ПРОБИОТИЧЕСКАЯ КОРМОВАЯ ДОБАВКА ДЛЯ КОРОВ И ТЕЛЯТ Российский патент 2023 года по МПК A23K10/18 

Изобретение относится к области микробиологии и биологически активным кормовым добавкам, в частности к пробиотической кормовой добавке для сельскохозяйственных животных.

В настоящее время большой экономический ущерб сельскохозяйственным животноводческим и птицеводческим предприятиям наносят инфекционные заболевания. Наибольшую проблему представляют кишечные инфекции и дисбактериозы, которыми чаще всего болеют животные, особенно в первые дни жизни. От общего числа болезней животных желудочно-кишечные заболевания составляют 54,3-71,4%. Рекомендуемые профилактические мероприятия, включающие обеспечение полноценного кормления, надлежащие условия содержания сельскохозяйственных животных и птиц, поддержание на должном уровне ветеринарно-санитарного состояния ферм и инкубаторов не дают ожидаемого результата, так как не учитывается этиопатогенетический фактор развития диареи. Для лечения и профилактики желудочно-кишечных инфекций сельскохозяйственных животных и птиц в современной ветеринарной практике чаще всего применяют вакцинацию, антибиотикотерапию и пробиотические препараты.

Многочисленные исследования показывают, что наиболее эффективным, безопасным методом лечения и профилактики дисбактериоза и кишечных инфекций сельскохозяйственных животных является пробиотикотерапия. В отличие от антибиотиков, они не оказывают негативное влияние на нормальную микрофлору желудочно-кишечного тракта, а наоборот, способствуют ее качественному и количественному восстановлению, а также угнетению роста условно-патогенных микроорганизмов.

Положительный эффект пробиотиков на микрофлору пищеварительного тракта и организм в целом обеспечивается за счет повышения активности нормальной микрофлоры, населяющей желудочно-кишечный тракт сельскохозяйственных животных, повышения колонизационной резистентности, стимулировании клеточных и гуморальных факторов иммунитета, улучшения обмена веществ.

Перспективным подходом к терапии нарушений микробиоценоза желудочно-кишечного тракта является использование комбинированных полипробиотиков, в составе которых присутствуют несколько штаммов бактерий с добавлением стимуляторов роста, обеспечивающих восстановление микрофлоры естественным путем, так как стимулируется собственная микрофлора организма. Происходит активация обменных процессов, приводящая к увеличению усвояемости корма, ускоряется прирост живого веса, стимулируется иммунитет животных, тем самым, повышается продуктивность и сохранность сельскохозяйственных животных, в том числе и птиц.

Из имеющегося уровня техники известно, что при изготовлении пробиотических препаратов ветеринарного назначения чаще всего используются культуры микроорганизмов, относящиеся к родам Bacillus, Lactobacillus, Bifidobacterium.

Из имеющегося уровня техники известна композиция биологически активной профилактической кормовой добавки для молодняка сельскохозяйственных животных (Патент на изобретение RU 2525920 С2). Композиция добавки включает: хитозан-меланиновый комплекс из подмора пчел; лактулозу; бифидумбактерин из Bifidobacterium bifidum, штаммы №1, 791 или ЛВА-3; витамин С; сухие экстракты трав: корневища лапчатки прямостоячей; цветки ромашки аптечной; коры дуба; календулы лекарственной; эхинацеи пурпурной; зверобоя продырявленного.

Так же известна кормовая добавка с пробиотической активностью на минеральной основе (патент на изобретение RU 2569002С1). Кормовая добавка состоит из жизнеспособных спор спорообразующих бактерий штамма Bacillus subtilis с титром 2⋅10⁶-6⋅10⁹ КОЕ/г и наполнителя - диатомита в виде обожженной крошки в массовом соотношении 1:10 соответственно. При этом кормовая добавка в составе корма взята при соотношении как 0, 001:1.

Известен пробиотик на основе штамма бактерий Bacillus subtilis MG-8 ВКПМ В-12476 (Патент на изобретение RU 2663720 С1), применяемый для профилактики желудочно-кишечных заболеваний у сельскохозяйственных животных и птиц. Способ применения пробиотика предусматривает введение культуральной жидкости штамма бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-12476 в полнорационный комбикорм сельскохозяйственных животных и птиц.

