 4 и 8 мг/л, 2ip - 4 и 8 мг/л. Ежедневные пассажи проводили в течении двух недель для уменьшения в среде фенолов, выделяемых эксплантами.

Недостатком данного способа является длительность обработки агрессивным стерилизующим агентом, что ведет к высокой гибели первичных эксплантов. Ежедневные пересадки на свежую питательную среду приводят не только к увеличению материальных и трудовых затрат, но и увеличению длительности периода получения чистой культуры. Кроме того, дополнительные пересадки стерильных объектов могут увеличить вероятность заражения исходных эксплантов.

Так же недостатком известного способа является использование питательных сред с множественными компонентами и относительно высокой концентрацией фитогормонов, что влияет на генетическую изменчивость клеток растений, что недопустимо при микроразмножении и при дальнейшем применении в лекарственных целях полученных растений-регенерантов.

Наиболее близким техническим решением по микроклонированию A. manshuriensis, является способ клонального микроразмножения, включающий вычленение апикальных и латеральных почек, стерилизацию гипохлоритом натрия (экспозиция 7-10 мин). Посадка на питательные среды, содержащие макро- и микросоли по прописи MS с добавлением 0.8 мг/л 6-БАП и 0.05 мг/л ИУК. Как следует из работ авторов, размножение микропобегов и их последующее укоренение на среде, содержащей макро- и микросоли по прописи MS, с добавлением 20 мг/л сахарозы и ИМК в концентрации 3-5 мг/л осуществляли, помещая несколько черенков в колбы.

Дальнейшую адаптацию растений-регенерантов к условиям ex vitro проводили, высаживая на смесь песка, торфа и дерновой листовой земли в соотношении 1:1:1, предварительно простерилизованной при 85-90°С в течение 1-2 ч [10].

К недостаткам данного технического решения следует отнести:

- недостаточно высокий процент укоренения микропобегов (50%);

- длительность обработки агрессивным стерилизующим агентом может приводить к высокой гибели первичных эксплантов;

- многоэтапный период субкультивирования за счет использования разных питательных сред для развития адвентивных почек, роста побегов и укоренения микрорастений, вследствие чего удлиняется процесс получения полноценных микропобегов и возрастают материальные и трудовые затраты. В конечном результате усложняется процесс получения растений-регенерантов A. manshuriensis. Этот факт может привести к увеличению генетической (в том числе и хромосомной) изменчивости клеток растений, что является недопустимым при дальнейшем использовании полученных растений-регенерантов в качестве фармакологического сырья;

- жизнеспособность получаемых микрорастений может ухудшаться из-за культивирования нескольких микропобегов в одной колбе, поскольку высока вероятность переплетения образующихся корней;

- велика вероятность передачи патогенов от одного зараженного экспланта в колбе всем остальным эксплантам, что снижает их жизнеспособность.

Технической проблемой, поставленной при создании изобретения, является разработка эффективного способа получения жизнеспособных микрорастений A. manshuriensis для реинтродукции и интродукции при сокращении периода субкультивирования микрорастений для использования полученных растений как фармакологического сырья и, как следствие, снижении материальных и трудовых затрат.

Указанная техническая проблема решается тем, что в известном способе микроклонального размножения A. manshuriensis, включая отбор эксплантов и их стерилизацию, культивирование стерильных эксплантов на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, размножение и укоренение микропобегов на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, перевод укорененных микропобегов в условия открытого почвогрунта, согласно изобретению, стадии культивирования и размножения ведут на единой питательной среде на основе макро- и микросолей MS, в которую дополнительно вводят 0.1-0.7 мг/л 6-БАП и 0.5 мг/л аскорбиновой кислоты. При этом в качестве питательной среды для укоренения микропобегов берут среду MS с половинным содержанием макро- и микросолей с добавлением 0.1-1.0 мг/л ИМК.

