ДЛИТЕЛЬНОЕ ВЫСВОБОЖДЕНИЕ НЕЙРЕГУЛИНА ДЛЯ УЛУЧШЕНИЯ СЕРДЕЧНОЙ ФУНКЦИИ Российский патент 2012 года по МПК A61K38/17 A61P9/00 

Перекрестная ссылка на родственные заявки

Эта заявка претендует на преимущество приоритета предварительных патентных заявок в США № 60/755124, зарегистрированной 30 декабря 2005 г., и № 60/758626, зарегистрированной 13 января 2006 г.

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ, К КОТОРОЙ ОТНОСИТСЯ ИЗОБРЕТЕНИЕ

Это изобретение в целом относится к композициям и способам, применяемым для предупреждения, лечения или задержки развития различных сердечных заболеваний или расстройств посредством длительного высвобождения нейрегулина у млекопитающего.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Сердечная (желудочковая) гипертрофия - это важная адаптивная физиологическая реакция на повышенный стресс или потребность в усиленной работе сердца. Одно из ранних изменений на клеточном уровне, которое происходит после стимуляции гипертрофии, - это синтез митохондрий и увеличение в объеме миофибриллярной массы (утолщение стенок) с пропорциональным увеличением размера отдельных клеток, но без увеличения (или с минимальным увеличением) их численности.

Когда желудочек находится в состоянии стресса, первоначальная реакция заключается в увеличении длины саркомера (миофибрилломера). Это сопровождается увеличением общей мышечной массы. Если перегрузка слишком тяжела, то сократимость миокарда угнетается. В самой легкой форме такое угнетение проявляется снижением скорости сокращения ненагруженного миокарда или уменьшением показателя развития силы при изометрическом сокращении. По мере того как угнетение сократимости миокарда нарастает, происходит все более выраженное снижение скорости сокращения ненагруженного миокарда, которое сопровождается снижением развития изометрической силы и изометрического сокращения. На этом этапе еще возможна циркуляторная компенсация за счет расширения сердца и увеличения его мышечной массы с тенденцией к поддержанию стресса стенки на нормальном уровне. По мере дальнейшего падения сократимости развивается выраженная застойная сердечная недостаточность, отражением которой является ослабление сердечного высвобождения, работы миокарда и/или увеличение объема желудочков в конце диастолы, а также артериального давления в состоянии покоя.

Переход от гипертрофии к сердечной недостаточности характеризуется некоторыми изменениями в организации клеток. Например, здоровые гипертрофированные клетки имеют большой размер с увеличенными и хорошо организованными сократительными элементами, а также с сильной адгезией клетки к клетке. В отличие от этого патологически измененные гипертрофированные клетки, для которых также характерен большой размер и накопление белков, проявляют дезорганизацию сократительных белков (беспорядочность саркомерных структур) и ослабленную адгезию клетки к клетке (беспорядочность миофибрилл). Таким образом, при патологической гипертрофии увеличение размера клеток и накопление сократительных белков сочетаются с дезорганизацией сообщества саркомерных структур и утратой тесного взаимодействия между клетками.

Сердечной недостаточностью поражены приблизительно пять миллионов американцев, и это патологическое состояние ежегодно диагностируется более чем у 550000 новых больных. Современная лекарственная терапия при сердечной недостаточности связана, прежде всего, с применением ингибиторов ангиотензин-конвертирующего фермента (ACE), которые действуют как вазодилататоры, заставляющие расширяться кровеносные сосуды, снижающие артериальное давление и уменьшающие рабочую нагрузку сердца. Хотя достигнутое значительное снижение процентных показателей смертности статистически значимо, его фактическая величина при использовании ингибиторов ACE составляет только 3-4%, причем для этих препаратов характерны некоторые побочные эффекты.

Ингибиторы ACE также применяли в комбинации с другими лекарствами, например, с препаратами наперстянки, способствующими увеличению силы сердечных сокращений, и/или с диуретиками, которые помогают снизить рабочую нагрузку на сердце, заставляя почки выводить из кровотока больше натрия и воды. Однако, по меньшей мере, одно исследование продемонстрировало отсутствие различий в показателях выживания больных с сердечной недостаточностью II-III класса при сравнении препаратов наперстянки с плацебо. Кроме того, диуретики, хотя и могут улучшать некоторые симптомы сердечной недостаточности, непригодны в качестве единственного способа лечения.

Другие варианты профилактики или лечения сердечной недостаточности связаны с дополнительными ограничениями. Например, пересадка сердца, очевидно, стоит намного дороже, чем лекарственная терапия, связана с инвазией, а ее дополнительным ограничением является проблема доступности донорских сердец. Применение механических устройств, например, бивентрикулярных (двухжелудочковых) водителей сердечного ритма почти так же дорого и инвазивно. Таким образом, принимая во внимание недостатки современных подходов к лечению, мы ощущаем явную потребность в новых способах терапии.

Новый перспективный способ терапии основан на введении больному с повышенным риском развития сердечной недостаточности нейрегулина (далее в тексте "NRG").

Различные варианты NRG представляют собой семейство структурно родственных факторов роста и дифференцировки, в состав которого входят NRG1, NRG2, NRG3 и NRG4, а также их изоформы. Например, было идентифицировано более 15 различных изоформ NRG1, которые на основании различий в последовательности их важных доменов, аналогичных эпидермальному фактору роста (EGF), разделены на две большие группы, известные как типы альфа и бета.

NRG связываются с семейством рецепторов EGF, включающим EGFR, ErbB2, ErbB3 и ErbB4, причем каждый из этих рецепторов играет важную роль во многих клеточных функциях, включая рост, дифференцировку и выживание клеток. Это - белковые рецепторы тирозинкиназы, состоящие из внеклеточного лиганд-связывающего домена, трансмембранного домена и цитоплазматического тирозинкиназного домена. После того как NRG связывается с внеклеточным доменом ErbB3 или ErbB4, он индуцирует конформационное изменение, которое приводит к образованию гетеродимера между ErbB3, ErbB4 и ErbB2 или образованию гомодимера между ErbB4 с самим собой, а они, в свою очередь, приводят к фосфорилированию C-концевого домена рецептора внутри клеточной мембраны. Затем фосфорилированный внутриклеточный домен связывается с дополнительными сигнальными белками внутри клетки, активируя соответствующий нижерасположенный сигнальный путь AKT или ERK и индуцируя серию клеточных реакций, в частности стимуляцию или депрессию клеточной пролиферации, клеточной дифференцировки, клеточного апоптоза, клеточной миграции или клеточной адгезии. Из этих рецепторов в сердце экспрессируются, главным образом, ErbB2 and ErbB4.

Было показано, что EGF-подобные домены NRG1, размер которых варьируется от 50 до 64 аминокислот, достаточны для связывания с этими рецепторами и их активации. Предыдущие исследования показали, что нейрегулин-1β (NRG-1β) может прямым образом связываться с ErbB3 и ErbB4, проявляя высокую аффинность к ним. Рецептор-сирота ErbB2 может образовывать гетеродимер с ErbB3 или ErbB4, обладающий более высокой аффинностью, чем гомодимеры ErbB3 или ErbB4. Исследования развития нервной системы показали, что для образования симпатической нервной системы требуется интактная сигнальная система NRG-1β, ErbB2 и ErbB3. Прицельное разрушение NRG-1β или ErbB2, или ErbB4 приводит к эмбриональной летальности вследствие пороков развития сердца. Недавние исследования также высветили роль NRG-1β, ErbB2 и ErbB4 в развитии сердечно-сосудистой системы, а также в поддержании нормальной функции сердца у взрослых. Было показано, что NRG-1β улучшает организацию саркомеров в кардиомиоцитах взрослых. По результатам экспериментальных исследований на трех разных животных моделях сердечной недостаточности краткосрочное введение рекомбинантного EGF-подобного домена NRG-1β улучшает работоспособность миокарда или защищает животных от ее ухудшения.

Более важно, что NRG-1β значительно продлевает выживание животных с сердечной недостаточностью. Эти эффекты делают NRG-1β многообещающим терапевтическим средством широкого спектра действия, которое можно применять для лечения и/или профилактики сердечной недостаточности, которую вызывают многие распространенные заболевания. Однако, по-прежнему, имеется потребность в более эффективных способах применения NRG, который можно использовать в клинической практике для профилактики, лечения или задержки развития сердечной недостаточности и/или гипертрофии сердца.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Длительное высвобождение NRG значительно улучшает эффект NRG при лечении сердечной недостаточности и гипертрофии сердца по сравнению с другими способами введения NRG. Длительное высвобождение NRG также связано с тем преимуществом, что при этом способе снижаются побочные эффекты NRG по сравнению с другими способами его введения. Таким образом, настоящее изобретение относится к композициям и способам для предупреждения, лечения или задержки развития различных сердечных заболеваний или расстройств у млекопитающих, особенно у человека, причем эти композиции и способы основаны на пролонгировании высвобождения белка NRG или его функционального фрагмента, либо нуклеиновой кислоты, кодирующей белок NRG или его функциональный фрагмент, либо агента, который улучшает выработку и/или функцию указанного NRG.

В первом аспекте изобретения предлагается способ для предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего, причем указанный способ включает длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего, которое нуждается в таком вмешательстве.

В одном из вариантов реализации способа предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего приводит к непрерывной активации сигнального пути ERK в клетках сердца.

В другом варианте реализации способа предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего, нуждающегося в этом, длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего приводит к непрерывной активации сигнального пути AKT в клетках сердца.

Еще в одном варианте реализации способа предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего, нуждающегося в этом, длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего улучшает показатели EF и/или FS левого желудочка сердца у этого млекопитающего.

Еще в одном варианте реализации способа предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего, нуждающегося в этом, длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего предотвращает гипертрофию сердца.

В настоящем изобретении можно применять любую технологию длительного высвобождения, известную в данной области знаний, включая, но не ограничиваясь ими, осмотический насос или шприцевой насос, объединение с полиэтиленгликолем ("PEG") и/или упаковку в липосомы либо микросферы.

Во втором аспекте изобретения предлагается способ для снижения внутреннего диаметра левого желудочка, причем указанный способ включает длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего, которое нуждается в таком вмешательстве. В одном из предпочтительных вариантов реализации изобретения длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижает показатель LVEDD более чем приблизительно на 2%. Более предпочтительно, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVEDD более чем приблизительно на 5%. Предпочтительнее, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVEDD более чем приблизительно на 10%. Еще предпочтительнее, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVEDD более чем приблизительно на 15%. Наиболее предпочтительно, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVEDD более чем приблизительно на 20%.

В другом предпочтительном варианте реализации изобретения длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижает показатель LVESD более чем приблизительно на 2%. Более предпочтительно, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижал показатель LVESD более чем приблизительно на 5%. Предпочтительнее, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVESD более чем приблизительно на 10%. Еще предпочтительнее, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVESD более чем приблизительно на 15%. Наиболее предпочтительно, чтобы длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего снижало показатель LVESD более чем приблизительно на 20%.

В третьем аспекте изобретения предлагается способ для стимуляции роста и/или дифференцировки кардиомиоцитов, причем указанный способ включает длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего, которое нуждается в таком вмешательстве. Этот способ связан с активацией пути MAP киназы в клетках сердца, что вызывает рост и/или дифференцировку кардиомиоцитов.

В четвертом аспекте изобретения предлагается способ для индуцирования реконструкции саркомерных и цитоскелетных структур мышечных клеток или межклеточной адгезии, причем указанный способ включает длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего, которое нуждается в таком вмешательстве. Этот способ связан с активацией пути MAP киназы в клетках сердца, что вызывает реконструкцию клеточных структур или усиливает межклеточную адгезию.

В пятом аспекте изобретения предлагается способ для лечения или предупреждения диссоциации межклеточной адгезии в мышечных клетках сердца и/или беспорядка саркомерных структур, причем указанный способ включает длительное высвобождение NRG в организме млекопитающего, нуждающегося в таком вмешательстве.

Кроме того, поскольку взаимодействие NRG с рецепторами ErbB, согласно известным данным, играет определенную роль при других заболеваниях и расстройствах, длительное высвобождение NRG также способно значительно улучшить эффект NRG при лечении таких заболеваний и расстройств по сравнению с другими способами введения NRG. Таким образом, настоящее изобретение также относится к композициям и способам для предупреждения, лечения или задержки развития различных заболеваний или расстройств у млекопитающих, особенно у человека, причем эти композиции и способы основаны на пролонгировании высвобождения белка NRG или его функционального фрагмента, либо нуклеиновой кислоты, кодирующей белок NRG или его функциональный фрагмент, либо агента, который улучшает выработку и/или функцию указанного NRG. Такие заболевания и расстройства в целом включают заболевания и расстройства центральной и периферической нервной системы. Конкретные примеры других заболеваний и расстройств включают различные сердечно-сосудистые заболевания, рак, заболевания нервной системы и/или мышечные заболевания, включая мышечные дистрофии (например, Дюшенна, поясов конечностей), а также рассеянный склероз, спинальные травмы, болезни глаза и уха, диабет, шизофрению и болезнь Альцгеймера.

Изобретение также предлагает композицию или лекарственный состав NRG для предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего. В одном из вариантов реализации изобретения указанная композиция или лекарственный состав обеспечивают непрерывную активацию сигнального пути ERK в клетках сердца. В другом варианте реализации изобретения указанная композиция или лекарственный состав обеспечивают непрерывную активацию сигнального пути AKT в клетках сердца. Еще в одном варианте реализации изобретения указанная композиция или лекарственный состав улучшают показатели EF и/или FS у млекопитающего. Еще в одном варианте реализации изобретения указанная композиция или лекарственный состав предупреждают гипертрофию сердца. Указанная композиция или лекарственный состав могут быть основаны на использовании любой технологии пролонгированного высвобождения, известной в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, осмотический насос или шприцевой насос, объединение с полиэтиленгликолем (PEG) и/или упаковку в липосомы или микросферы.

Изобретение также включает набор, содержащий указанную композицию или лекарственный состав, который основан на использовании любой технологии длительного высвобождения, известной в данной области техники, включая, но не ограничиваясь ими, осмотический насос или шприцевой насос, объединение с полиэтиленгликолем (PEG) и/или упаковку в липосомы или микросферы. В некоторых вариантах реализации изобретения набор дополнительно включает инструкцию по применению композиции или лекарственного состава NRG, основанных на технологии длительного высвобождения, для предупреждения, лечения или задержки развития сердечной недостаточности у млекопитающего, для предупреждения, лечения или задержки развития гипертрофии сердца у млекопитающего или для уменьшения внутреннего диаметра левого желудочка у млекопитающего.

Эти и другие аспекты, цели, преимущества и признаки настоящего изобретения будут ясны компетентным специалистам, которые ознакомятся с его раскрытием, более подробно представленным ниже.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

Фиг.1 показывает фосфорилирование AKT и ERK в левом желудочке у крыс в зависимости от времени после введения NRG посредством внутримышечной инъекции, внутривенной инъекции и внутривенного вливания при проведении теста на толерантность к глюкозе. "P-AKT", "P-ERK" и "NRG" означают фосфорилированный AKT, фосфорилированный ERK и нейрегулин, а "im", "iv" и "ivgtt" означают внутримышечную инъекцию, внутривенную инъекцию и внутривенный тест на толерантность к глюкозе, соответственно.

Фиг.2 показывает гель, окрашенный BaI₂ для выявления PEG. На этой фигуре "смесь" означает смесь раствора PEG и NRG после их реакции. "M", "пик1", "пик2" и "пик3" означают маркер белка и пиковые фракции элюирования 1, 2 и 3 для смеси из колонки S100. "NRG-моно-PEG", "NRG-ди-PEG" и "NRG-поли-PEG" означают объединение NRG с одним PEG, двумя PEG и несколькими PEG (по меньшей мере, тремя), соответственно.

Фиг.3 показывает гель с окраской кумасси для выявления белка NRG. Сокращения соответствуют таковым на фиг.2. На дорожке M молекулярная масса каждой полосы (снизу вверх) равна 14,4 кДа, 20,1 кДа, 31,0 кДа, 43,0 кДа, 66,2 кДа и 97,4 кДа, соответственно.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Хотя в практике настоящего изобретения можно использовать любые способы, аналогичные или эквивалентные описанным в этой заявке, предпочтительные способы и материалы описаны именно здесь.

Настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики сердечной недостаточности или гипертрофии сердца у млекопитающего посредством длительного высвобождения NRG в постоянном или вариабельном количестве. Предпочтительным млекопитающим является больной человек, страдающий сердечной недостаточностью или имеющий повышенный риск ее развития.

Для большей ясности раскрытия изобретения, но не ради ограничений, дальнейшие подробности в описании изобретения представлены в виде подразделов, которые следуют ниже. Все упомянутые здесь публикации включены в качестве ссылок для раскрытия и описания способов и/или материалов, применительно к которым эти публикации цитируются.

A. Определения

При отсутствии иных определений все использованные здесь технические и научные термины имеют общепринятое значение в понимании среднего специалиста, к которым относится это изобретение. Все патенты, патентные заявки, опубликованные заявки и другие публикации, упоминаемые здесь, включены в качестве ссылок во всей своей полноте. Если определение, изложенное в этом разделе, противоречит или как-либо иначе отличается от определения, изложенного в патентах, патентных заявках, опубликованных заявках и других публикациях, включенных сюда в качестве ссылок, определение, изложенное в нашей заявке, имеет преимущественную силу по сравнению с определением, приведенным в ссылке.