Известен биопрепарат с пробиотической активностью для оптимизации усвоения кормов, предназначенных для сельскохозяйственных животных и птицы (Патент на изобретение RU 2493723С1). Препарат отличается тем, что в качестве штамма используют бактерии Bacillus cereus 1-79 с титром 3,5⋅10⁹ КОЕ/г - 4,0⋅10⁹ КОЕ/г, суспендированные в питательной среде и обладающие высокой пробиотической активностью.

Известен сухой пробиотик для откорма сельскохозяйственных животных и птицы (Патент на изобретение RU 2711924 С1), представляющий собой лиофилизированную биомассу штамма Enterococcus mundtii ВКПМ В-11828.

Известен биопрепарат - пробиотик на основе штамма Streptococcus faecium ТЕ-17 и способ его получения (Патент на изобретение RU 2217493 С2). Штамм обладает высокой продуктивностью и способностью подавлять патогенную микрофлору. Пробиотик, представляет собой жидкую культуру S. faecium ТЕ-17, биополимеры, карбамид, микроэлементы, стабилизатор, молочную кислоту и воду водопроводную в установленном содержании компонентов.

Задачей настоящего изобретения является разработка новой пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных с высокой антагонистической активностью, обеспечивающей подавление развития патогенных микроорганизмов, способствующей формированию полезной микрофлоры в пищеварительном тракте и обеспечивающей повышение продуктивности сельскохозяйственных животных.

Поставленная задача решается путем создания пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, включающей в себя композицию культур микроорганизмов, состоящую из штаммов лактобацилл Lactobacillus buchneri БХ-99, Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и штамма Bacillus subtilis BS2017, и торфогель, взятых в соотношении 1:1, при этом суммарная концентрация колониеобразующих единиц КОЕ лактобацилл и В. subtilis BS2017 в кормовой добавке должна быть не менее 1,0⋅10⁸ КОЕ/см³.

Для создания пробиотической кормовой добавки были отобраны штаммы Lactobacillus buchneri БХ-99, Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и штамм Bacillus subtilis BS2017, обладающие высокими пробиотическими свойствами и не относящиеся к микроорганизмам, патогенным для человека и животных, согласно классификации, приведенной в Санитарных правилах СП 1.3.2322-08. При этом для повышения эффективности предлагаемой кормовой добавки, в ее состав включен торфогель.

Отобранные штаммы обеспечивают подавление микроорганизмов-возбудителей кишечных токсикоинфекций. При этом совмещение бактерий рода Lactobacillus и вида Bacillus subtilis в бактериальном препарате является эффективным потому, что они могут воздействовать на различные звенья патогенетического процесса. В свою очередь, гуминовые кислоты, содержащиеся в торфогеле, снижают уровень токсинов, улучшают переваривание белка и усвоение кальция, микроэлементов, питательных веществ, кроме того, они имеют свойство образовывать пленку на слизистой оболочке желудочно-кишечного тракта, также защищая организм от инфекций и токсинов. Результатом становится усиление иммунитета животных к болезням, а также увеличение привесов и повышение надоев молока.

Приготовление пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных осуществлялось следующим образом.

Для приготовления смеси микробных культур использовали жидкую питательную среду состава, г/дм³:

Меласса 20,0 см³ MgSO₄⋅7H₂O 1,00 КН₂РО₄ 0,4 NaCl 0,5 СаСО₃ 1,5 KNO₃ 1,0 Дистиллированная вода до 1,0 дм³

Выращивание культур, входящих в состав пробиотической кормовой добавки, осуществляли в указанной жидкой питательной среде в ферментерах емкостью 20,0 дм³. Объем жидкой питательной среды составлял 12,0 дм³.

Для совместного культивирования штаммов лактобацилл Lactobacillus plantarum ПЛ-99, Lactobacillus buchneri БХ-99 и штамма. Bacillus subtilis BS2017 были выбраны условия, при которых сначала идет культивирование лактобацилл при температуре (37±1)°С без аэрации в течение 24 часов, затем добавляется культура В. subtilis BS2017 и идет дальнейшее культивирование при температуре (28±1)°С с аэрацией в течение 24 часов. После получения смеси микробных культур осуществляется ее добавление в торфогель в соотношении 1:1 и их смешение.

При этом перед добавлением полученной смеси микробных культур в торфогель с целью уменьшения в нем количества посторонней микрофлоры может осуществляться пастеризация торфогеля и его последующее охлаждение до рабочей температуры.