Проведение стадий культивирования и размножения на единой питательной среде способствует хорошему развитию адвентивных почек, росту и размножению побегов и получению жизнеспособных микропобегов. Кроме того, это значительно уменьшает длительность цикла получения полноценных микрорастений, поскольку исключает период привыкания побегов к следующему варианту питательной среды. Это так же позволяет снизить материальные и трудовые затраты.

Дополнительное введение 6-бензиламинопурина в концентрации 0.1-0.7 мг/л позволяет активировать покоящиеся почки первичного экспланта и стимулировать рост побега. Использование 6-БАП в концентрации больше 0.7 мг/л приводит к обводнению микропобегов, а использование 6-БАП в концентрации менее 0.1 мг/л не обеспечивает получение полноценно развитых микропобегов A. manshuriensis.

Введение в питательную среду витамина С (аскорбиновой кислоты), являющегося антиоксидантом и принимающего участие в процессах деления и фотосинтеза, обеспечивает получение полноценных растений-регенерантов с сохранением генотипа исходных растений. Присутствие аскорбиновой кислоты в питательной среде предотвращает выделение эксплантами фенольных соединений, способных привести к помутнению питательной среды, некротизации нижней части побега и ухудшению проводимости питательных веществ и, как следствие, к снижению качества получаемых микропобегов.

Введение в питательную среду аскорбиновой кислоты в концентрации менее 0.4 мг/л практически не влияет на рост и развитие микропробегов in vitro. Введение ее в концентрации более 0.6 мг/л нецелесообразно, т.к. при этом отмечалось угнетение ростовых процессов у микрорастений.

Использование для укоренения микропобегов A. manshuriensis питательной среды, содержащей половинную концентрацию растворенных в дистиллированной воде солей по прописи MS с дополнительным введением ИМК позволяет получать полноценные укорененные жизнеспособные микрорастения при уменьшенных материальных и трудовых затратах.

Введение в питательную среду фитогормона ИМК в диапазоне 0.1-1.0 мг/л приводит к ускорению заложения корневых зачатков и развитию придаточных корней. Увеличение концентрации ИМК более 1.0 мг/л приводит к формированию плотного каллуса на основании черенка с ухудшением укоренения микропобегов in vitro. Использование концентрации ИМК менее 0,1 мг/л практически не влияет на укореняемость микропобегов и на развитие корневой системы.

С целью уменьшения влияния агрессивного стерилизующего агента на первичный эксплант целесообразно стерилизацию эксплантов проводить с помощью последовательной обработки мыльно-щелочным раствором в течение 10-15 мин. и 0.1-0.2 %-м раствором диацида в течение 1-2 мин. с трехкратным отмыванием стерильной дистиллированной водой.

Обработка мыльно-щелочным раствором менее 10 мин не вело к гибели наружной инфекции, в то время как обработка мыльно-щелочным раствором более 15 мин приводило к травмированию и некрозу первичного экспланта.

Применение раствора диацида способствует качественной поверхностной стерилизации эксплантов. Использование раствора диацида в концентрации менее 0.1 % недостаточно для получения стерильной культуры, а концентрация раствора более 0.2 % приводит к некрозу тканей первичного экспланта.

Обработка оптимальной для нашей задачи концентрацией диацида менее 1 минуты не дает нужного эффекта, а при обработке более 2 минут 0.2 % раствором диацида наблюдается некроз обрабатываемых поверхностей.

Экспериментально установлено, что для получения жизнеспособных микрорастений в качестве эксплантов необходимо брать побеги текущего года длиной 0.7-1.5 см с одной-двумя пазушными почками.

Выращивание каждого микропобега в отдельной культуральный сосуд так же способствует достижению заявленного технического результата, поскольку не позволяет корням микрорастений переплетаться и при переносе в почвогрунт они не травмируются. Кроме того выращивание каждого микропобега в отдельном культуральном сосуде предотвращает передачу патогенов между эксплантами.

Изобретение иллюстрируются следующими фигурами: на фиг. показаны этапы микроклонального размножения A. manshuriensis, где : а) развитие пазушных почек; б) рост микропобегов; в) укорененные микрорастения.