При использовании здесь формы единственного числа означают "по меньшей мере, один" либо "один и более" объектов описания, если из контекста явно не следует иное.

При использовании здесь термин "нейрегулин" или "NRG", применяемый в настоящем изобретении, относится к белкам или пептидам, которые могут связывать и активировать ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинации, включая, но не ограничиваясь ими, все изоформы нейрегулина, только домен EGF нейрегулина, полипептиды, содержащие EGF-подобный домен нейрегулина, мутанты или дериваты нейрегулина, а также любые продукты нейрегулин-подобного гена, которые способны активировать вышеуказанные рецепторы, что будет в подробностях описано ниже. В предпочтительных вариантах реализации нейрегулин, применяемый в настоящем изобретении, связывается с гетеродимерами ErbB2/ErbB4 или ErbB2/ErbB3 и активирует их. Нейрегулин также включает белки NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4, а также пептиды, фрагменты и соединения, которые имитируют активность нейрегулина. Нейрегулин, применяемый в настоящем изобретении, может активировать вышеуказанные рецепторы ErbB и модулировать их биологические реакции, например, стимулировать дифференцировку клеток рака молочной железы и секрецию молочного протеина, индуцировать дифференцировку клетки нервного гребешка в клетку Шванна, стимулировать синтез рецепторов ацетилхолина в клетках скелетных мышц и/или улучшать дифференцировку кардиоцитов, их выживание и синтез ДНК в этих клетках. Нейрегулин также включает варианты с такими консервативными замещениями аминокислот, которые несущественно изменяют его биологическую активность. Подходящие консервативные замещения аминокислот известны компетентным специалистам и, как правило, могут быть произведены без изменения биологической активности полученной в результате молекулы. Компетентные специалисты поймут, что единичные замещения аминокислот в несущественных регионах полипептида, как правило, незначительно изменяют его биологическую активность (см., например, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224).

Термин "белок нейрегулин" охватывает как белковую, так и полипептидную сущность нейрегулина. Термин "нуклеиновая кислота нейрегулина" охватывает как нуклеиновую кислоту нейрегулина, так и олигонуклеотид нейрегулина.

При использовании здесь термин "домен, подобный эпидермальному фактору роста" или "EGF-подобный домен" относится к полипептидному мотиву, кодируемому геном нейрегулина, который связывается с ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинациями, активируя их, и обладает структурным сходством с доменом, связывающим рецептор EGF, как раскрыто в ссылках WO 00/64400, Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); патенты США №№ 5530109 и 5716930; Hijazi et al., Int. J. Oncol., 13:1061-1067 (1998); Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997); Higashiyama et al., J. Biochem., 122:675-680 (1997); а также WO 97/09425. Содержание всех этих материалов включено сюда в качестве ссылки. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен связывается с гетеродимерами ErbB2/ErbB4 или ErbB2/ErbB3, активируя их. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен включает аминокислотную последовательность домена NRG-1, которая связывается с рецептором. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен включает аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам NRG-1 177-226, 177-237 или 177-240. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен включает аминокислотную последовательность домена NRG-2, связывающегося с рецептором. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен включает аминокислотную последовательность домена NRG-3, связывающегося с рецептором. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен включает аминокислотную последовательность домена NRG-4, связывающегося с рецептором. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен включает аминокислотную последовательность Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro, как это описано в патенте США № 5834229.

При использовании здесь терминологическое понятие "эффективное количество" активного агента для лечения конкретного заболевания означает такое количество, которое достаточно для улучшения или некоторого ослабления симптомов, связанных с этим заболеванием. Эффективное количество (активного агента) может излечить заболевание, но обычно применяется для облегчения симптомов этого заболевания.

При использовании здесь терминологическое понятие "активный агент" означает любое вещество, предназначенное для диагностики, лечения, смягчения или предупреждения заболевания у человека и других животных либо, выражаясь иначе, для улучшения их физического и психического состояния и самочувствия.

При использовании здесь понятие "улучшение" симптомов конкретного заболевания посредством введения конкретного активного агента относится к любому уменьшению, постоянному или временному, продолжительному или преходящему, которое можно приписать введению указанного агента или связать с ним.

При использовании здесь термины "лечить", "лечение" и "терапия" относятся к любому вмешательству, которое способствует улучшению или любому другому положительному изменению симптомов заболевания, расстройства или патологического состояния. Эффект вмешательства может быть профилактическим в смысле полного или частичного предупреждения заболевания или его симптомов, а также может быть терапевтическим в смысле полного или частичного излечения заболевания и/или устранения неблагоприятного эффекта, который можно приписать этому заболеванию. Лечение также охватывает любое фармацевтическое применение композиций, относящихся к этому изобретению.

При использовании здесь термин "вектор (или плазмида)" относится к дискретным элементам, применяемым для введения в клетки гетерологичной ДНК либо для ее экспрессии, либо для ее репликации. Выбор и применение таких носителей хорошо известны компетентным специалистам. Понятие "вектор экспрессии" включает векторы, способные экспрессировать ДНК, которые функционально сцеплены с регуляторными последовательностями, например, с промоторными регионами, причем указанные промоторы способны осуществлять экспрессию указанных фрагментов ДНК. Таким образом, понятие "вектор экспрессии" относится к рекомбинантным конструкциям ДНК или РНК, например к плазмидам, фагам, рекомбинантным вирусам или другим векторам, которые при введении в соответствующую клетку хозяина инициируют экспрессию клонированной ДНК. Подходящие векторы экспрессии хорошо известны компетентным специалистам и включают те векторы, которые способны реплицироваться в эукариотических и/или прокариотических клетках, те, которые остаются эписомными, или те, которые интегрируются в геном клетки хозяина.

При использовании здесь понятие "дифференцировка мышечных клеток сердца" означает состояние, характеризующееся понижением синтеза ДНК более чем на 10%, ингибирование другого фактор-стимулирующего синтеза ДНК более чем на 10%, хорошо организованными саркомерными структурами, выраженной межклеточной адгезией, непрерывной активацией MAP киназ и усиленной экспрессией p21^c1p1. Дальнейшее обсуждение этого вопроса представлено в документе WO00/37095, содержание которого включено сюда в качестве ссылки во всей полноте.

При использовании здесь понятие "фракция высвобождения" или "EF" означает часть крови, которая выталкивается из наполненного желудочка в результате сердечного сокращения. Ее можно определить по следующей формуле:

(диастолический объем левого желудочка [LV] - систолический объем LV)   диастолический объем LV  

При использовании здесь терминологическое понятие "фракция сокращения" или "FS" означает соотношение величин диаметра левого желудочка в сокращенном и расслабленном состояниях. Этот коэффициент можно определить по следующей формуле:

При использовании здесь терминологическое понятие "сердечная недостаточность" означает нарушение сердечной функции, при котором сердце перекачивает кровь в недостаточном количестве для удовлетворения потребностей метаболизирующих тканей. Сердечная недостаточность включает широкий диапазон патологических состояний, таких как застойная сердечная недостаточность, инфаркт миокарда, тахиаритмия, семейная гипертрофическая кардиомиопатия, миокардит и т.п. Сердечная недостаточность может быть обусловлена множеством факторов, включая (без ограничений) ишемические, врожденные, ревматические или идиопатические формы. Хроническая гипертрофия сердца - это выраженное патологическое состояние, которое считается предшественником застойной сердечной недостаточности и остановки сердца.

При использовании здесь терминологическое понятие "инфаркт миокарда" относится к непроходимости коронарной артерии или нарушению кровоснабжения сердечной мышцы, которые приводят к очаговому некрозу части миокарда за счет тяжелой и длительной ишемии. При использовании здесь терминологическое понятие "длительное высвобождение" относится к созданию непрерывного терапевтического уровня активного агента (например, нейрегулина) на протяжении определенного времени. Длительное высвобождение включает (без ограничений) различные формы высвобождения, например непрерывное высвобождение, управляемое высвобождение, замедленное высвобождение, высвобождение из депо, постепенное высвобождение, долговременное высвобождение, запрограммированное высвобождение, пролонгированное высвобождение, пропорциональное высвобождение, растянутое высвобождение, высвобождение из хранилища, медленное высвобождение, высвобождение с промежутками, замедленное высвобождение, временную оболочку, высвобождение, спланированное по времени, замедленное действие, длительное действие, действие с отсрочкой по времени, пролонгированное действие, повторное действие, медленное действие, непрерывное действие, применение лекарств с непрерывным действием и контролируемое высвобождение. Возможность получить длительное высвобождение, управляемое высвобождение, высвобождение, спланированное по времени, постоянное высвобождение, замедленное высвобождение, длительное действие, пульсирующую доставку или немедленную доставку может быть реализована на основе хорошо известных процедур и методик, которые вполне доступны среднему специалисту.

Длительность времени, на протяжении которого происходит высвобождение активного агента, зависит от характеристик активного агента и от использованной технологии (или технологий) длительного высвобождения, но в любом случае это время превышает время воздействия активного агента при его введении без технологии (или технологий) длительного высвобождения.

При использовании здесь термин "микросфера" является синонимом терминов "микрочастица", "микрокапсула", "наносфера", "наночастица" и "нанокапсула", если из контекста явно не следует иное.

При использовании здесь термин "пэгилат" означает активный агент или другую молекулу с присоединением, по меньшей мере, одной молекулы поли(этиленгликоля) или, по меньшей мере, одного деривата поли(этиленгликоля).

При использовании здесь терминологическое определение "упорядоченная или улучшенная организация саркомеров или саркомерных структур" означает состояние, характеризующееся прямым рядом сократительных белков, что выявляется иммунофлуоресцентным окрашиванием α-актинина в клетках сердечных мышц. Прямой ряд α-актининовых белков в клетках можно распознать визуально при помощи микроскопии и микрофотографий. При использовании здесь терминологическое определение "дезорганизованный или расстроенный ряд саркомеров или саркомерных структур" означает противоположность "упорядоченной или улучшенной организации саркомеров или саркомерных структур".

При использовании здесь терминологическое определение "упорядоченная или улучшенная организация цитоскелетных структур" означает состояние, характеризующееся прямыми волокнами актина, выявляемыми при окрашивании мышечных клеток сердца фаллоидином. Прямые волокна актина в клетках можно распознать визуально при помощи микроскопии и микрофотографий, которые приведены в виде иллюстративных примеров в этом описании. При использовании здесь терминологическое определение "дезорганизованные или расстроенные цитоскелетные структуры" означает противоположность "упорядоченной или улучшенной организации цитоскелетных структур".

При использовании здесь термин "белок" является синонимом терминов "полипептид" или "пептид", если из контекста явно не следует иное.

При использовании здесь терминологическое определение "непрерывная активация MAP киназ" означает, что фосфорилированное состояние MAP киназ (p42/44) в клетках поддерживается, по меньшей мере, 21 час. Дальнейшее обсуждение этого вопроса представлено в документе WO00/37095, содержание которого включено сюда в качестве ссылки.

Термины "синергизм, "синергический эффект" и т.п. используются здесь для описания улучшенных эффектов лечения, полученных при комбинировании одного или более терапевтических агентов с одним или более соединений ретиноевой кислоты. Хотя синергический эффект в некоторых сферах знаний означает более чем аддитивный (например, 1+1=3), в области медицинской терапии синергическим может быть аддитивный (1+1=2) и даже менее чем аддитивный (1+1=1,6) эффект. Например, если два лекарства при их индивидуальном применении подавляли развитие гипертрофии мышечных клеток на 50%, не следует ожидать, что при комбинированном применении они полностью остановят развитие гипертрофии мышечных клеток в желудочках сердца. Во многих случаях два лекарства нельзя вводить вместе из-за недопустимых побочных эффектов. В других ситуациях лекарства противодействуют друг другу и при совместном применении замедляют развитие гипертрофии мышечных клеток менее чем на 50%. Таким образом, принято говорить, что синергический эффект получают в том случае, если два лекарства замедляют развитие гипертрофии в мышечных клетках желудочков более чем на 50%, не вызывая при этом недопустимого нарастания неблагоприятных побочных эффектов.

При использовании здесь терминологическое определение "гипертрофия сердца" означает состояние, характеризующееся увеличением размеров отдельных мышечных клеток желудочков, причем это увеличение размеров достаточно для установления клинического диагноза у больного или для визуального распознавания того, что клетки стали больше (например, увеличились по сравнению с не гипертрофированными клетками в 2 раза или более). Это явление может сопровождаться накоплением сократительных белков в отдельных клетках сердца и активацией экспрессии эмбриональных генов.

Известны способы обнаружения гипертрофии мышечных клеток желудочков in vitro и in vivo. Анализы in vitro на гипертрофию мышечных клеток желудочков включают методы, описанные в документе WO00/37095, например, увеличение размеров клеток и усиление экспрессии натрийуретического фактора предсердий (ANP). Изменения в размерах клеток используют в балльной системе для определения степени гипертрофии. Эти изменения наблюдают под инвертированным фазово-контрастным микроскопом, а степень гипертрофии оценивают в баллах по произвольной шкале от 7 до 0, где 7 соответствует полностью гипертрофированным клеткам, а 3 - не стимулированным клеткам. Состояния 3 и 7 можно увидеть в ссылке Simpson et al. (1982) Circulation Res. 51:787-801, фиг.2, A и B, соответственно. Было продемонстрировано, что корреляция между балльной оценкой гипертрофии и площадью поверхности клетки (мкм²) носит линейный характер (коэффициент корреляции=0,99). При гипертрофии, индуцированной фенилэфрином, не экспонированные (нормальные) клетки имеют балльную оценку по шкале гипертрофии 3 при площади поверхности (на одну клетку) 581 мкм², а полностью гипертрофированные клетки имеют балльную оценку по шкале гипертрофии 7 при площади поверхности (на одну клетку) 1811 мкм², т.е. приблизительно 200% по сравнению с нормой. Клетки с балльной оценкой гипертрофии имеют площадь поверхности (на одну клетку) 771 мкм², т.е. их размер увеличен приблизительно на 30% по сравнению с не экспонированными клетками; клетки с балльной оценкой гипертрофии 5 имеют площадь поверхности (на одну клетку) 1109 мкм², т.е. их размер увеличен приблизительно на 90% по сравнению с не экспонированными клетками; а клетки с балльной оценкой гипертрофии 6 имеют площадь поверхности (на одну клетку) 1366 мкм², т.е. их размер увеличен приблизительно на 135% по сравнению с не экспонированными клетками. Гипертрофия мышечных клеток желудочков предпочтительно включает увеличение размеров этих клеток примерно на 15% (балльная оценка гипертрофии 3,5) или более. Индукторы гипертрофии отличаются друг от друга по способности индуцировать максимальную гипертрофическую реакцию, которая ранжируется в баллах согласно описанной выше аналитической методике. Например, максимальное увеличение размеров клеток, индуцированное эндотелином, приблизительно соответствует балльной оценке 5.

При использовании здесь терминологическое определение "супрессия гипертрофии сердца" означает уменьшение показателей, свидетельствующих о гипертрофии, по сравнению с гипертрофическим состоянием, или о предупреждении роста одного из показателей, свидетельствующих о гипертрофии, по сравнению с нормальным состоянием. Например, супрессию гипертрофии мышечных клеток желудочков можно измерить как уменьшение размеров клеток по сравнению с гипертрофическим состоянием. Супрессия гипертрофии мышечных клеток желудочков означает снижение размеров этих клеток на 10% или более по сравнению с гипертрофическим состоянием. В предпочтительном варианте супрессия гипертрофии означает снижение размеров клеток на 30% или более, а в самом предпочтительном - снижение размеров клеток на 50% или более. По сравнению с балльными оценками гипертрофии при использовании фенилэфрина в качестве индуцирующего агента эти процентные показатели снижения коррелируются с величинами 6,5 или менее, 5,0-5,5 и 4,0-5,0, соответственно. Если в качестве индуктора используется другой агент, то супрессию оценивают по отношению к максимальному размеру клеток (или балльной оценке гипертрофии), измеренному при наличии этого индуктора.

Предупреждение гипертрофии мышечных клеток желудочков определяют по отсутствию увеличения размеров клеток при сравнении с нормой (в присутствии такой концентрации индуктора, которая достаточна для полной индукции гипертрофии). Например, предупреждение гипертрофии означает увеличение размеров клеток менее чем до 200% по сравнению с не индуцированными клетками в присутствии максимально стимулирующей гипертрофию концентрации индуктора. В предпочтительном варианте предупреждение гипертрофии означает увеличение размеров клеток менее чем на 135% по сравнению с не индуцированными клетками, а в наиболее предпочтительном варианте предупреждение гипертрофии означает увеличение размеров клеток менее чем на 90% по сравнению с не индуцированными клетками. Применительно к аналитическим балльным оценкам гипертрофии при использовании фенилэфрина в качестве индуцирующего агента предупреждение гипертрофии в присутствии максимально стимулирующей концентрации фенилэфрина означает балльные оценки 6,0-6,5, 5,0-5,5 и 4,0-4,5, соответственно.