Для определения концентрации лактобацилл в готовом препарате проводили высев на плотную питательную среду MRS-4, для определения концентрации В. subtilis - на FT-arap. Концентрации штаммов лактобацилл в готовом препарате составила 8,3 ⋅ 10⁸, концентрация В. subtilis BS2017 - 1,0⋅10⁹. Контроль готового препарата на наличие мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов, количество которых не должно превышать 1,0⋅10³, проводили путем высева на плотную питательную среду FT-агар. Наличие мезофильных аэробных и факультативно анаэробных микроорганизмов обусловлено тем, что в торфогеле после пастеризации остается незначительное количество посторонней микрофлоры.

Характеристика конечного препарата представлена в таблице 1.

Была проведена и оценка антагонистической активности биопрепарата. Оценку антагонистической активности лактобактерий осуществляли с использованием двухслойной методики по Фредерику.

В качестве индикаторных культур для оценки антагонистической активности исследуемых штаммов использовали следующие виды микроорганизмов: Escherichia coli С600, Proteus vulgaris, Salmonella sp, Klebsiella ozaenae, Serratia odorifera biogrup 1, Morganella morgani, выделенные из кишечного содержимого поросят и хранящиеся на кафедре микробиологии ВятГУ.

Индикаторные тест-штаммы, в отношении которых оценивали антагонистическую активность, в течение суток подращивали в мясо-пептонном бульоне, затем добавляли по 0,5 см³ к 2,5 см³ расплавленного и охлажденного до температуры (56±1)°С мясопептонного полужидкого агара, быстро перемешивали и выливали на поверхность чашек с колониями лактобактерий и бацилл. Наклоняя чашку из стороны в сторону, равномерно распределяли полужидкий агар по поверхности чашки Петри. Затем посевы инкубировали в течение 24 ч при температуре (37±1)°С. Антагонистическая активность проявлялась образованием зон ингибирования роста тест-штаммов вокруг колоний лактобактерий и бацилл.

Уровень антагонистической активности оценивали по следующим критериям: нулевая - при ширине зоны отсутствия роста до 1,0 мм, низкая - (1,1-4,9) мм, средняя - (5,0-8,9) мм, высокая - 9,0 мм и более.

Оценку антагонистической активности исследуемых штаммов микроорганизмов осуществляли в условиях in vitro.

Полученные данные представлены в таблице 2.

При оценке подавления роста Bacillus subtilis BS2017 штаммами лактобактерий зоны ингибирования роста отсутствовали, что свидетельствует о том, что штамм Bacillus subtilis и штаммы лактобацилл: Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Lactobacillus buchneri БХ-99 не подавляют рост друг друга и могут быть использованы для приготовления комплексного пробиотического препарата.

В тоже время оценка антагонистической активности в отношении индикаторных культур позволяет сделать заключение, что исследуемые штаммы микроорганизмов способны активно ингибировать рост и размножение энтеробактерий, потенциальных возбудителей инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта животных. Штаммы Lactobacillus plantarum ПЛ-99, Lactobacillus buchneri БХ-99 и Bacillus subtilis BS2017 обладают высокой антагонистической активностью в отношении всех исследуемых индикаторных штаммов.

Была также проанализирована чувствительность исследуемых штаммов микроорганизмов к антибиотикам методом бумажных дисков. Чувствительность исследуемых штаммов определяли к следующим антибиотикам: азитромицину, амикацину, ампицилину, левомицитину, нетилмицину, норфлоксацину, рифампицину, спарфлоксацину, цефтриаксону, тобрамицину.

Полученные результаты представлены в таблице 3.

На основании полученных результатов можно сделать заключение, что штаммы: Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и Bacillus subtilis BS2017 умеренно чувствительны к большинству исследуемых антибиотиков; штамм Lactobacillus buchneri БХ-99 устойчив к 50% исследуемых антибиотиков.

Специфическую безвредность заявляемой пробиотической кормовой добавки определяли на белых мышах в тестах in vivo. Для этого использовали беспородных белых мышей, одного пола, прошедших карантин и ранее не использованных в экспериментах, массой (20±2) г. Препарат вводили по 0,2 см³ перорально при помощи туберкулинового шприца, имеющего на конце иглы оливу, пяти животным, наблюдения за которыми осуществляли в течение 5 суток.

