МНОГОФУНКЦИОНАЛЬНЫЙ СИНБИОТИЧЕСКИЙ ПРЕПАРАТ, СОСТОЯЩИЙ ИЗ ПРОБИОТИКА НА ОСНОВЕ ЛАКТОБАКТЕРИЙ, АДАПТОГЕНА НА ОСНОВЕ ГИДРОЛИЗАТА КРОВИ И НАНОСОРБЕНТА Российский патент 2012 года по МПК A61K35/74 A61K33/06 A61K35/14 A61P1/00 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к ветеринарным препаратам для лечения и профилактики кишечных заболеваний, возникающих в результате дисбактериозов и кишечных дисфункций, а именно - к препаратам, оказывающим регулирующее действие на системы и органы макроорганизма, обеспечивая их нормальное функционирование при инфекционной и соматической патологии желудочно-кишечного тракта у сельскохозяйственных животных. Благодаря применению заявляемого препарата у животных поддерживается нормальный кишечный биоценоз, повышается обмен веществ, устойчивость к стрессовым ситуациям за счет влияния на центральную и периферическую нервные системы, при этом возрастает способность выведения из организма токсических соединений.

Экономическая безопасность России в современных условиях значительно усложнилось за счет увеличения количества причин, неблагоприятно влияющих на эпидемиологическую ситуацию в стране.

Учитывая это, исследования, направленные на создание новых отечественных эффективных ветеринарных препаратов и технологий их производства является актуальной задачей. Многолетние исследования в области ветеринарной микробиологии показали, что микрофлора желудочно-кишечного тракта играет важную роль в поддержании нормального функционирования жизнеобеспечивающих систем макроорганизма.

Кишечные заболевания, возникающие в результате дисбактериозов и кишечных дисфункций инфекционной и соматической этиологии регистрируются практически во всех странах мира и по экономическому ущербу занимают одно из ведущих мест. Это обусловлено комплексом причин различного характера: ухудшением экологической ситуации, ростом иммунодефицитных состояний, повышением аллергизации, нарушением микробиоценоза в результате нерационального применения антибактериальных препаратов. Именно это становится дополнительными факторами в распространении условно-патогенной микрофлоры, обладающей устойчивостью к антибиотикам и химиопрепаратам и влечет за собой целый спектр заболеваний, связанных с нарушением обмена веществ, функционирования иммунной системы, синтезом витаминов и незаменимых аминокислот, их всасывания, а также поступления в организм микро- и макроэлементов.

В сообщениях последних лет в научной литературе разными авторами предложены термины: «пробиотики», «пребиотики», «синбиотики».

Использование данных препаратов оказывает регулирующее действие на системы и органы макроорганизма, обеспечивая коррекцию их положительного функционирования.

Наиболее перспективным направлением, по мнению исследователей, является создание нового поколения препаратов смешанного состава, состоящих из пробиотиков и различных пребиотических средств - синбиотиков.

Действие синбиотиков основано на синергидном эффекте, комбинации (смеси) пробиотиков и пребиотиков, за счет которого создается эффект действия не только вводимых в желудочно-кишечный тракт хозяина микроорганизмов - пробиотиков, но и стимулирующее действие на них, а также собственную микрофлору, обеспечивающее активацию роста - пребиотиков. Исследования по созданию таких препаратов постоянно расшираются. Решением данной задачи занимаются многие микробиологи и биотехнологи.

Известны препараты для лечения дисбактериозов кишечника - эубиотики, изготавливаемые из живых антагонистически активных бактерий, являющихся представителями нормальной микрофлоры кишечника человека: кишечной палочки (колибактерин, бификол), бифидобактерий (бифидумбактерин, бифидумбактерин форте), лактобактерий (лактобактерин, ацилакт, аципол), а также препаратов, изготовленных на основе живых апатогенных антагонистически активных представителей рода Bacillus: споробактерин, бактиспорин, биоспорин (Справочник практического врача. Бактерийные, сывороточные и вирусные лечебно-профилактические препараты. Аллергены. Дезинфекционно-стерилизационные режимы поликлиник. Под редакцией Н.А.Озерецковского, Г.И.Останина. Изд. "Фолиант" Санкт-Петербург, 1998 г., с.135).