Определение гипертрофии in vivo может включать измерение таких сердечно-сосудистых показателей как артериальное давление, частота сердечных сокращений, системное сосудистое сопротивление, сократимость, сила сердечных сокращений, концентрическая или расширенная гипертрофия, систолическое давление в левом желудочке, среднее давление в левом желудочке, давление в левом желудочке в конце диастолы, сердечный выброс, ударный индекс, гистологические параметры, а также размер желудочков и толщина их стенок. Животные модели, пригодные для определения развития и супрессии гипертрофии мышечных клеток in vivo, включают мышиную модель перегрузки давлением, мышиную дисфункциональную модель RV, трансгенную мышиную модель и крысиную постинфарктную модель. Известны также медицинские способы для оценки наличия, развития и супрессии гипертрофии мышечных клеток у больных людей, которые включают, например, измерение диастолических и систолических параметров, оценки массы желудочков и показатель кровотока в легочной вене.

Гипертрофия может быть обусловлена любой причиной, которая связана с реакцией на ретиноевую кислоту, включая врожденные, вирусные, идиопатические, кардиотрофические или миотрофические причины, а также быть результатом ишемии или ишемических повреждений, например, инфаркта миокарда. Типичное лечение проводят для того, чтобы остановить или замедлить прогрессирование гипертрофии, особенно после повреждения сердца, например, в результате ишемии. В предпочтительном варианте при лечении инфаркта миокарда агент (агенты) назначают и вводят сразу же после инфаркта миокарда для предупреждения или уменьшения гипертрофии.

При использовании здесь термин "единица активности" или "IU" означает такое количество стандартного продукта, которое индуцирует реакцию в размере 50% от максимума. Другими словами, для определения единицы активности данного активного агента необходимо измерить величину EC50. Например, если показатель EC50 для партии продукта составляет 0,067 мкг/мл, то это и есть одна единица активности. Далее из этого следует, что 1 мкг этого продукта соответствует 14,93 единиц (1/0,067). Величину EC50 можно определить любым способом, известным в данной области знаний, включая способ, использованный авторами этого изобретения в приведенных ниже примерах. Определение единицы активности важно с позиций контроля качества продуктов генной инженерии и лекарств, применяемых в клинической практике, поскольку оно проводится при тестировании разных фармацевтических средств и/или разных партий одного и того же продукта, который должен выдерживать однородные количественные критерии.

В некоторых вариантах реализации изобретения единицу активности нейрегулина определяют, измеряя активность нейрегулина посредством твердофазного иммуноферментного анализа с активацией рецепторов киназы (KIRA-ELISA), что подробно описано ниже в примере 6, а также в публикациях WO03/099300 и Sadick et ah, 1996, Analytical Biochemistry, 235:207-14, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте. Вкратце, этот анализ измеряет индуцированную нейрегулином активацию ErbB2 и фосфорилирование присоединенной клеточной линии рака молочной железы MCF-7. Мембранные белки растворяют в агенте для лизиса Triton X-100, а рецептор захватывают в лунках планшета ELISA, покрытых ErbB2-специфичными антителами (например, H4), которые не дают перекрестной реакции с ErbB3 или ErbB4. Затем степень фосфорилирования рецептора определяют количественно посредством ELISA с антифосфотирозином.

B. Нейрегулин

Настоящее изобретение предлагает способы лечения или профилактики сердечной недостаточности или гипертрофии сердца у млекопитающего посредством длительного высвобождения NRG в постоянном или вариабельном количестве. В практике этого изобретения может быть использован любой NRG (например, NRG-1, NRG-2, NRG-3 и NRG-4, а также их изоформы) в виде белка, пептида или фрагмента.

Нейрегулин или NRG относится к белкам или пептидам, которые могут связывать и активировать ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинации, включая, но не ограничиваясь ими, все изоформы нейрегулина, только домен EGF нейрегулина, полипептиды, содержащие EGF-подобный домен нейрегулина, мутанты или дериваты нейрегулина, а также любые продукты нейрегулин-подобного гена, которые способны активировать вышеуказанные рецепторы, что будет в подробностях описано ниже. В предпочтительных вариантах реализации нейрегулин, применяемый в настоящем изобретении, связывается с гетеродимерами ErbB2/ErbB4 или ErbB2/ErbB3 и активирует их. Нейрегулин, применяемый в настоящем изобретении, может активировать вышеуказанные рецепторы ErbB и модулировать их биологические реакции, например, стимулировать дифференцировку клеток рака молочной железы и секрецию молочного протеина, индуцировать дифференцировку клетки нервного гребешка в клетку Шванна, стимулировать синтез рецепторов ацетилхолина в клетках скелетных мышц и/или улучшать дифференцировку кардиоцитов, их выживание и синтез ДНК в этих клетках. В данной области знаний известны анализы для измерения активности связывания рецепторов. Например, можно использовать клетки, трансфицированные рецептором ErbB-2 и ErbB-4. После инкубации клеток, экспрессирующих рецептор, с избыточным количеством радиоактивно меченого нейрегулина клетки собирали в осадок, а раствор, содержащий несвязанный нейрегулин с радиоактивной меткой, удаляли перед тем, как добавить раствор немеченого нейрегулина для конкуренции с радиоактивно меченым нейрегулином. Величину EC50 измеряли способом, известным в данной области знаний.

Показатель EC50 - это концентрация лигандов, которая может конкурировать с 50% радиоактивно меченых лигандов, вытесняя их из комплекса с рецептором. Чем выше величина EC50, тем ниже аффинность связывания с рецептором.

Нейрегулин, используемый в настоящем изобретении, включает любой вариант нейрегулина и его изоформы, известные в данной области знаний, включая, но не ограничиваясь ими, все изоформы нейрегулина-1 ("NRG-1"), нейрегулина-2 ("NRG-2"), нейрегулина-3 ("NRG-3") и нейрегулина-4 ("NRG-4"). NRG-1 описан, например, в патентах США №№ 5530109, 5716930 и 7037888, а также в публикациях Lemke, Mol. Cell. Neurosci. 1996, 7:247-262; Peles and Yarden, 1993, BioEssays 15:815-824, 1993; Peles et al., 1992, Cell 69, 205-216; Wen et al., 1992, Cell 69, 559-572, 1992, Holmes et al., 1992, Science 256:1205-1210, Falls et al., 1993, Cell 72:801-815, Marchionni et al. 1993, Nature 362:312-8, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте. NRG-2 описан, например, в публикациях Chang et al., 1997, Nature 387:509-512; Carraway et al., 1997, Nature 387:512-516; Higashiyama et al., 1997, J. Biochem. 122:675-680, Busfield et al., 1997, Mol. Cell. Biol 17:4007-4014 и международной патентной публикации, № WO 97/09425), содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте. NRG-3 описан, например, в публикации Hijazi et al., 1998, Int. J. Oncol. 13:1061-1067, содержание которой включено сюда в качестве ссылки во всей полноте. NRG-4 описан, например, в публикации Harari et al., 1999 Oncogene. 18:2681-89, содержание которой включено сюда в качестве ссылки во всей полноте.

Нейрегулин, используемый в настоящем изобретении, включает мутанты или дериваты нейрегулина, которые содержат одно или более аминокислотных замещений, одну или более делеций и/или инсерций, которые не представлены в нейрегулине природного происхождения. Предпочтительное число замещенных, делетированных либо добавленных аминокислот составляет 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 или 10. В одном из вариантов реализации изобретения такой дериват содержит одну или более аминокислотных делеций, вставок либо одно или более замещений на амино- и/или карбоксиконцевом участке пептида. В другом варианте реализации изобретения такой дериват содержит одну или более аминокислотных делеций, вставок либо одно или более замещений в любом участке пептида по всей его длине.

В некоторых вариантах реализации изобретения замещения аминокислот могут быть консервативными или неконсервативными замещениями аминокислот. Консервативные замещения аминокислот производят на основании сходства полярности, заряда, растворимости, гидрофобности, гидрофильности и/или амфипатической природы участвующих в замещении аминокислотных остатков. Например, неполярные (гидрофобные) аминокислоты включают аланин, лейцин, изолейцин, валин, пролин, фенилаланин, триптофан и метионин, полярные нейтральные аминокислоты включают глицин, серин, треонин, цистеин, тирозин, аспарагин и глутамин, положительно заряженные (основные) аминокислоты включают аргинин, лизин и гистидин, а отрицательно заряженные (кислые) аминокислоты включают аспарагиновую кислоту и глутаминовую кислоту. В дополнение к этому следует отметить, что глицин и пролин это такие аминокислотные остатки, которые могут влиять на ориентацию молекулы пептида (белка). Неконсервативные замещения влекут за собой замену члена одного из указанных классов представителем другого класса.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин представляет собой дериват нейрегулина с консервативными аминокислотными замещениями, незначительно изменяющими биологическую активность вещества. Подходящие консервативные замещения аминокислот известны компетентным специалистам и, как правило, могут быть произведены без изменения биологической активности полученной в результате молекулы. Компетентные специалисты поймут, что единичные замещения аминокислот в несущественных регионах полипептида, как правило, незначительно изменяют его биологическую активность (см., например, Watson et al. Molecular Biology of the Gene, 4th Edition, 1987, The Bejacmin/Cummings Pub. co., p.224).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин включает мутанты или дериваты нейрегулина с аминокислотным замещением на неклассическую аминокислоту или химический аналог аминокислоты. Неклассические аминокислоты включают, но не ограничиваясь ими, D-изомеры распространенных аминокислот, α-аминомасляную кислоту, 4- аминомасляную кислоту, Abu, 2-аминомасляную кислоту, γ-Abu, ε-Ahx, 6-аминогексаноевую кислоту, Aib, 2-аминоизомасляную кислоту, 3-аминопропионовую кислоту, орнитин, норлейцин, норвалин, гидроксипролин, саркозин, цитруллин, цистеиновую кислоту, трет-бутилглицин, трет-бутилаланин, фенилглицин, циклогексилаланин, β-аланин, фтораминокислоты, сконструированные аминокислоты, например β-метиламинокислоты, Cα-метиламинокислоты, Nα-метиламинокислоты и аналоги аминокислот в целом.

Используемый в настоящем изобретении нейрегулин включает гомолог нейрегулина, то есть полипептид, проявляющий гомологию аминокислотной последовательности и структурное сходство с нейрегулином или с взаимодействующими доменами нейрегулина, в результате чего он способен связываться с гетеродимерами протеинкиназ ErbB2/ErbB4 или ErbB2/ErbB3, активируя их. Типичный гомолог природного белка может иметь аминокислотную последовательность, которая идентична природному белку, по меньшей мере, на 50%, предпочтительно, по меньшей мере, на 75%, более предпочтительно, по меньшей мере, на 80%, 85%, 86%, 87%, 88% или 89%, еще более предпочтительно, по меньшей мере, на 90%, 91%, 92%, 93% или 94%, и наиболее предпочтительно, на 95%, 96%, 97%, 98% или 99%.

Процентный показатель гомологии в этом контексте означает процентную долю аминокислотных остатков в последовательности кандидата, которые идентичны (т.е. аминокислотные остатки в данном линейном положении - это точно такие же аминокислотные остатки) или похожи (т.е. аминокислотные остатки в данном линейном положении - это консервативные замещения, которые обсуждались выше) при линейном сравнении с соответствующими аминокислотными остатками природного пептида, а также при введении, по мере необходимости гэпов (пробелов) для достижения максимальной процентной гомологии последовательностей. В некоторых вариантах реализации изобретения гомолог нейрегулина характеризуется по степени процентной идентичности или процентного сходства с природной последовательностью нейрегулина. Гомологию последовательностей, включая процентные показатели идентичности и сходства, определяют, используя методики линейного выравнивания последовательности, хорошо известные в данной области знаний, с предпочтительным применением компьютерных алгоритмов, специально предназначенных для этого, или программных пакетов, содержащих такие алгоритмы, причем в указанных алгоритмах используются параметры по умолчанию.

Неограничивающие примеры компьютерных алгоритмов и программных пакетов, в которых использованы такие алгоритмы, включают следующее. Семейство программ BLAST иллюстрирует предпочтительный неограничивающий пример математического алгоритма, используемого для сравнения двух последовательностей, например, Karlin & Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci USA 87:2264-2268 (с модификацией в ссылке Karlin & Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Set USA 90:5873-5877), Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410, (описание NBLAST и XBLAST), Altschul et at, 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 (описание Gapped BLAST и PSI-Blast). Другим предпочтительным примером является алгоритм, разработанный Myers и Miller (1988 CABIOS 4:11-17), который встроен в программу ALIGN (версия 2.0) и доступен как часть пакета программ GCG по линейному выравниванию последовательностей. Также предпочтительна программа FASTA (Pearson W.R. and Lipman D.J., Proc. Nat. Acad. ScL USA, 85:2444-2448, 1988), доступная как часть пакета программ Wisconsin Sequence Analysis. Дополнительные примеры включают программу BESTFIT, в которой использован алгоритм "локальной гомологии", разработанный Smith и Waterman (Advances in Applied Mathematics, 2:482-489, 1981) и применяемый для нахождения наилучшего (единственного) региона сходства между двумя последовательностями, предпочтительно при сравнении двух последовательностей разной длины, а также программу GAP, которая сопоставляет две последовательности, находя "максимальное сходство" на основе алгоритма, разработанного Neddleman и Wunsch (J. Mol. Biol. 48:443-354, 1970), и предпочтение которой отдается при сравнении двух последовательностей приблизительно одинаковой длины, если выравнивание проводится по всей длине.

Примерами гомологов могут быть ортологичные белки других биологических видов, включая животных, растения, дрожжи, бактерии и т.п. Гомологи также могут быть получены посредством отбора, например, через мутации природного белка. Например, гомологи можно идентифицировать посредством сайт-специфического мутагенеза в комбинации с анализами для выявления взаимодействий типа белок-белок. Дополнительные способы, например, белковая аффинная хроматография, аффинный блоттинг, анализы связывания in vitro и т.п., будут очевидны для компетентных специалистов, ознакомившихся с настоящим изобретением.

В целях сравнения двух разных последовательностей нуклеиновых кислот или полипептидов одну последовательность (тестируемую) можно описать в специфическом контексте "процентной идентичности" с другой последовательностью (эталонной) в соответствии с раскрытыми здесь данными. В этом отношении, если длина тестируемой последовательности составляет менее 80% длины эталонной последовательности, то процентный показатель идентичности определяют по алгоритму Myers and Miller, Bull. Math Biol, 51:5-37 (1989) и Myers and Miller, Comput. Appl. Biosci, 4(1):11-17 (1988). Идентичность специфически определяют по программе ALIGN. При этом можно использовать параметры по умолчанию.

Если длина тестируемой последовательности составляет, по меньшей мере, 90% длины эталонной последовательности, то процентный показатель идентичности определяют по алгоритму Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:5873-77 (1993), который встроен в различные программы BLAST. Процентный показатель идентичности специфически определяют при помощи инструмента "BLAST 2 Sequences". См. Tatusova and Madden, FEMS Microbiol. Lett., 174(2):247-250 (1999). Для попарного сравнения ДНК-ДНК используют программу BLASTN 2.1.2 с параметрами по умолчанию (соответствие: 1; несоответствие: 2; открытый гэп: 5 штрафных баллов; расширенный гэп: 2 штрафных балла; гэп x_разгрузка: 50; ожидание: 10; и длина слова: 11, с фильтром). Для попарного сравнения белок-белок используют программу BLASTP 2.1.2 с параметрами по умолчанию (матрикс: BLOSUM62; открытый гэп: 11; расширенный гэп: 1; x_разгрузка: 15; ожидание: 10.0; и длина слова: 3, с фильтром).

Нейрегулин, используемый в настоящем изобретении, также включает отдельно взятый домен EGF нейрегулина, полипептид, содержащий домен EGF нейрегулина, или продукты нейрегулин-подобного гена, имитирующие активность нейрегулина и связывающие ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинации, приводя к их активации. При использовании здесь терминологическое определение "домен, подобный эпидермальному фактору роста" или "EGF-подобный домен" относится к полипептидному мотиву, кодируемому геном нейрегулина, который связывается с ErbB2, ErbB3, ErbB4 или их комбинациями, активируя их, и обладает структурным сходством с доменом, связывающим рецептор EGF, как раскрыто в ссылках WO 00/64400, Holmes et al., Science, 256:1205-1210 (1992); патенты США №№ 5530109 и 5716930; Hijazi et al., Int.J. Oncol., 13:1061-1067 (1998); Chang et al., Nature, 387:509-512 (1997); Carraway et al., Nature, 387:512-516 (1997); Higashiyama et al., J. Biochem., 122:675-680 (1997); а также WO 97/09425. Содержание всех этих материалов включено сюда в качестве ссылки.

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин содержит EGF-подобный домен, кодируемый NRG-1. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность домена NRG-1, связывающего рецептор. В некоторых вариантах реализации изобретения EGF-подобный домен содержит аминокислотную последовательность, соответствующую аминокислотным остаткам последовательности NRG-1 177-226, 177-237 или 177-240.