Полученные результаты представлены в таблице 4.

Полученные результаты свидетельствуют, что заявляемая пробиотическая добавка выдержала испытание на специфическую безвредность согласно ГОСТ 31926-2013 «Средства лекарственные для ветеринарного применения. Методы определения безвредности». Также проведенные исследования показали, что разработанный пробиотический препарат не образует токсичные соединения.

Оценку влияния заявляемой пробиотической добавки на лечение кишечных инфекций у телят проводили в производственном сельскохозяйственном кооперативе «Колхоз имени Свердлова», расположенном в Кировской области.

В опыте были задействованы 14 телят в возрасте от 2,5 до 3 месяцев с диарейным синдромом неустановленной этиологии. Про биотическую добавку давали телятам индивидуально в соответствии с «Инструкцией по применению пробиотической добавки для сельскохозяйственных животных».

Результаты испытания заявляемой пробиотической добавки установили его лечебно-профилактическую эффективность при диарейном синдроме у телят.

Оценку влияния пробиотической добавки на привесы телят проводили в производственном сельскохозяйственном кооперативе «ИСТОБЕНСКИЙ» по племенной работе, расположенном в Кировской области.

Результаты проведенных испытаний представлены в таблице 5.

Живая масса телят опытной группы, получавших препарат, на 20 сутки опыта увеличилась на 2,8% по сравнению с контрольной, не получавшей препарат. На 40 и 80 сутки опыта масса телят увеличилась на 6,1% и 14,5% соответственно. С 21 по 40 сутки опыта в опытной группе среднесуточный привес телят увеличился на 14,94% по сравнению с контролем, а с 41 по 80 сутки опыта на 36,59%.

Таким образом, в результате эксперимента, показано положительное влияние заявляемой пробиотической добавки на увеличение привесов телят в условиях проведенного опыта.

Оценку влияния пробиотической добавки на молочную продуктивность и химический состав молока проводили в ООО «Стремиловское отделение отечественного мясомолочного производственного объединения» (ООО «Стремиловское ООММПО») Чеховского района Московской области на высокопродуктивных молочных коровах черно-пестрой голштинизированной породы в период раздоя, по 17 голов в каждой, в среднем 58 дней после отела, разделенных по принципу аналогов на две группы: контрольную и опытную. Коровы 1-й контрольной группы получали рацион, сбалансированный по всем питательным веществам и энергии, который отвечал требованиям суточного удоя на уровне 26-30 кг молока. Животные 2-й опытной группы получали тот же рацион с добавлением 4 см³/гол/сутки новой пробиотической кормовой добавки, разведенной в 1 дм³ воды. Продолжительность научно-хозяйственного опыта составила 90 дней. Животные контрольной и опытной групп были размещены в одном помещении, где им были созданы одинаковые условия кормления и содержания.

Данные по молочной продуктивности и химическому составу молока от животных контрольной группы и получавших в составе рациона пробиотическую кормовую добавку, представлены в таблице 6.

Как видно из данных таблицы 3, несмотря на практически одинаковое потребление кормов, среднесуточный надой молока в опытной группе коров, был выше по сравнению с контролем. В частности, среднесуточные удои натурального молока у коров 2-й опытной группы, получавших 4,0 см³/гол/сутки новой пробиотической кормовой добавки, разведенной в 1,0 дм³ воды, составили 25,58 кг или на 4,4% выше по сравнению с животными контрольной группы. При этом различия, как по валовому, так и среднесуточному удою молока между коровами контрольной и 2-й опытной группы коров были статистически достоверными.

Основным показателем, характеризующим качество молока, является количество жира, белка, лактозы, мочевины и соматических клеток в молоке, что влияет на его реализационную стоимость.

Присутствие в молоке большого количества соматических клеток ведет к серьезному снижению его качественных показателей: теряется биологическая полноценность, ухудшаются технологические свойства при переработке, снижается кислотность молока, отмечаются потери жира, казеина, лактозы. Молоко становится менее термоустойчивым, хуже свертывается сычужным ферментом, замедляется развитие полезных молочнокислых бактерий. Из такого молока невозможно изготовить качественные продукты (сыр, творог, масло, кефир и др.). Соматические клетки влияют не только на оценку качества молока, но и на оценку здоровья коров, их продуктивность.