В табл. 1 приведены составы питательных сред для получения полноценных микрорастений A. manshuriensis.

В табл. 2. приведены показатели, характеризующие жизнеспособность получаемых микрорастений A. manshuriensis.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Для проведения способа микроклонального размножения A. manshuriensis предварительно готовим питательную среду для получения микропобегов (стадия культивирования и размножения) и питательную среду для укоренения следующим образом (содержание компонентов приведены в табл. 1):

для приготовления 1 литра базовой питательной среды для культивирования и размножения в первый мерный стакан наливают 50 мл маточного раствора, содержащего макросоли по прописи MS: аммоний нитрат, калий дигидрофосфат, сульфат магния, кальций хлорид, тетрагидрат нитрата кальция, калия сульфат и 5 мл маточного раствора, содержащего микросоли по прописи MS: борная кислота, дигидрат сульфата марганца, пентагидрат сульфата меди, дигидрат молибдата натрия, гептагидрат сульфата цинка. Затем добавляют 5 мл маточного раствора: гептагидрат сульфата железа (II), 2-водную динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, витамины: аскорбиновую кислоту, глицин, тиамин и никотиновую кислоту; фитогормон: 6-БАП (при этом фитогормон берут в разных количествах - 0.5 и 1.2 мг/л), все перемешивают.

В другом мерном стакане растворяют сахарозу при перемешивании. Подготовленный раствор сахарозы вносят в первый мерный стакан и доводят общий объем до 500 мл дистиллированной водой, рН питательной среды доводят до 4.6-4.8. В третьем мерном стакане смешивают навеску агар-агара с 500 мл дистиллированной воды и нагревают до полного его растворения. Затем все растворы объединяют.

Подготовленную питательную среду разливают по пробиркам по 5 мл в каждую, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилуют автоклавированием при 0.8 атм в течении 20 минут. После автоклавирования питательной среде дают остыть и отстояться 1-2 дня.

Для приготовления 1 литра питательной среды для укоренения в первый мерный стакан наливают 25 мл маточного раствора, содержащего макросоли по прописи MS: аммоний нитрат, калий дигидрофосфат, сульфат магния, кальций хлорид, тетрагидрат нитрата кальция, калия сульфат и 2.5 мл маточного раствора, содержащего микросоли по прописи MS: борная кислота, дигидрат сульфата марганца, пентагидрат сульфата меди, дигидрат молибдата натрия, гептагидрат сульфата цинка. Затем добавляют 2.5 мл маточного раствора: гептагидрат сульфата железа (II), 2-водную динатриевую соль этилендиаминтетрауксусной кислоты, витамины: глицин, тиамин и никотиновую кислоту; фитогормон ИМК в количестве 0.5 мг/л, все перемешивают.

В отдельном мерном стакане смешивают навеску агар-агара с 500 мл дистиллированной воды и нагревают до полного его растворения.

В другом мерном стакане растворяют сахарозу при перемешивании. Подготовленный раствор сахарозы вносят в первый мерный стакан и доводят общий объем до 500 мл дистиллированной водой, рН питательной среды доводят до 4.6-4.8. Затем объединяют все растворы.

Подготовленную питательную среду разливают по пробиркам по 5 мл в каждую, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют автоклавированием при 0.8 атм в течении 20 мин. После автоклавирования питательной среде дают остыть и отстояться 1-2 дня.

Пример 1.

Первичный эксплант - побеги текущего года длиной 0.7 см с одной-двумя пазушными почками - последовательно обрабатывают мыльно-щелочным раствором в течение 10 мин. и 0.2% раствором диацида в течение 1 мин с трехкратным отмыванием стерильной дистиллированной водой, после чего эксплант помещают вертикально на питательную среду для культивирования и размножения с содержанием 0.5 мг/л 6-БАП. Первичные экспланты берут в количестве 10 шт в трехкратной повторности. Экспланты культивируют в течение 3 недель при температуре 24±1°С, 16-часовом фотопериоде (16/8), освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 4 тыс. лк. и относительной влажности воздуха около 70%. После культивирования полученные микропобеги переносят на свежую питательную среду этого же состава для дальнейшего размножения микропобегов, на которой культивируют в течении трех недель. Затем микропобеги помещают в отдельные культуральные сосуды на питательную среду для укоренения, содержащую 0.5 мг/л ИМК.