Близким техническим решением (прототипом) является препарат-пробиотик в иммобилизованной форме, включающий носитель, представляющий собой сорбент, и клетки эубиотиков, иммобилизованные на указанном носителе, причем клетки эубиотиков используют совместно с питательной средой, а в качестве сорбента используют материал с антацидными свойствами, развитой мезо- и макропористой структурой и объемом макропор не менее 0,01 см³/г в виде порошка с размером частиц не более 0,1 мм, или в виде гранул размером (0,1-5,0) мм, или в виде таблеток.

В качестве сорбента используют пористый материал на основе оксида алюминия с гидрофильно-гидрофобной топохимией поверхности, например, энтеросорбент типа СУМС, модифицированный углеродом, или энтеросорбент типа СИАЛ, модифицированный кремнийорганическим полимером. В качестве эубиотиков используют бифидо- или лактобактерии или их смесь (патент РФ №2118535, МПК⁶ A61K 35/74, опубл. 10.09.98 г.).

Пробиотический препарат ветеринарного назначения, содержащий сухую бакмассу бифидобактерий, стрептококков, окись алюминия, гидроокись алюминия, углевод лактозу и/или сахарозу и наполнитель, отличающийся тем, что дополнительно содержит сухую культуру стафилококковых бактериофагов штаммов ВГНКИ 89/ЦМЭИ-FS-1-ДЕП.

Результат этого изобретения заключается в получении комплексного пробиотического и бактериофагового препарата, позволяющего сократить сроки лечения, получить более стойкий и выраженный лечебно-профилактический эффект, способный повышать иммунный статус организма животных и сельскохозяйственной птицы и устойчивого к действию ферментов желудочно-кишечного тракта.

Недостатком этой группы препаратов является то, что они имеют практически идентичный механизм действия, направленный на оздоровление макроорганизма за счет подавления условно-патогенной и патогенной микрофлоры в результате высокой адгезивной и кислотообразующей активности, ингибирующего действия на микроорганизмы - возбудители острых кишечных заболеваний, не затрагивая патогенетические изменения, происходящие в макроорганизме.

Для профилактики и лечения многих патологических состояний, обусловленных нарушением эндоэкологии, широкое распространение получили энтеросорбенты. Это различные типы активных углей, например, карбактин, карболонг, микросорб, полифепан и т.д. (Сенов П.Л. Фармацевтическая химия. - М.: Медицина, 1978, с.132-133; патент РФ N 2029546, МПК⁶ A61K 9/16, опубл. 27.02.95 г.), природные материалы и их аналоги (кристаллическая микроцеллюлоза, цеолиты, хитозаны, пектины и т.д.), синтетические минеральные сорбенты и другие материалы, которые используются для очищения организма от шлаков, радионуклидов, тяжелых металлов и токсинов. Энтеросорбенты снижают эффекты экзо- и эндотоксикозов.

Однако энтеросорбенты не устраняют причин вызывающих эффекты экзо- и эндотоксикозов, как правило, они не селективны, работают в основном на избыток субстрата, могут оказывать негативное действие из-за сорбции нужных для организма метаболитов (витаминов, гормонов) и не обеспечивают активно нормализацию микробиоценоза.

В качестве прототипа является синбиотический препарат «Бифилиз», в состав которого входят лизоцим и живые бифидумбактерии.

Входящий в состав комбинации лизоцим повышает в организме активность бифидо- и лактобактерий, проявляет ряд других своих биологических свойств - иммуномодулирующее, антианемическое, стимулирующее регенерацию. Именно внесение в готовую форму препарата лизоцима обуславливает преимущество «Бифилиза» перед «Бифидобактерином», обеспечивая быстрое и стойкое улучшение кишечного микробиоценоза, коррекцию факторов местного иммунитета, нормализацию структуры и функции слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта.

Недостатком данного препарата является то, что в основе его патогенетического действия лежит нормализация функционального состояния желудочно-кишечного тракта, не затрагивая структурно-метаболические изменения, происходящие в макроорганизме.

В то же время данный препарат используется только в медицинских целях. Исходя из этого проведение сравнительной оценки препарата «Бифилиз» и данного многофункционального синбиотического препарата не представляется возможным.

Технический результат заявляемого изобретения заключается в приготовлении препарата, содержащего пробиотик, белково-витаминно-минеральный комплекс, обладающий многофункциональным биологическим действием на органы и системы макроорганизма, включающего:

- лечение и профилактику острых кишечных заболеваний инфекционного и соматического генеза;

- приспособление к неблагоприятным факторам внешней среды;

- улучшение обмена веществ;

- повышение устойчивости к стрессовым ситуациям;

- выведению из организма токсических соединений.