В предпочтительных вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин содержит аминокислотную последовательность:

Ser His Leu Val Lys Cys Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro Ser Arg Tyr Leu Cys Lys Cys Pro Asn Glu Phe Thr Gly Asp Arg Cys Gln Asn Tyr Val Met Ala Ser Phe Tyr Lys Ala Glu Glu Leu Tyr Gln (SEQ ID NO:1), которая соответствует аминокислотам 177-237 белка NRG-1 человека. Последовательность нуклеиновой кислоты человека, кодирующая этот фрагмент такова:

agccatcttg taaaatgtgc ggagaaggag aaaactttct gtgtgaatgg aggggagtgc ttcatggtga aagacctttc aaacccctcg agatacttgt gcaagtgccc aaatgagttt actggtgatc gctgccaaaa ctacgtaatg gcgagcttct acaaggcgga ggagctgtac cag (SEQ ID NO:2).

В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин содержит EGF-подобный домен, кодируемый NRG-2. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин содержит EGF-подобный домен, кодируемый NRG-3. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин содержит EGF-подобный домен, кодируемый NRG-4. В некоторых вариантах реализации настоящего изобретения используемый в нем нейрегулин содержит аминокислотную последовательность Ala Glu Lys Glu Lys Thr Phe Cys Val Asn Gly Gly Glu Cys Phe Met Val Lys Asp Leu Ser Asn Pro, как это описано в патенте США № 5834229.

C. Технология длительного высвобождения в целом

Настоящее изобретение предлагает композиции для длительного высвобождения нейрегулина и способы профилактики, лечения или задержки развития различных заболеваний, например сердечной недостаточности, основанные на применении таких композиций. Длительное высвобождение нейрегулина позволяет упростить схему введения лекарства, повышает его клиническую эффективность и ослабляет неблагоприятные побочные эффекты, например, связанные с высоким уровнем нейрегулина в крови. Предполагается, что длительное высвобождение нейрегулина на протяжении определенного промежутка времени способно индуцировать или поддерживать экспрессию некоторых генов, детерминирующих рост и/или дифференцировку кардиомиоцитов, реконструкцию саркомерных и цитоскелетных структур мышечных клеток, а также межклеточную адгезию.

Длительное высвобождение нейрегулина можно организовать через любой путь его введения в организм, выбранный по усмотрению компетентного специалиста, включая, но не ограничиваясь ими, пероральный, ингаляционный, парентеральный (например, внутривенный, внутримышечный, подкожный или внутрикожный). В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят перорально. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят внутривенно. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят внутримышечно. В предпочтительных вариантах реализации изобретения происходит длительное высвобождение нейрегулина в кровоток млекопитающего.

Нейрегулин можно вводить любыми средствами, пригодными для длительного высвобождения, или любыми устройствами доставки, которые известны среднему специалисту. Специфически в настоящем изобретении можно использовать любые средства для длительного высвобождения или устройства для доставки пептидов, которые известны в данной области знаний. Примеры таковых включают, но не ограничиваясь ими, средства и устройства, описанные в патентах США №№: 3845770, 3916899, 3536809, 3598123 и 4008719, 5674533, 5059595, 5591767, 5120548, 5073543, 5639476, 5354556, 5639480, 5733566, 5739108, 5891474, 5922356, 5972891, 5980945, 5993855, 6045830, 6087324, 6113943, 6197350, 6248363, 6264970, 6267981, 6376461, 6419961, 6589548, 6613358, 6699500, 6740634, 6838076, 6866866, 7087246, каждый из которых включен сюда в качестве ссылки. Такие дозированные формы могут быть применены для обеспечения длительного высвобождения нейрегулина с использованием, например, гидропропилметилцеллюлозы, других полимерных матриц, гелей, проницаемых мембран, осмотических систем, многослойных покрытий, микрочастиц, липосом, микросфер или их комбинаций, которые способны обеспечить желательный профиль высвобождения в различных пропорциях. Изобретение также охватывает стандартные дозированные формы, пригодные для перорального введения, включая, но не ограничиваясь ими, таблетки, капсулы, желатиновые капсулы и таблетки типа капсул, которые приспособлены для управляемого высвобождения лекарственного вещества.

Длительное высвобождение нейрегулина обеспечивает его непрерывный терапевтический уровень на протяжении определенного промежутка времени. В некоторых вариантах реализации изобретения высвобождение нейрегулина происходит на протяжении 1 часа, 2 часов, 4 часов, 8 часов, 10 часов, 12 часов, 14 часов, 16 часов, 20 часов, 24 часов и более. В некоторых вариантах реализации изобретения высвобождение нейрегулина происходит на протяжении 1 дня, 2 дней, 3 дней, 4 дней, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней и более. В других вариантах реализации изобретения высвобождение нейрегулина происходит на протяжении 1 недели, 2 недель, 3 недель, 4 недель и более. В других вариантах реализации изобретения высвобождение нейрегулина происходит на протяжении 1 месяца, 2 месяцев, 3 месяцев, 4 месяцев, 8 месяцев, 12 месяцев и более. В других вариантах реализации изобретения высвобождение нейрегулина происходит на протяжении 1 года, 2 лет, 3 лет, 4 лет и более. В некоторых вариантах реализации изобретения высвобождение нейрегулина происходит на протяжении отрезка времени от 1 часа до 2 недель, от 2 часов до 2 недель, от 4 часов до 24 часов или от 4 дней до 10 дней. Продолжительность отрезка времени, в течение которого осуществляется высвобождение нейрегулина, может зависеть от различных факторов, например от использованной технологии (или технологий) длительного высвобождения.

Длительное высвобождение нейрегулина на протяжении определенного времени поддерживает уровень нейрегулина в крови в нужном диапазоне. При этом особенно важно, что сохраняется или даже превышается минимально эффективный терапевтический уровень, но не достигается минимальный уровень токсичности. Концентрацию нейрегулина в сыворотке больных, получающих лекарственные композиции нейрегулина с длительным высвобождением, можно сравнить с концентрацией этого вещества в сыворотке больных, получающих лекарственные композиции нейрегулина без длительного высвобождения (например, внутривенные вливания), на тот момент, когда достигнута максимальная концентрация в крови (C_max). В предпочтительном варианте реализации изобретения больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют сниженный показатель максимальной концентрации нейрегулина в сыворотке (C_max) по сравнению с больными, получающими лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения. Например, в одном из предпочтительных вариантов больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют показатель C_max менее чем приблизительно 90%, 80%, 70% или 60% по сравнению с C_max у больных, которые получали лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения. В более предпочтительном варианте больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют показатель C_max менее чем приблизительно 50%, 40% или 30% по сравнению с C_max у больных, которые получали лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения. В наиболее предпочтительном варианте больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют показатель C_max менее чем приблизительно 20%, 10% или еще меньше по сравнению с C_max у больных, которые получали лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения. Способы измерения концентрации нейрегулина в сыворотке известны в данной области знаний. Для этого, например, можно использовать клетки, экспрессирующие рецепторы ErbB-2 и ErbB-3, например клеточную линию рака молочной железы SKBR-3. Нейрегулин в количестве 10, 5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,312, 0,156, 0,078, 0,039, 0,019 и 0,0079 нг добавляют в разные пробирки, содержащие клетки раздельно на льду, а затем туда же добавляют радиоактивно меченый нейрегулин (50000 cpm). Образец испытуемого раствора перемешивают и оставляют на ночь при 4°C. На следующее утро клетки собирают в виде осадка, а надосадочную жидкость отсасывают перед подсчетом радиоактивности. Вычерчивают стандартную кривую радиоактивности по отношению к количеству немеченого нейрегулина. При измерении концентрации нейрегулина в сыворотке определенное количество сыворотки добавляют в пробирку, содержащую клетки на льду, после чего туда же добавляют радиоактивно меченый нейрегулин (50000 cpm), а образец испытуемого раствора перемешивают и оставляют на ночь при 4°C. На следующее утро клетки собирают в виде осадка, а надосадочную жидкость отсасывают перед подсчетом радиоактивности. Проводят подсчет радиоактивности, а количество нейрегулина в сыворотке рассчитывают в соответствии со стандартной кривой.

В соответствии с настоящим изобретением можно обеспечивать различные профили длительного высвобождения. Понятие "профиль длительного высвобождения" означает такой профиль высвобождения, при котором за первые 24 часа лечебного вмешательства происходит менее 50% общего высвобождения нейрегулина за все время имплантации/вставления или применения другого способа введения нейрегулина. В предпочтительном варианте реализации настоящего изобретения профиль длительного высвобождения выбирают из группы, состоящей из: (a) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 24 и 48 часами после имплантации/вставления или другого способа введения, (b) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 48 и 96 часами после имплантации/вставления или другого способа введения, (c) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 96 и 168 часами (1 неделя) после имплантации/вставления или другого способа введения, (d) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 1 и 2 неделями после имплантации/вставления или другого способа введения, (e) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 2 и 4 неделями после имплантации/вставления или другого способа введения, (f) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 4 и 8 неделями после имплантации/вставления или другого способа введения, (g) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 8 и 16 неделями после имплантации/вставления или другого способа введения, (h) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 16 и 52 неделями (1 год) после имплантации/вставления или другого способа введения, и (i) точки 50% высвобождения, расположенной в промежутке времени между 52 и 104 неделями после имплантации/вставления или другого способа введения.

В дополнение к этому, применение настоящего изобретения помогает уменьшить степень колебаний ("DFL") концентрации активного агента в плазме. Показатель DFL представляет собой меру того, насколько уровень лекарства в плазме варьируется в интервале между введением доз. Чем ближе величина DFL к нулю (0), тем меньше флуктуация активного агента в период действия введенной дозы лекарства. Таким образом, малые значения DFL означают, что разница между пиком и впадиной на кривой уровня агента в плазме невелика. В предпочтительном варианте больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют показатель DFL, составляющий приблизительно 90%, 80%, 70% или 60% от величины DFL у больных, которые получают лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения. В более предпочтительном варианте больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют показатель DFL, составляющий приблизительно 50%, 40% или 30% от величины DFL у больных, которые получают лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения. В наиболее предпочтительном варианте больные, получающие лекарственную композицию нейрегулина с длительным высвобождением, имеют показатель DFL, составляющий приблизительно 20%, 10% или менее от величины DFL у больных, которые получают лекарственную композицию нейрегулина без длительного высвобождения.

В настоящем изобретении могут быть использованы любые технологии по обеспечению длительного высвобождения, известные в данной области знаний. В целом размер и частоту введения доз определяют по фармакодинамическим и фармакокинетическим свойствам активного агента. Чем медленнее скорость всасывания, тем меньше колебания концентрации активного агента в крови на протяжении действия введенной дозы лекарства. Это позволяет увеличивать размер доз, вводя их с меньшей частотой. Однако многие активные агенты, обладающие хорошей растворимостью в организме, обычно довольно быстро всасываются, создавая внезапное взрывное высвобождение доступного лекарства. В качестве примера можно привести падение артериального давления у больных, получающих продукты нифедипина с быстрым высвобождением. Применение продукта с длительным высвобождением активного вещества позволяет избежать высоких начальных концентраций в крови, индуцирующих внезапное падение артериального давления и другие резкие изменения гемодинамики, например рефлекторную тахикардию.

В дополнение к этому, некоторые активные агенты являются мишенями и выводятся из организма или разрушаются в нем, например, иммунной системой или протеазами. Лекарства с коротким периодом полувыведения (или полураспада) по этому и по другим соображениям необходимо вводить многократно и с короткими интервалами, чтобы поддерживать концентрацию активного агента в крови в терапевтических пределах. Известно, что существует обратная корреляция между частотой введения доз лекарства и соблюдением больными предписанного режима лечения. Для таких агентов с относительно коротким периодом полувыведения (или полураспада) применение лекарственных продуктов с длительным высвобождением позволяет поддерживать терапевтическую концентрацию активного агента на протяжении больших промежутков времени. Таким образом, возможность снижения числа ежедневных доз, открываемая продуктами с длительным высвобождением, создает потенциал для большей согласованности со стороны больных. Хотя в этой заявке раскрыты специфические технологии длительного высвобождения, настоящее изобретение носит более широкий характер, чем любая специфическая технология длительного высвобождения. Это изобретение включает неожиданное открытие того факта, что длительное высвобождение NRG в небольших дозах улучшает функцию инфарктного сердца. Кроме того, существует много технологий длительного высвобождения лекарств, которые уже известны в данной области знаний. Некоторые из них в общих чертах обсуждаются ниже, как предпочтительные технологии длительного высвобождения, но они представлены здесь только в иллюстративных целях, а не как ограничение сферы изобретения. В данной области знаний хорошо известны многие родственные и неродственные технологии, которые можно использовать в практике раскрытого здесь изобретения. В дополнение к этому, в практике настоящего изобретения вполне возможно комбинированное применение обсуждаемых здесь технологий длительного высвобождения и/или других технологий длительного высвобождения, известных в данной области знаний. Например, продукты и сервисные услуги, которые можно использовать в практике настоящего изобретения, предлагают многие компании, имеющие специальные знания и опыт в области технологий доставки лекарств с длительным высвобождением, например Alza Corp., Durect Corp., Gilead Sciences, Baxter Pharmaceuticals, Brookwood Pharmaceuticals и OctoPlus. Кроме того, поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных публикаций ознакомит компетентных специалистов, изучающих настоящее изобретение, со многими доступными технологиями длительного высвобождения лекарственных веществ. Таким образом, компетентный специалист в рамках практической реализации этого изобретения сможет выбрать нужную технологию (или технологии) длительного высвобождения.

C.1. Осмотические насосы

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения длительное высвобождение NRG в кровь основано на применении осмотического насоса. Осмотические приспособления продемонстрировали свою пригодность для доставки полезных активных агентов в целевую зону управляемым образом на протяжении длительных промежутков времени. Известные приспособления включают таблетки, пилюли, капсулы и имплантируемые устройства. Таблетки и пилюли можно принимать перорально, а другие осмотические насосы либо имплантируют подкожно или внутрибрюшинно, либо присоединяют к катетеру для внутривенной, внутримозговой или внутриартериальной инфузии.

Обычно в системе осмотического насоса имеется стержень, заключенный в оболочку из полупроницаемой мембраны, имеющую, по меньшей мере, одно отверстие. Полупроницаемая мембрана проницаема для воды, но непроницаема для активного агента. Если такая система контактирует с биологическими жидкостями организма, то вода проходит через полупроницаемую мембрану, достигая стержня, содержащего осмотические наполнители и активный агент. В стержне повышается осмотическое давление, и активный агент вытесняется через отверстие в оболочке с контролируемой, причем заранее определенной скоростью.

Во многих осмотических насосах стержень содержит более одного внутреннего отсека. Например, в первом отсеке может содержаться активный агент. Во втором отсеке содержится осмотический агент и/или "движущее звено" насоса. См., например, патент США № 5573776, содержание которого включено сюда в качестве ссылки. Этот отсек может иметь высокое осмотическое давление, заставляющее воду входить в насос через полупроницаемую мембрану. Приток воды сдавливает первый отсек. Этого результата можно достичь, например, используя во втором отсеке полимер, который разбухает при контакте с жидкостью. В соответствии с этим происходит вытеснение активного агента с заранее определенной скоростью.

В других вариантах реализации изобретения осмотический насос может включать более одного отсека с активным агентом, причем каждый отсек может содержать либо один и тот же агент, либо другой агент. Концентрация агента в каждом отсеке и скорость его высвобождения также могут быть одинаковыми или различными.

Скорость доставки обычно зависит от скорости поступления воды через полупроницаемую мембрану. Таким образом, профиль доставки лекарства насосом не зависит от вытесняемого агента, то есть его молекулярный вес или его физические и химические свойства, как правило, не влияют на скорость доставки. Дальнейшее обсуждение вопросов о принципе действия, критериях конструирования и скорости доставки лекарств осмотическими насосами представлено в публикациях Theeuwes and Yum, Annals of Biomedical Engineering, vol. 4, No. 4 (1976) и Urquhart et. al., Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 24:199-236 (1984), содержание которых включено сюда в качестве ссылки.

Осмотические насосы хорошо известны в данной области знаний и вполне доступны среднему специалисту из компаний, специализирующихся на производстве и продаже осмотических насосов для доставки лекарств с длительным высвобождением. Например, технология DUROS^® компании ALZA представляет собой имплантируемую осмотическую систему, не подверженную биологическому распаду, которая обеспечивает доставку в организм малых лекарств, пептидов, протеинов, ДНК и других биологически активных молекул продолжительностью до одного года, технология OROS^® той же компании ALZA основана на таблетках, которые используют осмос для точной и контролируемой доставки лекарств продолжительностью до 24 часов, в системе Osmodex^® компании Osmotica Pharmaceutical использованы таблетки с несколькими слоями лекарства (лекарств), обеспечивающими одинаковый или разный профиль высвобождения, система EnSoTrol^® компании Shire Laboratories использует солюбилизацию лекарства в стержне и доставку солюбилизированного лекарства через просверленное лазером отверстие, посредством осмоса, в осмотические насосы Alzet^®, представляющие собой миниатюрные имплантируемые насосы, которые используют в исследованиях на мышах, крысах и других лабораторных животных.

Поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных публикаций ознакомит компетентных специалистов, изучающих настоящее изобретение, со многими доступными технологиями, основанными на принципе осмотического насоса. В качестве примеров можно привести патенты США №№ 6890918, 6838093, 6814979, 6713086, 6534090, 6514532, 6361796, 6352721, 6294201, 6284276, 6110498, 5573776, 42000984 и 4088864, описывающие осмотические насосы и способы их производства, содержание которых включено сюда в качестве ссылки. Компетентный специалист, рассматривающий как раскрытие этого изобретения, так и сведения, раскрытые в других патентах (указанных выше), сможет изготовить осмотический насос для обеспечения длительного высвобождения NRG.

Типичные материалы для полупроницаемой мембраны включают полупроницаемые полимеры, известные в данной области знаний как мембраны осмоса и обратного осмоса, например ацетат целлюлозы, диацетат целлюлозы, триацетат целлюлозы, уксусный агар, триацетат амилазы, бета-глюканацетат, ацетальдегиддиметилацетат, этилкарбаматацетат целлюлозы, полиамиды, полиуретаны, сульфонированные полистиролы, ацетатфталат целлюлозы, ацетатметилкарбамат целлюлозы, ацетатсукцинат целлюлозы, ацетатдиметилаиноацетат целлюлозы, ацетатэтилкарбамат целлюлозы, ацетатхлорацетат целлюлозы, дипальмитат целлюлозы, диоктаноат целлюлозы, дикаприлат целлюлозы, дипентанлат целлюлозы, ацетатвалерат целлюлозы, ацетатсукцинат целлюлозы, пропионат целлюлозы, сукцинат, метилцеллюлозу, ацетат-p-толуолсульфонат целлюлозы, ацетатбутират целлюлозы, поперечно сшитые избирательно полупроницаемые полимеры, образованные соосаждением полианионов и поликатионов, полупроницаемые полимеры, производные полистирола с легким поперечным сшиванием, поперечно сшитый поли(натрийстиролдсульфонат), поли(винилбензолтриметиламмония хлорид), ацетат целлюлозы со степенью замещения до 1 и с содержанием ацетила до 50%, диацетат целлюлозы со степенью замещения от 1 до 2 и с содержанием ацетила от 21 до 35%, триацетат целлюлозы со степенью замещения от 2 до 3 и с содержанием ацетила от 35 до 44,8%, как это раскрыто в патенте США № 6713086, содержание которого включено сюда в качестве ссылки.

Осмотический агент (агенты), представленный в насосе, может содержать любое осмотически эффективное соединение (соединения), которое проявляет градиент осмотического давления по толщине полупроницаемой стенки в отношении наружной жидкости. Эффективные агенты включают (без ограничений) сульфат магния, сульфат кальция, хлорид магния, хлорид натрия, хлорид лития, сульфат калия, карбонат натрия, сульфит натрия, сульфат лития, хлорид калия, сульфат натрия, d-маннит, мочевину, сорбит, инозит, раффинозу, сахарозу, гидрофильные полимеры, например, полимеры целлюлозы, их смеси и т.п., как это раскрыто в патенте США № 6713086, содержание которого включено сюда в качестве ссылки.

Типичное "движущее звено" - это гидрофильный полимер, который взаимодействует с биологическими жидкостями и разбухает или увеличивается в объеме. Полимер проявляет способность разбухать в воде, удерживая в своей структуре значительную часть поглощенной воды. Полимер разбухает и значительно увеличивается в объеме, обычно от 2 до 50 раз. Полимеры могут иметь поперечные связи, но могут и не иметь поперечных связей. Гидрофильные полимеры, пригодные для применения с этой целью в настоящем изобретении, хорошо известны в данной области знаний.

Выходной канал может быть организован с применением любых средств и способов, пригодных для высвобождения активного агента из системы. Осмотический насос может включать одну или более апертур или отверстий, высверленных в полупроницаемой мембране с применением известных в данной области знаний механических процедур, включая, но не ограничиваясь ими, лазеры, как это раскрыто в патенте США № 4088864. В альтернативном варианте отверстия можно получить, встраивая в полупроницаемую мембрану разрушающийся элемент, например желатиновую пробку.

Хотя специфические варианты реализации осмотических насосов обсуждались выше, настоящее изобретение носит более широкий характер, чем любая специфическая технология длительного высвобождения. Это изобретение включает открытие того факта, что длительное высвобождение NRG улучшает функцию инфарктного сердца и уменьшает внутренний диаметр левого желудочка. Существует много вариантов и разных типов осмотических насосов, которые известны в настоящее время в данной области знаний и которые можно использовать в практике раскрытого здесь изобретения.

C.2. Объединение с поли(этиленгликолем)

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения длительное высвобождение NRG в кровь включает объединение активного агента с полимером, в частности с поли(этиленгликолем), в дальнейшем именуемым "PEG". Объединение PEG с биологически активными агентами продемонстрировало свою полезность для доставки активных агентов в целевую зону управляемым образом на протяжении длительных промежутков времени. В биотехнологической индустрии особенно широко применяется модификация белков с присоединением PEG, позволяющая ослабить антигенный потенциал терапевтически активных агентов и увеличить их биологическую доступность in vivo. Например, объединение PEG с аденозиндезаминазой крупного рогатого скота при помощи цианурхлорида приводит к потере иммуногенности фермента. Подобным образом, было показано, что для продуктов присоединения PEG как к гормону роста, так и к L-аспарагиназе E. coli характерен удлиненный период полувыведения из плазмы.

Присоединение PEG к активному агенту или другим молекулам, например, на наружной поверхности липосом может повысить эффективность активного агента или другой молекулы удлинить период их полувыведения, а также снизить токсичность. Молекула PEG гидратируется и быстро перемещается, особенно в водной среде. Это быстрое перемещение позволяет PEG вычищать большой объем, а также предупреждает приближение и мешающее воздействие других молекул, например иммунных клеток или протеаз. Таким образом, после присоединения к PEG полимерные цепи комбинированного продукта защищают присоединенную молекулу от иммунной реакции организма и других механизмов очистки, удлиняя биологическую доступность активного агента.

Обычно молекулы полиэтиленгликоля вступают в соединение с белком через реактивную группу белковой молекулы. В большинстве случаев для присоединения используют аминогруппы, например остатки лизина на N-конце. Патенты США №№ 5824784 и 4002531 раскрывают способы присоединения PEG к ферменту посредством восстановительного алкилирования. Остатки лизина стратегически можно использовать для замещения других аминокислот или вставлять их в полипептидную последовательность с целью создания дополнительных точек присоединения, как это раскрыто в патенте США № 4904584. В данной области знаний известны дополнительные способы присоединения разветвленных или "многоплечих" дериватов PEG к белкам, как это раскрыто в патенте США № 5932462. Существует множество других способов присоединения, известных в данной области знаний, которые основаны на прикреплении полимеров к остаткам цистеина, карбоксильным группам, углеводам и другим компонентам. Например, патент США № 5900461 раскрывает производные PEG и других полимеров, обладающих более активными сульфоновыми компонентами, которые высоко избирательны к связыванию с тиольными компонентами, а не с аминокислотными компонентами молекул.

PEG также можно применять для сцепления макромолекул с целевым лигандом или компонентом, который направляет макромолекулы в зоны особого интереса. Патент США № 6436386 раскрывает конъюгаты активных агентов с полимерами, присоединенные к компоненту, нацеленному на гидроксиапатит, для доставки активного агента, например, фактора роста костной ткани, на гидроксиапатитные поверхности, например, поверхности костей.

Доступен широкий ряд производных PEG, которые пригодны для применения в изготовлении PEG-конъюгатов. Например, серия продуктов SUNBRIGHT^® корпорации NOF предлагает множество производных PEG, включая метоксиполиэтиленгликоли и активированные дериваты PEG, например метокси-PEG-амины, малеимиды и карбоновые кислоты, для различных способов присоединения к лекарствам, ферментам, фосфолипидам и другим биологическим материалам, а стратегия усовершенствованного PEG-илирования компании Nektar Therapeutics также предлагает различные технологии объединения с PEG для улучшения показателей безопасности и эффективности терапевтических средств.

Поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных публикаций также ознакомит компетентных специалистов, изучающих настоящее изобретение, со многими доступными технологиями объединения с PEG и со многими производными PEG. Например, патенты США №№ 6436386, 5932462, 5900461, 5824784, 4904584 и 40025315, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте, описывают такие технологии и производные, а также способы из производства. Таким образом, компетентный специалист, знакомясь с раскрытием этого изобретения и с данными раскрытыми в указанных патентах, сможет осуществить соединение PEG, деривата PEG или какого-либо другого полимера с NRG для длительного высвобождения последнего.

PEG - это хорошо известный полимер, обладающий такими свойствами, как растворимость в воде и во многих органических растворителях, отсутствие токсичности, отсутствие иммуногенности, а также прозрачность, бесцветность и стабильность. Одним из вариантов применения PEG является ковалентное связывание этого полимера с нерастворимыми молекулами для придания растворимости полученному в результате конъюгату PEG-молекула. По этим и другим соображениям PEG был выбран нами как предпочтительный полимер для присоединения, однако связанные с ним примеры приводятся здесь только в иллюстративных целях, а не в качестве ограничения. Продукты с похожими свойствами можно получить из других водорастворимых полимеров, включая, но не ограничиваясь ими, поли(виниловый спирт), другие поли(алкиленоксиды), например поли(пропиленгликоль) и т.п., поли(оксиэтилированные полиолы), например поли(оксиэтилированный глицерин) и т.п., карбоксиметилцеллюлозу, декстран, поливиниловый спирт, поливинилпирролидон, поли-1,3-диоксолан, поли-1,3,6-триоксолан, этилен/малеиновый ангидрид и полиаминокислоты. Компетентный специалист сможет выбрать нужный полимер, основываясь на желательной дозе, времени циркуляции, устойчивости к протеолизу и на других соображениях.

C.3. Упаковка в липосомы

Еще в одном варианте реализации настоящего изобретения длительное высвобождение NRG в кровь включает упаковку NRG в липосомы, которые продемонстрировали свою пригодность в доставке полезных активных агентов контролируемым образом на протяжении длительного времени. Липосомы - это полностью закрытые двухслойные мембраны, содержащие замкнутый водный объем. Липосомы могут представлять собой однослойные пузырьки, обладающие одной двухслойной мембраной, или многослойные пузырьки с множеством двухслойных мембран, каждая из которых отделена от соседней водной прослойкой. Структура возникающей в результате двухслойной мембраны такова, что гидрофобные (неполярные) хвосты липида ориентированы по направлению к центру двойного слоя, а гидрофильные (полярные) головные концы ориентированы по направлению к водной фазе.

Обычно в липосомной системе доставки лекарств активный агент заключен в липосому, а затем вводится больному, нуждающемуся в лечении. Однако если активный агент липофилен, он может быть связан с двойным слоем липидов.

Иммунная система может распознавать обычные липосомы как инородные тельца и разрушать их прежде, чем достаточное количество активного агента достигнет целевого участка, пораженного заболеванием. Поэтому в одном из вариантов реализации изобретения липосомы могут быть покрыты гибким водорастворимым полимером, защищающим их от поглощения компонентами системы мононуклеарных фагоцитов, прежде всего в печени и селезенке. Подходящие гидрофильные полимеры для покрытия липосом включают, но, не ограничиваясь ими, PEG, поливинилпирролидон, поливинилметиловый эфир, полиметилоксазолин, полигидроксипропилоксазолин, полигидроксипропилметакриламид, полиметакриламид, полигидроксипропилметакрилат, полигидроксэтилакрилат, гидроксиметилцеллюлозу, гидроксиэтилцеллюлозу, полиэтиленгликоль, полиаспартамид и гидрофильные пептидные последовательности, как это описано в патентах США №№ 6316024, 6126966, 6056973 и 6043094, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте.

Липосомы могут быть составлены из любых липидов и комбинаций липидов, известных в данной области знаний. Например, везикулообразующие липиды могут иметь природное происхождение или быть синтетическими липидами, включая такие фосфолипиды как фосфатидилхолин, фосфатидилэтаноламин, фосфатидная кислота, фосфатидилсерин, фосфатидилглицерин, фосфатидилинозит и сфингомиелин, как это раскрыто в патентах США №№ 6056973 и 5874104. Везикулообразующими липидами также могут быть гликолипиды, цереброзиды или катионные липиды, например 1,2-диолеилокси-3-(триметиламино) пропан (DOTAP); N-[1-(2,3,-дитетрадецилокси)пропил]-N,N-диметил-N-гидроксиэтиламмония бромид (DMRIE); N-[1[(2,3,-диолеилокси)пропил]-N,N-диметил-N- гидроксиэтиламмония бромид (DORIE); N-[1-(2,3-диолеилокси)пропил]-N,N,N-триметиламмония хлорид (DOTMA); 3[N-N',N'-диметиламиноэтан) карбамоил]холестерин (DC-Choi) или диметилдиоктадециламмоний (DDAB), также раскрытые в патенте США № 6056973. Кроме того, в нужном количестве может быть представлен холестерин, способный придавать стабильность везикулам, как это раскрыто в патентах США №№ 5916588 и 5874104.

В другом варианте реализации изобретения липосомы нацелены на специфические участки в организме млекопитающего, что достигается за счет присоединения нацеливающего лиганда или компонента. Полагают, что нацеливающие лиганды распознаются рецепторами или другими соединениями на поверхности клеток-мишеней. Типичные целевые лиганды включают антитела или фрагменты антител, лиганды клеточных рецепторов, лектины и т.п. Для дальнейшего обсуждения см. патенты США №№ 6316024 и 6294191, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте.

Нацеливающие лиганды можно прикреплять к липосомам любыми средствами для ковалентного или нековалентного связывания лигандов с липосомами, которые известны в данной области знаний. Например, липосомы, покрытые полимером, были модифицированы для достижения сайт-специфической доставки активных агентов посредством прикрепления нацеливающего лиганда или к полярным остаткам головной группы липидных компонентов липосом, или к свободным концам полимерных цепей, образующих поверхностное покрытие липосом, как это описано в патентах США №№ 6316024 и 6043094, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте. Таких прикреплений можно достичь, например, связывая белки с липосомами при помощи агента перекрестного сшивания, имеющего, по меньшей мере, одну малеимидную группу и аминовосстановительную функцию, как это описано в патенте США № 5399331, либо связывая белки с липосомами при помощи гликопротеина стрептавидина, как это описано в патентах США №№ 4885172, 5059421 и 5171578, либо покрывая нацеленные липосомы полисахаридами. В альтернативном варианте везикулообразующий липид может быть дериватизирован с гидрофильной полимерной цепью, конец которой функционально организован для связывания антител через использование гидразидной или гидразиновой группы, реактивной в отношении альдегидных групп, как это описано в патенте США № 6126966. Группой с функционально активным концом может также быть 2-пиридилдитио-пропионамид, используемый для присоединения антитела или другой молекулы к липосоме через дисульфидную связь.

Липосомы для этого изобретения можно изготовить, пользуясь стандартными методиками, известными компетентному специалисту. Например, в одном из вариантов, раскрытых в патенте США № 5916588, готовят забуференный раствор активного агента. Затем подходящие липиды, например гидрированный соевый фосфатидилхолин и холестерин (оба в виде порошков), растворяют в хлороформе или подобных растворителях и высушивают ротационным выпариванием. Образовавшуюся при этом липидную пленку ресуспендируют в диэтиловом эфире или подобных веществах, после чего помещают в колбу и обрабатывают ультразвуком в водяной бане, одновременно добавляя забуференный раствор активного агента. После испарения эфира обработку ультразвуком прекращают и направляют на материал поток азота до полного удаления остаточного эфира. Другие стандартные процедуры изготовления описаны в патентах США №№ 6352716, 6294191, 6126966, 6056973, 5965156 и 5874104. Липосомы для этого изобретения можно вырабатывать любым способом, общепринятым в данной области знаний при изготовлении липосом, включая, но не ограничиваясь ими, способы, описанные в вышеуказанных документах (содержание которых включено сюда в качестве ссылки).

Липосомы также хорошо известны в данной области знаний и легко доступны от компаний, специализирующихся на производстве липосом для доставки лекарств с длительным высвобождением. Например, в липосомной технологии для внутривенной доставки лекарств STEALTH^® компании ALZA (прежнее название Sequus Pharmaceuticals) использовано покрытие липосом полиэтиленгликолем, маскирующее их от распознавания иммунной системой. Липосомная технология компании Gilead Sciences (прежнее название Nexstar) была использована в патентованном средстве AmBisome^® и утверждена FDA для лечения грибковых инфекций, а корпорация NOF предлагает широкий ряд фосфолипидов класса GMP, производных фосфолипидов и конъюгатов PEG-фосфолипиды под торговыми названиями COATSOME^® и SUNBRIGHT^®.

Поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных публикаций также познакомит компетентных специалистов, изучающих раскрытые здесь данные, с доступными липосомными технологиями. Патенты США №№ 6759057, 6406713, 6352716, 6316024, 6294191, 6126966, 6056973, 6043094, 5965156, 5916588, 5874104, 5215680 и 4684479, содержание которых включено сюда в качестве ссылки, описывают липосомы и покрытые липидами микропузырьки, а также способы их изготовления. Таким образом, компетентный специалист, рассматривающий как раскрытие этого изобретения, так и сведения, раскрытые в указанных выше патентах, сможет изготовить липосомы для обеспечения длительного высвобождения NRG.