Результаты культивирования представлены в табл. 2 и на фиг. а и б.

Пример 2.

Подготовленную питательную среду разливают по пробиркам по 5 мл в каждую, закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют автоклавированием при 0.8 атм в течении 20 мин. После автоклавирования питательной среде дают остыть и отстояться 1-2 дня.

Перед посадкой проводят стерилизацию первичных эксплантов - побегов текущего года длиной 1.5 см с одной-двумя пазушными почками - последовательной обработкой мыльно-щелочным раствором в течение 15 мин и 0.1% раствором диацида в течение 2 мин с трехкратным отмыванием стерильной дистиллированной водой, после чего эксплант помещают вертикально на питательную среду для культивирования и размножения с содержанием 1.2 мг/л 6-БАП. Первичные экспланты берут в количестве 10 шт в трехкратной повторности. Экспланты культивируют в течение 3 недель при температуре 24±1°С, 16-часовом фотопериоде (16/8), освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 4 тыс. лк. и относительной влажности воздуха около 70%. После культивитрования полученные микропобеги переносят на свежую питательную среду этого же состава для дальнейшего размножения микропобегов, на которой культивируют в течении трех недель. Затем микропобеги помещают в отдельные культуральные сосуды на питательную среду для укоренения, содержащую 0.5 мг/л ИМК.

Результаты культивирования представлены в табл. 2 и на фиг. а и б.

Пример 3.

Подготовленную питательную среду для укоренения разливают в культуральные сосуды, в частности, используя для этого пробирки, в каждую из которых наливают по 5 мл закрывают ватно-марлевыми пробками и стерилизуют автоклавированием при 0.8 атм в течении 20 мин. После автоклавирования питательной среде дают остыть и отстояться 1-2 дня.

Перед посадкой для укоренения эксплант помещают вертикально на питательную среду для укоренения, содержащую 0.5 мг/л ИМК.

Экспланты берут в количестве 10 шт в трехкратной повторности, культивируют при температуре 24±1°С, 16-часовом фотопериоде (16/8), освещении белыми люминесцентными лампами с интенсивностью 4 тыс. лк. и относительной влажности воздуха около 70%. Образование и рост корней происходит в течении 4 недель. К этому времени микрорастения достигают 23.85±2.73 мм высоты и имеют 3.0±0.41 шт. листовых узлов и 8.33±2.19 шт. корней при длине корней 23.33 мм.

После этого полученные полноценные микрорастения с хорошо развитой корневой системой высаживают в подготовленный почвогрунт для возможного дальнейшего использования при реинтродукции и интродукции, или использования полученных растений как фармакологического сырья.

Вид укорененных микрорастений представлен на фиг. в.

Как видно из результатов, представленных в таблице 2, описываемый способ обеспечивает достижение заявленного технического результата и полученные жизнеспособные микрорастения A. manshuriensis могут быть использованы для реинтродукции и интродукции при сокращении периода субкультивирования микрорастений и для использования полученных растений как фармакологического сырья.

Литература

1. Zhou J., Xie G., Yan X. Encyclopedia of traditional chinese medicines: molecular structures, pharmacological activities, natural sources and applications. V. I - 557 p.; V. II - 525 p.; V. III - 669 p.; V. IV - 636 p.; V. V - 601p.; V. VI - 730p. Berlin - Heidelberg: Springer-Verlag. 2011.

2. Растительные ресурсы СССР. Т. 1 Цветковые растения, их химический состав, использование // отв. ред. А.А. Федоров. Л.: Наука, 1984. 464 с.