Компоненты входящие в состав препарата выполняют функцию наностатического функционально-физиологического насоса, обеспечивающего поступление в органы и системы макроорганизма биологически активных веществ с низким молекулярным весом, находящимся в легкоусвояемой форме, и выведение токсических продуктов обмена веществ (метан, сероводород, аммиак) и токсинов за счет строго калиброванных размеров пор (около 4 ангстрем) и значительной адсорбционной площадью более 300 м² на 1 г.

Для достижения заявленного технического результата заявителями предлагается препарат, состоящий из:

1. Адаптогена - гидролизата крови, который имеет в своем составе разнообразные компоненты: пептиды, заменимые и незаменимые аминокислоты, углеводы, факторы роста, минеральные элементы. Все компоненты находятся в легкоусвояемой форме, подготовленные без дополнительной трансформации вступать в биохимические и физиологические реакции в системе обмена веществ. Обладает способностью:

- повышать физиологические функции органов и систем;

- стимулировать репродуктивные функции животных;

- нормализовать обмен веществ;

- стимулировать активность факторов иммунитета и снижать риск возникновения заболеваний;

- способствовать сохранению жизнеспособности пробиотических микробных клеток лактобактерий в процессе прохождения ЖКХ;

- повышать эффективность процесса кормления животных.

Способ приготовления данного компонента нового препарата подробно изложен в работе Л.Я.Телишевской. «Белковые гидролизаты. Получение, состав, применение». - М., «Аграраная наука», 2000.

2. Наносорбент - алюмосиликаты, обладающие прямым действием как адсорбента, так и ионообменника, участвует в каталитических процессах, регулирует содержание свободной жидкости в кишечнике, состав и концентрацию электролитов, минеральный обмен и кислотно-щелочное равновесие, иммобилизирует ферменты желудочно-кишечного тракта, повышая их активность, способствует образованию кремниевой кислоты, которая обеспечивает высокое буферное действие в отношении органических кислот.

3. Пробиотик на основе лактобактерий. В настоящее время для приготовления пробиотических препаратов используется значительное количество штаммов молочнокислых бактерий, которые способствуют регуляции микробиоценоза кишечника и неспецифической иммуностимуляции при дисбактериозах кишечника различной этиологии (В.М.Коршунов. «Проблемы регуляции микрофлоры кишечника». - Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. М., 1995, №3, с.48-52).

В состав предлагаемого препарата входит ассоциация штаммов лактобактерий, находящихся в симбиотическом устойчивом равновесии в культуре и сохраняющих свои свойства при совместном использовании, что существенно повышает терапевтическую эффективность препарата.

Штамм №1 обладает следующими биологическими свойствами, позволяющими отнести его к разновидности L.plantarum в соответствии с определителем Bergeys, 1979.

При выращивании в жидкой среде МРС-1 в течение 48 часов при температуре 38…40°C лактобактерий растут в виде гомогенного белого осадка на дне пробирки, при этом питательная среда остается прозрачной.

На поверхности твердой агаризованной среды МРС-4 через 48 часов инкубирования при температуре 38…40°C формируются колонии белого цвета, прозрачные имеющие форму полусфер с ровными краями, с выпуклой, блестящей, гладкой поверхностью, консистенция мягкая, слизистая, тягучая.

Пигмента не образуют.

При окрашивании по Граму наблюдаются грамположительные слегка изогнутые палочки с прямыми или слегка закругленными полюсами. Внутри клеток выявляются биполярные тела. Спор и капсул не образуют. Неподвижны, лишены жгутиков и пилей. Длина клеток составляет (1,5…5,0) мкм, диаметр - 0,6 мкм.

Предлагаемый микроорганизм является факультативным анаэробом, каталазоотрицательным, цитохромоксидазо-отрицательным. Аммиак из аргинина не образует. Нитраты не редуцирует. Желатину не разжижает.

Обладает следующей сахаролитической активностью.

Сбраживает глюкозу, сахарозу, лактозу, маннозу, арабинозу, ксилозу, манит, сорбит и салицин.

Не ферментирует рамнозу.

Конечное значение pH на ферментируемых сахарах (4,8±0,2) ед. pH в среде МРС-1. Тип ферментации - бродильный гомоферментативный с образованием молочной кислоты без газа. Молоко свертывает с образованием сгустка, максимально титруемая кислотность которого составляет (246±15)°T.

Температурный оптимум культивирования (30…35)°C. Температурный предел роста в атмосфере воздуха (15…45)°C. Предельные значения pH среды, при котором наблюдается рост (5,0…8,0) ед. pH. Оптимальное значение pH среды - 6,3 ед. pH.