Хотя специфические варианты реализации липосом обсуждались выше, настоящее изобретение носит более широкий характер, чем любая специфическая технология длительного высвобождения. Это изобретение включает открытие того факта, что длительное высвобождение NRG улучшает функцию инфарктного сердца и уменьшает внутренний диаметр левого желудочка. В данной области знаний в настоящее время известны многие варианты и различные типы липосом, которые можно использовать в практике раскрытого здесь изобретения.

C.4. Упаковка в микросферы

Еще в одном из вариантов реализации настоящего изобретения длительное высвобождение NRG в кровь включает упаковку NRG в микросферы. Микросферы продемонстрировали свою пригодность для доставки полезных активных агентов в целевую зону управляемым образом на протяжении длительных промежутков времени. Микросферы обычно подвержены биологическому распаду и их можно использовать для подкожного, внутримышечного и внутривенного введения.

Каждая микросфера обычно состоит из активного агента и молекул полимера. Как раскрыто в патенте США № 6268053, активный агент может быть центрально расположен внутри мембраны, образованной молекулами полимера, или, в альтернативном варианте, быть диспергированным по микросфере, поскольку внутренняя структура включает матрицу активного агента и полимерный наполнитель. Типично наружная поверхность микросферы проницаема для воды, что позволяет водным жидкостям проникать в микросферу, а солюбилизированному активному агенту и полимеру выходить из микросферы.

В одном из вариантов реализации изобретения полимерная мембрана включает поперечно сшитые полимеры, как это раскрыто в патенте США № 6395302. Если размер пор поперечно сшитого полимера равен гидродинамическому диаметру активного агента или меньше него, то активный агент, главным образом, высвобождается при разрушении полимера. С другой стороны, если размер пор поперечно сшитого полимера больше размера активного агента, то активный агент, по меньшей мере, частично высвобождается посредством диффузии.

В данной области знаний известны и применимы дополнительные способы изготовления мембран для микросфер, которые вполне пригодны в практической реализации раскрытого здесь изобретения. Типичные материалы для наружной мембраны включают следующие категории полимеров: (1) полимеры на основе углеводов, например метилцеллюлоза, полимеры на основе карбоксиметилцеллюлозы, декстран, полидекстроза, хитины, хитозан, крахмал (включая хетакрахмал) и их производные; (2) полиалифатические спирты, например полиоксиэтилен и его производные, включая полиэтиленгликоль (PEG), PEG-акрилаты, полиэтиленимин, поливинилацетат и их производные; (3) поли(виниловые) полимеры, например поли(виниловый) спирт, поли(винил)пирролидон, поли(винил)фосфат, поли(винил)фосфорная кислота и их производные; (4) полиакриловые кислоты и их производные; (5) полиорганические кислоты, например полималеиновая кислота, и их производные; (6) полиаминокислоты, например полилизин, полииминокислоты, например полииминотирозин, и их производные; (7) сополимеры и блоксополимеры, например полоксамер 407 или полимер Pluronic L-101^TM (блоксополимер полиоксиэтилена и полиоксипропилена), а также их производные; (8) трет-полимеры и их производные; (9) полиэфиры, например, поли(тетраметиленгликолевый эфир), и их производные; (10) полимеры природного происхождения, например зеин, хитозан, пуллунан, и их производные; (11) полиимиды, например, поли n-трис(гидрометил) метилметакрилат, и их птроизводные; (12) сурфактанты, например полиоксиэтиленсорбит, и их производные; (13) полиэфиры, например поли(этиленгликоль) (n)монометилэфир, моно(сукцинимидилсукцинат)эфир, и их производные; (14) разветвленные и циклические полимеры, например разветвленный PEG и циклодекстрины, а также их производные; (15) полиальдегиды, например поли(перфторпропилен оксид-b-перфторформальдегид), и их производные, как это раскрыто в патенте США № 6268053, содержание которого включено сюда в качестве ссылки. Другие типичные полимеры, известные среднему специалисту, включают поли(лактид-ко-гликолид), гомополимер полилактида, гомополимер полигликолида, поликапролактон, сополимер полигидроксибутирата-полигидроксивалерата, поли(лактид-ко-капролактон), полидиэфирамиды, полиортоэфиры, поли-β-гидроксимасляная кислота и полиангидриды, как это раскрыто в патенте США № 6517859, содержание которого включено сюда в качестве ссылки.

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения микросферу прикрепляют к дополнительным молекулам или покрывают ими. Такие молекулы могут облегчать нацеливание, усиливать рецепторное опосредование и защищать от эндоцитоза или разрушения. Типичные молекулы включают фосфолипиды, рецепторы, антитела, гормоны и полисахариды. Дополнительно к наружной поверхности микросфер можно прикрепить одну или более расщепляемых молекул для нацеливания в определенное место. Затем в подходящих биологических условиях такая молекула расщепляется, что приводит к высвобождению микросферы из целевого участка.

Микросферы для этого изобретения изготавливают по стандартным методикам. Например, в одном из вариантов реализации изобретения, исключение объема осуществляют, перемешивая раствор активного агента с раствором полимера или смеси полимеров в присутствии источника энергии на протяжении достаточного времени для образования частиц, как это раскрыто в патенте США № 6268053. Осуществляют подгонку pH раствора до уровня, близкого к изоэлектрической точке (pI) макромолекулы. Затем раствор подвергают воздействию источника энергии, например тепловой, облучению, ионизации в изолированном виде или в комбинации с ультразвуком, вихревым воздействием, перемешиванием или взбалтыванием для образования микрочастиц. Затем полученные микрочастицы отделяют от любых некорпорированных компонентов, присутствующих в растворе, применяя для этого способы физической сепарации, хорошо известные компетентному специалисту, после чего их можно отмыть. Другие стандартные процедуры изготовления описаны в патентах США №№ 6669961, 6517859, 6458387, 6395302, 6303148, 6268053, 6090925, 6024983, 5942252, 5981719, 5578709, 5554730, 5407609, 4897268 и 4542025, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте.

Микросферы хорошо известны в данной области знаний и вполне доступны среднему специалисту из компаний, специализирующихся на таких технологиях доставки лекарств с длительным высвобождением. Например, компания Epic Therapeutics, дочерняя структура корпорации Baxter Healthcare, разработала систему доставки лекарств PROMAXX^® типа белковой матрицы, которая продуцирует подверженные биологическому распаду белковые микросферы в полностью водном процессе. Компания OctoPlus разработала систему OctoDEX^®, представляющую собой поперечно сшитые декстрановые микросферы, которые высвобождают активные ингредиенты, причем высвобождение в большей степени основано на объемном разрушении матрицы, чем на поверхностной эрозии. Компания Brόokwood Pharmaceuticals рекламирует доступность своих технологий микрочастиц для доставки лекарств.

Поиск патентов, опубликованных патентных заявок и родственных публикаций ознакомит компетентных специалистов, изучающих настоящее изобретение, со многими доступными технологиями, основанными на микрочастицах. В качестве примеров можно привести патенты США №№ 6669961, 6517859, 6458387, 6395302, 6303148, 6268053, 6090925, 6024983, 5942252, 5981719, 5578709, 5554730, 5407609, 4897268 и 4542025, описывающие микросферы и способы их производства, содержание которых включено сюда в качестве ссылки во всей полноте. Компетентный специалист, рассматривающий как раскрытие этого изобретения, так и сведения, раскрытые в указанных выше патентах, сможет изготовить микросферы для обеспечения длительного высвобождения NRG.

D. Дозировка и частота введения

Количество нейрегулина, применяемого в настоящем изобретении, будет варьироваться в зависимости от природы и тяжести заболевания или состояния, а также от способа введения активного ингредиента. Частота и дозировка также будут различаться в зависимости от факторов, специфичных для каждого больного, включая специфичность лечения (например, введение терапевтических или профилактических агентов), тяжесть заболевания, расстройства или патологического состояния, способ введения, а также возраст, массу тела, реакцию на лечение и медицинский анамнез больного. Эффективные дозы можно рассчитать, экстраполируя значения из кривых дозовой зависимости, полученных в системах тестирования in vitro или на животных моделях.

Типичные дозы нейрегулина включают количественные величины порядка миллиграммов или микрограммов на килограмм веса субъекта или образца (например, приблизительно от 1 микрограмма на килограмм до 500 миллиграммов на килограмм, приблизительно от 100 микрограммов на килограмм до 5 миллиграммов на килограмм или приблизительно от 1 микрограмма на килограмм до 50 микрограммов на килограмм). Для длительного высвобождения нейрегулина, составляющего основу изобретения, типичная доза, вводимая больному, составляет от 0,001 мг/кг до 15 мг/кг веса тела больного, основываясь на весе активного пептида. Предпочтительная доза, вводимая больному, составляет от 0,001 мг/кг до 15 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 10 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 5 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 4 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 3 мг/кг, от 0,01 мг/кг до 2 мг/кг, от 0,001 мг/кг до 1 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 0,5 мг/кг, от 0,010 мг/кг до 0,2 мг/кг, от 0,005 мг/кг до 0,050 мг/кг веса тела больного.

Типичные дозы нейрегулина также включают единицу (U) или количество единиц нейрегулина на килограмм веса субъекта или образца (например, приблизительно от 1 U на килограмм до 5000 U на килограмм, приблизительно от 10 U на килограмм до 1000 U на килограмм или приблизительно от 100 U на килограмм до 500 U на килограмм). Для длительного высвобождения нейрегулина, составляющего основу изобретения, типичная доза, вводимая больному, составляет от 10 U/кг до 1000 U/кг веса тела больного, основываясь на весе активного пептида. Предпочтительная доза, вводимая больному, составляет от 1 U/кг до l0000 U/кг, от 1 U/кг до 5000 U/кг, от 10 U/кг до 5000 U/кг, от 10 U/кг до 1000 U/кг, от 50 U/кг до 2000 U/кг, от 50 U/кг до 1000/кг, от 50 U/кг до 500 U/кг, от 100 U/кг до 1000 U/кг, от 100 U/кг до 500 U/кг, от 100 U/кг до 200 U/кг веса тела больного.

В целом рекомендованный диапазон ежедневных доз нейрегулина в тех способах, которые предложены изобретением для применения в описанных здесь ситуациях, составляет приблизительно от 0,001 мг до 1000 мг в день. Специфический диапазон суточных доз варьируется от 0,001 мг в день до 15 мг в день, от 0,005 мг в день до 10 мг в день, от 0,01 мг в день до 5 мг в день, от 0,001 мг в день до 4 мг в день, от 0,005 мг в день до 3 мг в день, от 0,01 мг в день до 2 мг в день, от 0,001 мг в день до 1 мг в день, от 0,005 мг в день до 0,5 мг в день, от 0,010 мг в день до 0,2 мг в день. При ведении больного лечение можно начинать с меньшей дозы, например, приблизительно от 0,1 мкг до 1 мкг, по мере необходимости повышая дозу и доводя ее приблизительно до 20 мкг-1000 мкг в день (допускается как разовое, так и дробное введение) в зависимости от общей реакции больного на лечение. В некоторых случаях может возникнуть необходимость в применении доз активного ингредиента, выходящих за указанные здесь диапазоны, что должно быть понятно среднему специалисту. Кроме того, следует заметить, что клиницист или лечащий врач будут знать, как и когда надо сделать перерыв в лечении, отрегулировать дозировку или прекратить терапию в зависимости от индивидуальной реакции больного. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят в количестве приблизительно от 1 U в день до 10000 U в день. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят в количестве приблизительно от 1 U в день до 5000 U в день. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят в количестве приблизительно от 10 U в день до 2000 U в день. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят в количестве приблизительно от 10 U в день до 1000 U в день. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят в количестве приблизительно от 100 U в день до 200 U в день.

Нейрегулин также можно вводить по определенному графику или в соответствии с "терапевтическим циклом". Ежедневная дозировка нейрегулина в таком терапевтическом цикле подробно описана выше. Терапевтический цикл может продолжаться 2 дня, 5 дней, 7 дней, 10 дней, две недели, три недели, четыре недели, пять недель или шесть недель.

В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят ежедневно на протяжении всего терапевтического цикла. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят последовательно в течение трех, четырех, пяти, шести, семи, восьми, девяти, десяти, одиннадцати или двенадцати дней терапевтического цикла.

В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят в 1-й день терапевтического цикла, после чего цикл завершается одним или несколькими днями без введения нейрегулина. В некоторых вариантах реализации изобретения нейрегулин вводят ежедневно в течение 3, 5, 7 или 10 дней с последующим перерывом в терапевтическом цикле.

E. Комбинированная терапия

В одном из вариантов реализации настоящего изобретения она полезна для предупреждения сердечной недостаточности и кардиомиопатии у больных, получавших лечение препаратом, который может вызвать гипертрофию сердца или сердечную недостаточность, например флудрокортизона ацетатом или герцептином. NRG можно вводить перед лекарством, вызывающим указанную патологию сердца, одновременно с ним или после него.

В другом варианте реализации изобретения NRG вводят в комбинации с эффективным количеством соединения, которое действует, супрессируя другой путь индукции гипертрофии по сравнению с NRG. В альтернативном варианте реализации изобретения NRG вводят в комбинации с перечисленными ниже супрессорами гипертрофии и/или добавочными компонентами, включая, но не ограничиваясь ими: кардиотрофический ингибитор, например антагонист Ct-1 (кардиотрофина-1), ингибитор ACE, например капроприл (Capoten^®) и/или гормон роста человека и/или IGF-I (инсулиноподобный фактор роста I) в случае застойной сердечной недостаточности, другой антигипертрофический, миокардиотрофический фактор, антиаритмический или инотропный фактор в случае сердечной недостаточности другого типа или другого сердечного заболевания.

В другом варианте реализации изобретения NRG вводят в комбинации с современными терапевтическими средствами для лечения сердечной недостаточности, включая, но не ограничиваясь ими, ингибиторы ACT и другие вазодилататоры, диуретики, препараты наперстянки, бета-блокаторы, разжижители крови, блокаторы рецепторов антиотензина II, блокаторы кальциевых каналов или калий.

Ингибиторы ACE, предупреждающие превращение ангиотензина I в ангиотензин II, действуют как вазодилататоры, заставляя кровеносные сосуды расширяться, снижая артериальное давление и уменьшая рабочую нагрузку на сердце. Вазодилататоры, пригодные для применения в различных вариантах реализации настоящего изобретения, включают (без ограничений) следующие лекарства: квинаприл (Accupril^®), рамиприл (Altace^®), каптоприл (Capoten^®), беназеприл (Lotensin^®), фозиноприл (Monopril^®), лизиноприл (Prinivil^® или Zestril^®), эналаприл (Vasotec^®), моэкзиприл (Univasc^®), трандолаприл и периндоприл. Дополнительные вазодилататоры, полезные в настоящем изобретении, включают (без ограничений) изосорбид-динитрат (Isordil^®), незиритид (Natrecor^®), гидралазин (Apresoline^®), нитраты и миноксидил.

Диуретики заставляют почки выводить из кровотока натрий и воду, уменьшая рабочую нагрузку на сердце, и включают (без ограничений) следующие лекарства: гипотиазид (HydroDIURIL^®), хлортиазид (Diuril^®), фуросемид (Lasix^®), буметанид (Bumex^®), спиронолактон (Aldactone^®), триамтерен (Dyrenium^®), метолазон (Zaroxolyn^®), торсемид, индапамид, политиазид, амилорид и комбинацию агентов (Dyazide^®).

Препараты наперстянки увеличивают силу сердечных сокращений и включают (без ограничений) дигоксин (Lanoxin^®) и дигитоксин.

Бета-блокаторы снижают тенденцию сердца к быстрым сокращениям и включают (без ограничений) следующие лекарства: карведилол (Coreg^®) метопролол (Lopressor^® или Toprol XL^®), атенолол, бисопролол, лабеталол, пропранолол, соталол, пиндолол, пенбутолол, ацебутолол, тимолол, надолол и бетаксолол.

Разжижители крови, которые пригодны для использования в настоящем изобретении, включают (без ограничений) варфарин (Coumadin^®) и гепарин.

В различных вариантах реализации настоящего изобретения также могут быть использованы блокаторы рецепторов ангиотензина II, которые скорее не понижают уровень ангиотензина II, как это делают ингибиторы ACE, а не позволяют ангиотензину II воздействовать на сердце и кровеносные сосуды. Блокаторы рецепторов ангиотензина II, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают (без ограничений) иосартан (Cozaar^®), валсартан (Diovan^®), ирбесартан (Avapro^®), кандесартан, эпросартан, телмисартан и олмесартан.

Блокаторы кальциевых каналов обычно применяют для лечения высокого артериального давления, часто сопровождающего сердечную недостаточность. Блокаторы кальциевых каналов, пригодные для использования в настоящем изобретении, включают (без ограничений) амлодипин (Norvasc^®).

В альтернативных вариантах реализации настоящего изобретения длительное высвобождение NRG также можно комбинировать с введением лекарств для лечения сердечно-сосудистых заболеваний, например артериальной гипертонии. Например, NRG можно вводить в комбинации с антагонистами рецепторов эндотелина, например антителами к рецепторам эндотелина, а также с пептидами и другими мелкими молекулами антагонистами, с антагонистами бета-адренорецепторов, например карведилолом, с антагонистами альфа-адренорецепторов, с антиоксидантами, с соединениями, обладающими множественной активностью (например бета-блокатор/альфa-блокатор/антиоксидант), с карведилол-подобными соединениями или комбинацией соединений, обладающей множественными функциями наподобие карведилола, с гормоном роста и т.д.