3. Чхве Тхэсоп. Лекарственные растения. М.: Медицина, 1987. 607 с.

4. Teng L., Shaw D., Barnes J. Traditional Chinese herbal medicine // Pharmaceutical J. 2006. V. 276. P. 361-363.

5. Chiang P.-C., Chao T.-T., Wei Y.-K. Pharmacological studies on commercial «Mo-tung» - a Chinese drug from Aristolochia masnhuriensis Komarov // Acta pharmaceutica sinica. 1956. V. 4. N. 3. P. 187-196.

6. Доан Т.Т. Особенности клонального микроразмножения редких и лекарственных растений (Euonymus nana Bieb., Dioscorea nipponica Makino., Dioscorea caucasia Lipsky. и Aristolochia manshuriensis Kom.): дис. - Рос. гос. аграр. ун-т, 2013.

7. Murashige T, and Skoog F 1962 A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures Physiologia Plantarum 15 pp 473-497.

8. Demidenko E N, Berseneva S A Features of Microclonal Reproduction and Organogenesis of the Far Eastern Species Aristolochia Manshuriensis Kom. as a Biological Resource, IOP Conf. Series: Earth and Environmental Science 670 (2021) 012014.

9. Lloyd G., McCown B. Commercially feasible micropropagation of mountain laurel, Kalmia latifolia, by use of shoot tip culture // Comb. Proc. Intl. Plant Prop. Soc. - 1980. 30. P. 421-427.

10. п. РФ № 2662682, МПК A01H 4/00; A01H 5/00, опубл. 21.06.2018.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для размножения редких и лекарственных древесных видов рода кирказоновые (Aristolochia L.), в том числе для кирказона маньчжурского (A. manshuriensis Kom.). Разработанный способ микроклонального размножения кирказона маньчжурского включает отбор эксплантов и их стерилизацию, культивирование стерильных эксплантов на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, размножение и укоренение микропобегов на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, перевод укорененных микропобегов в условия открытого почвогрунта. Стадии культивирования и размножения ведут на единой питательной среде на основе макро- и микросолей MS, в которую дополнительно вводят 0,1-0,7 мг/л 6-БАП и 0,5 мг/л аскорбиновой кислоты, а для укоренения микропобегов берут питательной среду MS с половинным содержанием макро- и микросолей с добавлением 0,1-1,0 мг/л ИМК. Стерилизацию эксплантов ведут последовательной обработкой мыльно-щелочным раствором в течение 10-15 мин и 0,1-0,2%-ным раствором диацида в течение 1-2 мин с трехкратным отмыванием стерильной дистиллированной водой. В качестве эксплантов берут побеги текущего года длиной 0,7-1,5 см с одной-двумя пазушными почками, а укоренение каждого микропобега проводят в отдельном культуральном сосуде. 1 ил., 2 табл.

Способ микроклонального размножения кирказона маньчжурского (Aristolochia manshuriensis Kom.), включающий отбор эксплантов и их стерилизацию, культивирование стерильных эксплантов на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, размножение и укоренение микропобегов на питательной среде на основе макро- и микросолей MS, перевод укорененных микропобегов в условия открытого почвогрунта, отличающийся тем, что в качестве эксплантов берут побеги текущего года длиной 0,7-1,5 см с одной-двумя пазушными почками, стерилизацию эксплантов ведут последовательной обработкой мыльно-щелочным раствором в течение 10-15 мин и 0,1-0,2%-ным раствором диацида в течение 1-2 мин с трехкратным отмыванием стерильной дистиллированной водой, стадию культивирования и стадию размножения ведут на единой питательной среде на основе макро- и микросолей MS, в которую дополнительно вводят 0,5-1,2 мг/л 6-бензиламинопурина и 0,5 мг/л аскорбиновой кислоты, а в качестве питательной среды для укоренения микропобегов берут среду с половинным содержанием макро- и микросолей MS и добавлением 0,5 мг/л индолилмасляной кислоты, а на укоренение каждый микропобег помещают в отдельный культуральный сосуд.