В молоке высокопродуктивных коров опытной группы, по истечению четырех месяцев после отела, получавших, 4,0 см³/гол/сутки новой пробиотической кормовой добавки количество соматических клеток, составило 73,67 тыс. в 1 см³, что ниже на 62,76 тыс. или в 1,85 раза по сравнению с контролем.

На основании проведенных исследований можно заключить, что обогащение рационов высокопродуктивных коров в период раздоя пробиотической кормовой добавкой имело преимущество перед рационом коров контрольной группы по влиянию на молочную продуктивность и качество молока.

Учитывая вышеизложенное очевидно, что заявляемая новая пробиотическая кормовая добавка для сельскохозяйственных животных обладает высокой антагонистической активностью, обеспечивающей подавление развития патогенных микроорганизмов, способствует формированию полезной микрофлоры в пищеварительном тракте и обеспечивающей повышение продуктивности сельскохозяйственных животных.

Изобретение относится к области микробиологии и биологически активным кормовым добавкам, в частности к пробиотической кормовой добавке для сельскохозяйственных животных. Задачей настоящего изобретения является разработка новой пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных с высокой антагонистической активностью, обеспечивающего подавление микроорганизмов-возбудителей кишечных токсикоинфекций. Поставленная задача решается путем создания пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных, включающей в себя композицию культур микроорганизмов, состоящую из штаммов лактобацилл Lactobacillus buchneri БХ-99, Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и штамма Bacillus subtilis BS2017, и торфогель, взятых в соотношении 1:1, при этом суммарная концентрация колониеобразующих единиц КОЕ в кормовой добавке должна быть не менее 1,0⋅10⁸ КОЕ/см³. Способ получения пробиотической кормовой добавки для сельскохозяйственных животных включает совместное культивирование в жидкой питательной среде штаммов лактобацилл Lactobacillus buchneri БХ-99, Lactobacillus plantarum ПЛ-99 без аэрации в течение 24 часов, последующее добавление штамма Bacillus subtilis BS2017 и дальнейшее культивирование с аэрацией в течение 24 часов, и последующее добавление полученной смеси микробных культур в торфогель в соотношении 1:1 и их смешение. При этом перед добавлением полученной смеси микробных культур в торфогель может осуществляться пастеризация торфогеля и его последующее охлаждение до рабочей температуры. При этом в качестве жидкой питательной среды для культивирования микробных культур может быть использована жидкая питательная среда следующего состава, г/дм³: меласса - 20,0 см³; MgSO₄⋅7H₂O - 1,00; KН₂РО₄ - 0,4; NaCl - 0,5; СаСО₃ - 1,5; KNO₃ - 1,0; дистиллированная вода - до 1,0 дм³. 2 н. и 2 з.п. ф-лы, 6 табл.

1. Пробиотическая кормовая добавка для коров и телят, включающая в себя композицию культур микроорганизмов, состоящую из штаммов лактобацилл Lactobacillus buchneri БХ-99, Lactobacillus plantarum ПЛ-99 и штамма Bacillus subtil is BS 2017, и торфогель, взятых в соотношении 1:1, при этом суммарная концентрация колониеобразующих единиц КОЕ в кормовой добавке должна быть не менее 1,0⋅10⁸ КОЕ/см³.

2. Способ получения пробиотической кормовой добавки для коров и телят по п. 1, включающий совместное культивирование в жидкой питательной среде штаммов лактобацилл Lactobacillus buchneri БХ-99, Lactobacillus plantarum ПЛ-99 без аэрации в течение 24 часов, последующее добавление штамма Bacillus subtilis BS2017 и дальнейшее культивирование с аэрацией в течение 24 часов, и последующее добавление полученной смеси микробных культур в торфогель в соотношении 1:1 и их смешение.

3. Способ получения пробиотической кормовой добавки для коров и телят по п. 2, отличающийся тем, что перед добавлением полученной смеси микробных культур в торфогель осуществляется пастеризация торфогеля.

4. Способ получения пробиотической кормовой добавки для коров и телят по п. 2, отличающийся тем, что в качестве жидкой питательной среды для культивирования микробных культур может быть использована жидкая питательная среда следующего состава, г/дм³:

Меласса 20,0 см³ MgSO₄ ⋅ 7H₂O 1,00 KH₂PO₄ 0,4 NaCl 0,5 СаСО₃ 1,5 KNO₃ 1,0 Дистиллированная вода до 1,0 дм³