Агонисты нейрегулина в виде самостоятельной терапии или в комбинации с агонистами супрессоров других путей гипертрофии или с молекулами, которые проявляют антагонизм к известным путям индукции гипертрофии, полезны в качестве лекарств для лечения in vivo млекопитающих, которые страдают сердечной недостаточностью, а также для предупреждения или ослабления патологических эффектов сердечной недостаточности.

Лекарственные составы на основе агонистов, предназначенные для лечения заболеваний сердца, готовят перед хранением, смешивая агонист(ы) с желательной степенью чистоты и, по выбору, физиологически приемлемые носители, наполнители или стабилизаторы (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16^th edition, Oslo, A., Ed., 1980), в форме лиофилизированного брикета или водного раствора. Приемлемыми носителями, наполнителями или стабилизаторами считаются вещества, нетоксичные для реципиентов в применяемых дозах и концентрациях. Они включают такие буферы как фосфаты, цитраты и другие органические кислоты, антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту, полипептиды низкого молекулярного веса (имеющие менее приблизительно 10 аминокислотных остатков), белки, например сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины, гидрофильные полимеры, например поливинилпирролидон, аминокислоты, например глицин, глутамин, аспарагин, аргинин или лизин, моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины, хелирующие агенты, например ЭДТА, сахарные спирты, например маннитол или сорбитол, солеобразующие противоионы, например натрий, а также неионные сурфактанты, например твин, плюроники (блок-сополимеры этилена и оксида пропилена) или полиэтиленгликоль (PEG). Пригодны также антагонист(ы), сцепленные с одним из множества небелковоподобных полимеров, например с полиэтиленгликолем, полипропиленгликолем или полиалкиленами таким образом, как это описано в патентах США №№ 4640835, 4496689, 4301144, 4670417, 4791192 или 4179337. Количество носителя, использованное в лекарственном составе, может варьироваться приблизительно от 1 до 99%, предпочтительнее приблизительно от 80 до 99%, а оптимально от 90 до 99% по весу.

Агонист(ы), применяемые для введения in vivo, должны быть стерильными. Это легко достигается способами, известными в данной области знаний, например, фильтрацией через стерильные фильтрующие мембраны перед лиофилизацией и восстановлением или после них. Агонист(ы) обычно хранят в лиофилизированной форме или в растворе.

Терапевтические композиции агонистов обычно помещают в контейнер со стерильным входным отверстием, например в мешок для внутривенного раствора или во флакон с пробкой, которую можно проколоть иглой для подкожных инъекций. Введение агонистов проводят только хроническим образом, например, одним из следующих способов: инъекция или инфузия с внутривенным, внутрибрюшинным, внутримозговым, внутримышечным, внутриглазным, внутриартериальным доступом или введение внутрь пораженных тканей, а также перорально или с применением систем длительного высвобождения, как указывалось выше.

Как обсуждалось выше, подходящие примеры препаратов с длительным высвобождением включают полупроницаемые матрицы или твердые гидрофобные полимеры, содержащие белок, причем в виде фасонных изделий, например пленок или микрокапсул. Примеры матриц с длительным высвобождением включают полиэфиры, гидрогели (например, поли(2-гидроксиэтилметакрилат), как это описано в ссылках Langer et al. (1981) J. Biomed. Mater. Res. 15:167-277 и Langer (1982) Chem. Tech. 12:98-105, или поли(виниловый спирт), полилактиды (патент США № 3773919, EP 58481), сополимеры L-глутаминовой кислоты и гамма-этил-L-глутамат (Sidman et al. (1983) Biopolymers 22:547-556), не подверженный распаду этиленвинилацетат (Langer et al. (1981) выше), разрушающиеся сополимеры молочной и гликолевой кислот, например Lupron Depot^TM (инъекционные микросферы, состоящие из сополимера молочной и гликолевой кислот и лейпролид ацетата), а также поли-D-(-)-бета-гидроксимасляная кислота (EP 133988).

Агонист(ы) также могут быть заключены в микрокапсулы, изготовленные, например, по методикам коацервации или межфазной полимеризации (например, микрокапсулы из гидроксиметилцеллюлозы или желатина и поли[метилметакрилата], соответственно), в коллоидные системы доставки лекарств (например, липосомы, альбуминовые микросферы, микроэмульсии, наночастицы и нанокапсулы) или в макроэмульсии. Такие методики раскрыты в ссылке Remington's Pharmaceutical Sciences, выше.

Если такие полимеры как этиленвинилацетат и сополимер молочная кислота-гликолевая кислота дают высвобождение молекул более 100 дней, то некоторые гидрогели высвобождают молекулы на протяжении более коротких периодов времени. Если инкапсулированные молекулы остаются в организме длительное время, они могут денатурироваться или агрегироваться в результате контакта с влагой при температуре 37°C, что приводит к потере биологической активности и возможным изменениям иммуногенных свойств. Можно продумать рациональные стратегии для стабилизации в зависимости от вовлеченных механизмов, например применять подходящие добавки и разрабатывать специфические композиции полимерных матриц.

Композиции агонистов длительного высвобождения также включают агонисты, заключенные в липосомы. Липосомы, содержащие агонисты, изготавливают способами, известными в данной области знаний, например, раскрытыми в патенте DE 3218121, а также в ссылках Epstein et al. (1985) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688-3692; Hwang et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030-4034: EP 52322; EP 36676; EP 88046; EP 143949; EP 142641; патентная заявка Японии 83-118008; патенты США №№ 4485045 и 4544545; а также EP 102324. Специфический пример лекарственного состава с длительным высвобождением приведен в документе EP 647449.

Еще в одном варианте реализации настоящего изобретения NRG комбинируют или вводят совместно с другими агентами для лечения застойной сердечной недостаточности, включая ингибиторы ACE (как обсуждалось выше), ингибиторами CT-1, гормоном роста человека и/или IGF-I. Эффективное количество таких агентов при их назначении определяется по усмотрению клинициста. Способ введения и подбор доз осуществляются способами, известными компетентному специалисту, причем они направлены на лучшие результаты при ведении больных с застойной сердечной недостаточностью, в идеале принимая во внимание диуретики и препараты наперстянки, а также такие состояния как гипотония и почечная недостаточность. Кроме того, доза зависит от таких факторов, как тип используемого лекарства и специфические особенности больного, получающего лечение. В типичном варианте используемое количество будет в точности соответствовать дозе, которая была бы адекватна при введении активного агента без агониста. Однако могут быть использованы пониженные дозы в зависимости от таких факторов, как наличие побочных эффектов, заболевание, подлежащее лечению, типаж больного и тип агониста и лекарства при том условии, что общее количество агентов создает эффективную дозу для борьбы с заболеванием, подлежащим лечению.

Компетентные специалисты смогут по достоинству оценить тот факт, что настоящее изобретение допускает возможность множества вариаций и/или модификаций, которые продемонстрированы в специфических вариантах его реализации без отклонений от духа или сферы применения изобретения. Следовательно, представленные здесь варианты реализации изобретения надо рассматривать как иллюстративные, а не как ограничивающие.

F. Наборы

Изобретение также предлагает наборы для выполнения схем лечения в соответствии с основной идеей этого изобретения. Такие наборы включают содержащиеся в одном или более контейнеров терапевтически эффективные количества NRG, описанные здесь, либо в чистом виде, либо в комбинации с другими агентами, в фармацевтически приемлемой форме и с применением технологии длительного высвобождения, которая описана в этой заявке. По выбору в наборы могут быть включены инструкции по введению композиций NRG с длительным высвобождением для врача или для больного.

G. Примеры

Как показано в примерах, изобретение основано на открытии того факта, что длительное высвобождение NRG активирует сигнальный путь AKT или ERK не менее эффективно, чем доставка NRG другими способами, причем улучшает функцию инфарктного сердца намного больше, чем доставка NRG другими способами. Однако изобретение также имеет более широкое применение к другим заболеваниям и расстройствам при том условии, что эти заболевания (например, болезни центральной и периферической нервной системы) вовлекают взаимодействия NRG с рецепторами ErbB. Конкретные примеры других заболеваний и расстройств включают различные сердечно-сосудистые заболевания, рак, заболевания нервной системы и/или мышечные заболевания, включая мышечные дистрофии (например, Дюшенна, поясов конечностей), а также рассеянный склероз, спинальные травмы, болезни глаза и уха, диабет, шизофрению и болезнь Альцгеймера.

Изобретение далее будет проиллюстрировано ссылками на следующие примеры (неограничивающие). Примеры даны таким образом, чтобы дать среднему специалисту полное раскрытие и описание того, как можно использовать настоящее изобретение, но не направлены на то, чтобы ограничить сферу действия изобретения, которую представляют себе его авторы, а также не должны создать впечатление, что представленные в примерах эксперименты - это все и единственно возможные эксперименты, которые были выполнены. Авторами были предприняты все усилия, чтобы обеспечить точность в отношении использованных цифровых данных, но при этом надо принимать во внимание допустимые ошибки эксперимента и отклонения.

ПРИМЕР 1

Фосфорилирование AKT и ERK в левом желудочке сердца у здоровых крыс после инфузии NRG различными способами.

Для того чтобы сравнить эффект NRG при разных способах воздействия на сигнальную трансдукцию в миоцитах левого желудочка сердца, авторы проводили инъекции NRG внутривенно (далее в тексте "IV"), внутримышечно (далее в тексте "IM") и вместе с IV тестом на толерантность к глюкозе (далее в тексте "IVGTT").

Самцы крыс линии Wistar (Шанхайский центр животных Академии наук Китая) весом 180±20 граммов были пронумерованы, взвешены и разделены на группы. Каждая группа состояла из трех крыс. Одна группа получала IV инъекцию из расчета 4 мл/кг (объем/вес тела) носителя (10 мМ Na₂HPO₄-NaH₂PO₄, 150 мМ NaCl, 0,2% сывороточного альбумина человека (HSA), 5% маннитола, pH 6,0) в качестве контроля. Четыре другие группы крыс получали IM инъекцию из расчета 4 мл/кг (объем/вес тела) NRG (37,3 U/мл фрагмента рекомбинантного NRG человека (от 177-го до 237-го аминокислотного остатка последовательности NRG1β2 человека, произведенной компанией Zensun Science & Technology - номер партии 200503002)), растворенного в носителе (описанном выше). Еще четыре группы крыс получали IV инъекцию из расчета 4 мл/кг (объем/вес тела) NRG (как описано выше). Еще пять групп крыс получали внутривенное вливание NRG (как описано выше) из расчета 20 мкл/мин при проведении двухчасового теста на толерантность к глюкозе (IVGTT). Таким образом, общее количество NRG, введенного каждой крысе (за исключением контрольной группы), составляло 149,3 U/кг веса тела.

Крыс умерщвляли поодиночке через 20 минут, 1 час, 2 часа, 4 часа и 6 часов. Левые желудочки сердца крыс в каждой группе разрезали на кусочки в холодном лизисном буфере (50 мМ Tris pH 7,4, 5 мМ EDTA, 150 мМ NaCl, 1% Triton X-IOO, 2 мМ Na₂VO₄, 50 мМ NaF, 2 мМ PMSF, коктейль ингибиторов протеазы (без EDTA, Roche)), затем объединяли и отмывали холодным PBS. После этого желудочки гомогенизировали в ледяной воде и центрифугировали (Kendro Biofuge) на скорости 12000 оборотов в минуту в течение 5 минут при 4°C в пробирках Эппендорфа объемом 1,5 мл. Надосадочную жидкость собирали и еще раз вращали, а затем хранили ее при -80°C. Перед использованием образцы оттаивали и еще раз вращали. Концентрацию белка в каждом образце определяли при помощи белкового анализа BCA (набор анализа для белков Pierce BCA). Определенное количество каждого образца смешивали с 2× буфером для образцов (0,125 M Tris pН 6,8, 20% глицерина, 4% SDS, 0,2 M DTT, 0,012% бромфенолового синего) и кипятили для электрофореза перед переносом на мембрану PVDF (Millipore). Фосфорилирование AKT и ERK, а также количество AKT и ERK в каждом образце определяли при помощи антител (антитела к ERK и антитела к фосфорилированному ERK (Santa Cruz Biotechnology), антитела к AKT и антитела к фосфорилированному AKT (Cell Signaling)).

Динамика фосфорилирования AKT и ERK по времени в левом желудочке сердца у здоровых крыс после инфузии NRG каждым из указанных способов показана на фиг.1. По сравнению с носителем (контроль) введение NRG посредством IM, IV и IVGTT активировало длительное фосфорилирование ERK. Фосфорилирование AKT, индуцированное каждым способом, давало пик через 20 минут, а снижение происходило через l час, но через 2 часа наблюдался новый подъем с сохранением высокого уровня от 4 часов до 6 часов. Таким образом, не выявлено явных различий между разными способами впрыскивания NRG в отношении их способности поддерживать фосфорилирование ERK и AKT. Это свидетельствует о том, что длительное вливание NRG столь же эффективно, как и инъекция NRG. Таким образом, инфузия по типу IVGTT является потенциальным способом выбора для лечения больных с плохим состоянием сердечной функции.

ПРИМЕР 2

Функция коронарной артерии левого желудочка в лигированном сердце крысы после лечения нейрегулином разными способами

Поскольку осмотический насос представляет собой способ постоянной доставки NRG (наподобие IVGTT), авторы исследовали вопрос о том, будет ли инфузия NRG посредством осмотического насоса столь же эффективна, как и обычная IV инъекция в восстановлении функции сердца, пораженного инфарктом миокарда (MI).

A. Наложение лигатуры на коронарную артерию левого желудочка крысы и эхокардиография

Самцам крыс линии Wistar (Шанхайский центр животных Академии наук Китая) весом 200±20 г, проводили анестезию посредством внутрибрюшинной инъекции кетамина из расчета 100 мг/кг (лекарство/вес тела). Шею и грудную клетку животных депилировали и дезинфицировали. Для обнажения трахеи делали разрез посередине шеи спереди. В трахею между 3-м и 5-м хрящами вставляли поверх иглы катетер калибра 18G. После извлечения иглы в трахею на 1-2 см вталкивали пластмассовую канюлю и фиксировали ее для присоединения вентилятора для грызунов (вентилятор SAR-830/P - скорость инспираторного потока 1 мл/100 г/дыхание, частота дыханий 60 в минуту). Другой разрез делали на грудной клетке спереди и слева. Кожу тупо расслаивали для обнажения четвертого и пятого ребер, после чего четвертое ребро разрезали изогнутым кровоостанавливающим зажимом типа "москит". Вентилятор (как описано выше) присоединяли к канюле и включали, а сердце обнажали для проверки состояния легких и сердца. Перикард вскрывали для идентификации левого предсердия и конуса легочной артерии после выведения сердца наружу через разрез. На нисходящую коронарную артерию левого желудочка накладывали тугую лигатуру медицинским шовным материалом 6/0, после чего сердце возвращали в грудную клетку. Торакальный разрез зашивали. Вентилятор блокировали до полного заполнения легких. После осторожного выдавливания воздуха из полости грудной клетки мышцы и кожу грудной клетки зашивали. Вентиляторы не извлекали из крыс до тех пор, пока не восстанавливалось стабильное спонтанное дыхание.

Затем на 14-й день после наложения лигатуры у крыс исследовали функцию сердца при помощи эхокардиографии (датчик Philips Sonos 7500 S4). Крыс с фракцией высвобождения (далее в тексте "EF") от 30 до 50 процентов отделяли и группировали (15 животных на группу).

B. Лечение лигированных крыс нейрегулином.

На 15-й день после наложения лигатуры на коронарную артерию левого желудочка крыс взвешивали, чтобы определить необходимое количество NRG. Крысы в контрольной группе получали носитель из расчета 0,4 мл/100 г (объем/вес тела) через IV инъекцию. Инъекции носителя проводили один раз в день на протяжении пяти дней подряд, затем делали двухдневный перерыв, после которого инъекции проводили еще пять дней.

Группы крыс IM и IV получали соответствующие инъекции NRG (количество NRG составляло 149,3 U/кг (белок/вес тела), а объем 0,4 мл/100 г).

Инъекции NRG проводили один раз в день на протяжении пяти дней подряд, затем делали двухдневный перерыв, после которого инъекции проводили еще пять дней.

Как обсуждается ниже, в группе IVGTT были использованы осмотические насосы (ALZET 2ML1), имплантированные на пятый день после формирования группы. Каждый насос содержал 2 мл раствора NRG, в котором содержалось 933,1 U NRG (поскольку крысы теперь весили около 250 г), а скорость инфузии составляла приблизительно 18,7 U/кг/час. Таким образом, максимальная концентрация лекарства приблизительно соответствовала 2,67 U/кг при IV инъекции.

Через 7 дней у всех животных повторно проверяли функцию сердца при помощи эхокардиографии (датчик Philips Sonos 7500 S4) На следующий день также предпринимали исследование гемодинамических параметров и анатомическую проверку с целью дальнейшего подтверждения функции сердца у животных.