В процессе жизнедеятельности накапливает глицин, глютамин, изолейцин и тирозин.

Культура штамма обладает следующей чувствительностью к антибактериальным препаратам: устойчива к метронидазолу, канамицину, налидиксовой кислоте; умеренно устойчива к фторхинолонам: чувствительна к амоксицилину, доксициклину, кларитромицину.

Индекс адгезивности - среднее количество лактобацилл, прикрепившихся к одному эритроциту, при подсчете 25…50 эритроцитов (не более 5 эритроцитов в поле зрения) - составляет 8,2±1,14, что позволяет отнести данный штамм к высокоадгезивным.

Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении подавления роста и развития грамположительных и грамотрицательных условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Культура штамма перекись водорода не продуцирует, лизоцимной, гемолитической, плазмокоагулазной и желатиназной активностью не обладает.

Микробы предлагаемого штамма имеют четыре плазмиды с молекулярными массами 5,2 МД, 5,9 МД и 40 МД.

Штамм №2 обладает следующими биологическими свойствам, позволяющими отнести его к разновидности L.Buchneri в соответствии с определителем Bergeys, 1979.

При выращивании в жидкой среде МРС-1 в течение 72 часов при температуре 38…40°C лактобактерии растут в виде гомогенного белого осадка на дне пробирки, при этом питательная среда остается прозрачной.

На поверхности твердой агаризованной среды МРС-4 через 96-120 часов инкубирования при температуре 38…40°C формируется колонии белого и буроватого цвета с желтым оттенком. Края колоний четкие, но неровные. Поверхность колонии гладкая и блестящая, консистенция плотная, тягучая, с трудом снимается со среды.

Пигмента не образуют.

При окрашивании по Граму наблюдаются грамположительные небольшие палочки или коккобактерии с четкими конурами длиной (1,0…1,5) мкм и диаметром 0,9 мкм. Внутри клеток выявляются биполярные тела. Спор и капсул не образуют. Неподвижны, лишены жгутиков и пилей.

Предлагаемый микроорганизм является факультативным анаэробом, каталазоотрицательным, цитохромокредуцирует. Желатину не разжижает.

Обладает следующей сахаролитической активностью.

Сбраживает глюкозу с газовыделением, арабинозу, сахарозу, лактозу, маннозу, ксилозу.

Не ферментирует рамнозу, манит, сорбит и салицин. Конечное значение pH на ферментируемых сахарах - (4,8±0,2) ед. pH в базовой среде МРС-1. Тип ферментации - бродильный гетероферментативный с образованием молочной и уксусной кислот, этанола и углекислого газа. Молоко свертывает с образованием сгустка, максимально титруемая кислотность которого составляет (246±15)°T.

Температурный оптимум культивирование (35…40)°С. Температурный предел роста в атмосфере воздуха - (15…45)°C. Предельные значения pH среды, при котором наблюдается рост - (5,0…8,0) ед. pH. Оптимальное значение pH среды - 6,3 ед. pH.

В процессе жизнедеятельности накапливает глицин, глютамин, изолейцин и тирозин.

Культура штамма обладает следующей чувствительностью к антибактериальным препаратам: устойчива к метронидазолу, канамицину, налидиксовой кислоте: умеренно устойчива к фторхинолонам; чувствительна к амоксицилину, доксициклину, кларитромицину.

Индекс адгезивности - среднее количество лактобацилл, прикрепившихся к одному эритроциту, при подсчете 25…50 эритроцитов (не более 5 эритроцитов в поле зрения) - составляет 9,1±1,18, что позволяет отнести данный штамм к высокоадгезивным.

Штамм характеризуется высокой антагонистической активностью в отношении подавления роста и развития грамположительных и грамотрицательных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов.

Культура штамма перекись водорода не продуцирует, лизоцимной, гемолитической, плазмокоагулазной и желатиназной активностью не обладает.

Плазмидный состав. Штамм плазмид не имеет.

Характеристика его адгезивной и кислотообразующей активности, ингибирующее действие на условно-патогенные и патогенные микробы представлена в таблице 1.

Анализ результатов, представленных в таблице, свидетельствует о том, что препарат характеризуется высокой антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам патогенной и условно-патогенной микрофлоры, высокой кислотообразующей и адгезивной способностью.

При этом заявляемый препарат имеет следующий компонентный состав:

- гидролизат крови - 3-7 частей;

- алюмосиликаты - 2-5 частей;

- пробиотики - конечная концентрация в препарате не менее 2×10⁹ КОЕ в 1 см³.

Эффективность препарата представлена в таблице 2.

Таблица 2 Результаты лечебно-профилактического действия нового синбиотического препарата при острых кишечных заболеваниях у сельскохозяйственных животных. Исследуемые с/х животные Группы животных (10-30 голов), препарат вводился для… Заболело, % Погибло, % Поросята профилактики заболевания 0 0 лечения заболевания 100 14 контрольная группа (препарат не вводился) 60…80 60…80 Телята профилактики заболевания 0 0 лечения заболевания 100 0 контрольная группа (препарат не вводился) 92 0 Примечание: Для предотвращения гибели телят в контрольной группе с 5 дня развития заболевания проводили курс антибиотикотерапии с последующим долечиванием синбиотическим препаратом.

Изучение изменения обмена веществ, повышение устойчивости к стрессовым факторам, выведение из организма токсических веществ было оценено в производственных испытаниях нового синбиотического препарата на различных возрастных группах крупного рогатого скота представлено в таблице 3.

Таблица 3 Эффективность нового симбиотического препарата при проведении производственных испытаний на телятах Изучаемые критерии оценки, ед. изм. Показатели для групп животных Контрольная Опытная Количество животных в группе, гол. 300 200 Средняя масса животных в начале опыта, кг 55,0 60,0 Средняя масса животных в конце проведения опыта, кг 75,46 87,2 Среднесуточный прирост массы животных, г 510 680 Заболеваемость ОКЗ в процессе наблюдения, % 87 58 Заболеваемость ОРЗ в процессе наблюдения, % 34 7,7 Количество павших и подвергнутых вынужденному забою животных, % 21 7,7 Средняя стоимость курса лечения, руб. 322,0 75,0

Испытания эффективности, проведенные на телятах 1-90 дневного возраста, показано (табл.3) снижение выявленного синдрома диареи в 1,5 раза, заболеваемость респираторными заболеваниями в 4,4 раза. Количество павших и подвергнутых вынужденному забою животных в опытной группе снизилось в 2,7 раз.

Плановые взвешивания животных выявили, что среднесуточный привес в опытной группе составлял 680,0 г., что на 25% выше, чем в контрольной.

Оценка средней стоимости курса терапии в опытной группе составила 75 рублей, а в контрольной - 322 рубля.

Использования препарата на данных животных способствовало повышению показателей сахара в крови на 20%, резервной щелочности на 23%, улучшились показатели обмена Mg, Cu, Zn, нормализовались показатели Са и Р.

Увеличились показатели содержания в крови каротина на 20%, витамина C на 13%.

Таким образом, проведенные исследования подтвердили высокую эффективность заявляемого синбиотического препарата.

Изобретение относится к области ветеринарии и представляет собой синбиотический препарат для лечения и профилактики острых кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, содержащий пробиотик и пребиотик, отличающийся тем, что в качестве пробиотика содержит лактобактерии, а в качестве пребиотика содержит адаптоген на основе гидролизата крови и наносорбент - алюмосиликаты осадочного происхождения со строго калиброванными канальцами диаметром около 4 ангстрем и сорбционной площадью более 300 м² на 1 г, при этом компоненты в препарате находятся в следующем соотношении:

лактобактерии, не менее 2×10⁹ КОЕ в 1 см³ адаптоген на основе гидролизата крови 3-7 частей наносорбент-алюмосиликаты   осадочного происхождения 2-5 частей.

Изобретение обеспечивает лечение и профилактику острых кишечных заболеваний инфекционного и соматического генеза, приспособление к неблагоприятным факторам внешней среды, улучшение обмена веществ, повышение устойчивости к стрессовым ситуациям, выведение из организма токсических соединений. 3 табл.

Синбиотический препарат для лечения и профилактики острых кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных, содержащий пробиотик и пребиотик, отличающийся тем, что в качестве пробиотика содержит лактобактерии, а в качестве пребиотика содержит адаптоген на основе гидролизата крови и наносорбент-алюмосиликаты осадочного происхождения со строго калиброванными канальцами диаметром около 4 Å и сорбционной площадью более 300 м² на 1 г, при этом компоненты в препарате находятся в следующем соотношении:
лактобактерии не менее 2·10⁹ КОЕ в 1 см³ адаптоген на основе гидролизата крови 3-7 частей наносорбент-алюмосиликаты   осадочного происхождения 2-5 частей