B.1. Имплантация осмотического насоса крысам (все этапы должны быть стерильными)

1 мл стерильной воды и 1 мл стерильного 0,9% физиологического раствора последовательно впрыскивали под вытяжным колпаком во флакон с NRG (993,1 U, 62,5 мкг). Раствор NRG выкачивали в стерильный шприц. На шприц надевали новую иглу (тупоконечную) и удаляли из шприца пузырек воздуха. Затем, удерживая насос вертикально, вводили иглу через маленькое отверстие в его верхней части до тех пор, пока ее продвижение не останавливалось. Поршень шприца медленно подавали вперед, чтобы ввести в насос раствор NRG, и продолжали введение до тех пор, пока раствор не переполнял насос. Иглу извлекали, а насос вытирали дочиста. Прозрачный колпачок регулятора потока снимали, чтобы обнажить короткую трубочку из нержавеющей стали. Затем стальную трубочку вставляли в конец трубки PE60 длиной 5 см. В другой конец трубки PE60 вставляли иглу шприца. Поршень шприца подавали вперед, чтобы добавить раствор NRG в регулятор потока вплоть до его заполнения. Затем длинную трубку регулятора потока вставляли в насос до тех пор, пока белый фланец регулятора не соединится с насосом. Иглу извлекали из регулятора потока, после чего замачивали насос в стерильном 0,9% физиологическом растворе с температурой 37°C на ночь.

Крысам делали наркоз кетамином (как описано выше). Участок тела крыс между шеей и плечом депилировали и дезинфицировали. Тело накрывали куском стерильной влажной ткани. Затем производили аккуратный разрез кожи между лопатками, чтобы найти и выделить наружную яремную вену. На дистальный конец вены (от сердца) накладывали лигатуру. Глазными ножницами в стенке наружной яремной вены проделывали маленькое отверстие и расширяли его микрокусачками. Трубку PE60, присоединенную к осмотическому насосу, вставляли в вену через проделанное отверстие на 2 см. Затем проксимальный конец вены (от сердца) связывали с трубкой PE60 для фиксации трубки. Дистальный конец вены, охватывающий трубку PE60, туго завязывали для большей фиксации трубки. При помощи кровоостанавливающего зажима проделывали туннель, тупо сепарируя кожу от разреза до лопатки. В конце этих манипуляций, дополнительно разводя кожу, на спине крысы делали карман, расположенный в среднелопаточной области. Насос продвигали через туннель в карман с регулятором потока, направленным в противоположную сторону от разреза. После этого кожный разрез закрывали швом. После выхода из наркоза крыс возвращали в виварий и кормили, как обычно.

C. Результаты эксперимента

Функция инфарктного сердца после IVGTT и IV инфузии NRG показана ниже в таблице 1. В таблице 1 аббревиатуры "IVS", "LVEDD", "PW", "LVESD", "EF", "FS" и "CC" означают межпредсердную перегородку, размер левого желудочка в конце диастолы, толщину задней стенки, размер левого желудочка в конце систолы, фракцию высвобождения, фракцию укорочения и сердечный цикл, соответственно. Здесь показатели EF и FS отражают сократимость сердца, особенно применительно к левому желудочку.

В таблице 1 при сравнении показателей LVEDD, LVESD, EF и FS в группах IVGTT и IV с соответствующими показателями в контрольной группе (носитель) получено значение P<0,01, указывающее на статистически высокозначимое различие.

Таблица 1.
Функция сердца у крыс с MI после IVGTT и IV инфузии NRG   IVS LVEDD PW LVESD EF FS CC см см см см % % мсек носитель 0,168±0,005 0,952±0,082 0,173±0,009 0,819±0,107 34,3±5,0 14,5±2,4 162,5±23,1 IVGTT 0,169±0,007 0,857±0,093 0,190±0,013 0,644±0,061 54,6±5,4 25,2±3,0 173,1±22,5 IV 0,177±0,027 0,912±0,081 0,189±0,013 0,759±0,099 40,5±8,9 17,5±4,6 164,5±18,2

При инфузии из осмотического насоса NRG значительно усиливает функцию сердца у крыс с MI по сравнению с группой IV. Особенно впечатляет величина EF - мера эффективности перекачивания крови сердцем, которую можно использовать для оценки функции левого желудочка. В группе IVGTT этот показатель был на 59,18% выше, чем в контрольной группе, и на 34,81% выше, чем в группе IV. В дополнение к этому, величина FS, которая также является мерой рабочей производительности левого желудочка, в группе IVGTT была на 73,79% выше, чем в контрольной группе, и на 44,0% выше, чем в группе IV. Эти результаты показывают, что длительное высвобождение NRG более эффективно в отношении улучшения функции сердца, чем обычные IV инъекции.

Удивительно, что NRG при инфузии из осмотического насоса не только значительно усиливает функцию сердца у крыс с MI по сравнению с группой IV, но также уменьшает внутренний диаметр левого желудочка. Конкретно, средний размер левого желудочка в конце диастолы (далее в тексте "LVEDD") в группе IVGTT был на 9,98% меньше, чем в контрольной группе, и на 6,03% меньше, чем в группе IV. В дополнение к этому, средний размер левого желудочка в конце систолы (далее в тексте "LVESD") в группе IVGTT был на 21,37% меньше, чем в контрольной группе, и на 15,15% меньше, чем в группе IV. Эти результаты показывают, что постоянное введение NRG способствует уменьшению объема и массы левого желудочка, то есть улучшает его общее состояние и рабочую производительность.

ПРИМЕР 3

Функция сердца у крыс с инфарктом миокарда после непрерывного внутривенного вливания нейрегулина шприцевым насосом (Zhejiang University Medical Instrument Co. LTD, WZS 50-F2)

В этом примере для длительного высвобождения нейрегулина в кровь больных крыс был использован шприцевой насос. Шприцевой насос может непрерывно и с заданной скоростью подавать раствор в кровоток, например, через иглу, введенную в вену крысиного хвоста. При использовании шприцевого насоса можно легко контролировать время и скорость инфузии. Внутривенное вливание нейрегулина крысам с MI проводили шприцевым насосом с разной скоростью и в течение разного времени, чтобы выбрать оптимальную продолжительность и оптимальную скорость вливания как лечебной процедуры.

Разделенные на группы крысы с MI получали либо внутривенные инъекции носителя из расчета 4 мл/кг (объем/вес тела) ежедневно в течение 10 дней (группа A), либо внутривенные инъекции нейрегулина из расчета 10 мкг/кг (2,5 мкг/мл) ежедневно в течение 10 дней (группа B), либо внутривенные вливания нейрегулина шприцевым насосом (0,625 мкг/мл) из расчета 1,25 мкг/кг/час по 4 часа ежедневно в течение 10 дней (группа C), либо внутривенные вливания нейрегулина шприцевым насосом (1,25 мкг/мл) из расчета 2,5 мкг/кг/час по 4 часа ежедневно в течение 10 дней (группа D), либо внутривенные вливания нейрегулина шприцевым насосом (0,625 мкг/мл) из расчета 0,625 мкг/кг/час по 8 часов ежедневно в течение 10 дней (группа E), либо внутривенные вливания нейрегулина шприцевым насосом (1,25 мкг/мл) из расчета 1,25 мкг/кг/час по 8 часов ежедневно в течение 10 дней (группа F). Затем во всех группах проводили эхокардиографию для исследования функции сердца.

Таблица 2.
Данные эхокардиографии у крыс с MI после внутривенного вливания шприцевым насосом (ISPI) или IV инъекции NRG     IVS LVEDD PW LVESD EF FS HR см см см см % % /мин A носитель 0,057±0,003 0,947±0,041 0,142±0,013 0,811±0,047 34,5±3,3 14,4±1,6 418±51 B IV 0,060±0,005 0,924±0,060 0,164±0,016 0,770±0,057 41,5±2,6 17,8±1,6 382±52 C ISPI
1,25 мкг/кг/час
4 часа в день 0,059±0,005 0,935±0,050 0,156±0,013 0,779±0,067 41,2±5,7 17,7±2,8 395±30 D ISPI
2,5 мкг/кг/час
4 часа в день 0,061±0,004 0,943±0,058 0,160±0,015 0,762±0,055 43,7±5,4 19,0±2,9 391±41 E ISPI
0,625 мкг/кг/час
8 часов в день 0,062±0,006 0,941±0,061 0,164±0,011 0,742±0,079 47,4±8,6 21,1±4,5 391±48 F ISPI
1,25 мкг/кг/час
8 часов в день 0,061±0,004 0,966±0,038 0,166±0,019 0,766±0,045 47,2±4,2 20,8±2,5 364±33

При сравнении показателей LVEDD, LVESD, EF и FS во всех группах ISPI и группе IV с соответствующими показателями в контрольной группе (носитель) получено значение P<0,01, указывающее на статистически высокозначимое различие. Аббревиатура HR означает частоту сердечных сокращений.

Как показано в таблице 2, при сопоставлении с контрольной группой (носитель) IV инъекции нейрегулина (группа B) улучшали величину EF у крыс с MI на 20,29%, вливание внутривенным шприцевым насосом по 4 часа в день (группы C, D) было не более эффективным, чем обычные IV инъекции, в то время как вливание нейрегулина внутривенным шприцевым насосом по 8 часов в день (группы E, F) улучшало показатель EF приблизительно на 37,10%. Как показано в таблице 2, при сопоставлении с контрольной группой (носитель) IV инъекции нейрегулина (группа B) улучшали величину EF у крыс с MI на 23,61%, вливание внутривенным шприцевым насосом по 4 часа в день (группы C, D) было не более эффективным, чем обычные IV инъекции, в то время как вливание нейрегулина внутривенным шприцевым насосом по 8 часов в день (группы E, F) улучшало показатель EF приблизительно на 45,49%. Удивительно то обстоятельство, что, хотя крысы с MI в группе E получали только половинное количество нейрегулина по сравнению с группой F, показатели EF и FS в обеих группах были примерно одинаковы. Результаты показали, что после непрерывного внутривенного вливания нейрегулина шприцевым насосом в течение 8 и более часов в день функция сердца значительно улучшается (по сравнению с другими проверенными в эксперименте вариантами лечения).

ПРИМЕР 4

Функция сердца у крыс с MI после длительного подкожного вливания NRG осмотическим насосом

Перевязку коронарной артерии левого желудочка и имплантацию осмотического насоса крысам проводили так же, как это описано примере 2, за тем исключением, что количество NRG, впрыснутого в насос, составляло 1791,3 U (125 мкг), а насос вставляли без трубки, соединенной с веной, чтобы вливание NRG было подкожным. Скорость вливания составляла 37,33 U/кг/час.

Внутривенные инъекции начинали одновременно с длительным подкожным вливанием, поэтому группа IV получала NRG в течение 7 дней. Кроме того, количество NRG в группе IV было изменено на 223,95 U/кг.

Функция сердца, пораженного MI, после длительного подкожного вливания и внутривенных инъекций NRG показана в таблице 3. Как видно из таблицы 3, при сравнении показателей LVEDD, LVESD, EF и FS в группах EHI и IV с соответствующими показателями в контрольной группе (носитель) величина P составила менее 0,01, что указывает на статистически высокозначимое различие.

Таблица 3.
Функция сердца у крыс с MI после длительного подкожного (EHI) и IV вливания NRG   IVS LVEDD PW LVESD EF FS CC см см см см % % мсек носитель 0,174±0,005 1,02±0,077 0,185±0,012 0,876±0,098 33,9±7,9 14,3±3,8 153±19 EHI 0,176±0,006 0,908±0,079 0,209±0,023 0,712±0,091 48,4±9,3 21,7±5,1 153±11 IV 0,171±0,007 1,013±0,111 0,188±0,010 0,874±0,124 33,9±6,8 14,3±3,3 157±15

Таблица 3 показывает, что длительное подкожное вливание NRG значительно улучшает функцию сердца у крыс с MI по сравнению с группами IV и контроля (носитель). По сравнению с контрольной группой длительное подкожное вливание NRG улучшало показатель EF для сердца, пораженного MI, на 42,77%, а показатель FS на 51,75%. Как обсуждалось выше, показатели EF и FS представляют собой критерии эффективности работы сердца по перекачиванию крови, причем их можно использовать для оценки функции левого желудочка. Таким образом, эти результаты показывают, что длительное высвобождение NRG намного более эффективно в отношении улучшения функции сердца, чем обычные IV инъекции.

Длительное подкожное вливание NRG также уменьшало внутренний диаметр левого желудочка. Конкретно, показатель LVEDD сердца, пораженного MI, уменьшался на 10,98%, а показатель LVESD на 18,72% по сравнению с контрольной группой (носитель). Внутривенные инъекции NRG в этом эксперименте не давали очевидного эффекта в отношении функции сердца, пораженного MI, по сравнению с контрольной группой. Результаты показывают, что длительное подкожное вливание NRG способствует снижению объема и массы левого желудочка, тем самым улучшая его общее состояние и рабочую производительность, а это позволяет предположить, что такой способ также можно использовать при лечении сердечной недостаточности.

ПРИМЕР 5

Функция сердца у крыс с инфарктом миокарда после непрерывного подкожного вливания нейрегулина шприцевым насосом

В следующем эксперименте проводили подкожное вливание нейрегулина шприцевым насосом с различной скоростью и длительностью крысам с MI.

Крысы с MI, разделенные на группы, получали лечение внутривенными инъекциями носителя из расчета 4 мл/кг (объем/вес тела) ежедневно в течение 10 дней (группа A) или внутривенными инъекциями нейрегулина из расчета 10 мкг/кг (2,5 мкг/мл) ежедневно в течение 10 дней (группа B), или подкожными инъекциями (HI) нейрегулина из расчета 10 мкг/кг (2,5 мкг/мл) ежедневно в течение 10 дней (группа C), или подкожными вливаниями нейрегулина шприцевым насосом (1,25 мкг/мл) из расчета 2,5 мкг/кг/час по 4 часа вдень на протяжении 10 дней (группа D), или подкожными вливаниями нейрегулина шприцевым насосом (1,11 мкг/ml) из расчета 1,67 мкг/кг/час по 6 часов в день на протяжении 10 дней (группа E), или подкожными вливаниями нейрегулина шприцевым насосом (1,25 мкг/мл) из расчета 1,25 мкг/кг/час по 8 часов в день на протяжении 10 дней (группа F). Затем во всех группах проводили эхокардиографию для исследования функции сердца.

Таблица 4.
Данные эхокардиографии у крыс с MI после подкожного вливания шприцевым насосом (HSPI) или IV инъекции NRG     IVS LVEDD PW LVESD EF FS HR см см см см % % /мин A носитель 0,060±0,007 0,906±0,107 0,151±0,027 0,757±0,130 39,3±10,8 16,9±6,1 383±33 B IV 0,063±0,004 0,812±0,045 0,159±0,010 0,726±0,047 43,4±2,8 18,8±1,4 385±33 C HI 0,063±0,003 0,909±0,054 0,163±0,011 0,744±0,048 42,1±3,7 18,1±1,9 390±40 D HSPI
2,5 мкг/кг/час
4 часа в день 0,065±0,007 0,933±0,055 0,160±0,016 0,754±0,069 44,2±6,5 19,3±3,4 385±32 E HSPI
1,67 мкг/кг/час
6 часов в день 0,067±0,003 0,880±0,073 0,168±0,019 0,693±0,076 48,3±6,0 21,4±3,5 404±38 F HSPI
1,25 мкг/кг/час
8 часов в день 0,066±0,005 0,899±0,056 0,168±0,014 0,709±0,098 47,2±11,8 21,3±8,2 377±44

При сравнении показателей LVEDD, LVESD, EF и FS во всех группах HSPI, группе HI и группе IV с соответствующими показателями в контрольной группе (носитель) получено значение P<0,01, указывающее на статистически высокозначимое различие. Аббревиатура HR означает частоту сердечных сокращений.

Как видно из таблицы 4, при сравнении с контрольной группой (носитель), IV инъекции нейрегулина (группа B) улучшали показатель EF у крыс с MI на 10,43%, подкожные инъекции нейрегулина (группа C) улучшали показатель EF у крыс с MI на 7,12%, тогда как длительные подкожные вливания нейрегулина шприцевым насосом по 4 часа в день (группа D) улучшали показатель EF на 12,47%, длительные подкожные вливания нейрегулина шприцевым насосом по 6 часов в день (группа E) давали подскок показателя EF на 22,90%, а длительные подкожные вливания нейрегулина шприцевым насосом по 8 часов в день (группа F) также увеличивали показатель EF на 20,10%. В то же время, при сравнении с контрольной группой (носитель), IV инъекции нейрегулина (группа B) улучшали показатель FS у крыс с MI на 11,24%, подкожные инъекции нейрегулина (группа C) улучшали показатель FS у крыс с MI на 7,10%, тогда как длительные подкожные вливания нейрегулина шприцевым насосом по 4 часа в день (группа D) улучшали показатель FS на 14,20%, длительные подкожные вливания нейрегулина шприцевым насосом по 6 часов в день (группа E) давали подскок показателя FS на 26,63%, а длительные подкожные вливания нейрегулина шприцевым насосом по 8 часов в день (группа F) также увеличивали показатель FS на 26,04%. Результаты показали, что после непрерывного подкожного вливания нейрегулина шприцевым насосом в течение 6 и более часов в день функция сердца значительно улучшается (по сравнению с другими проверенными в эксперименте вариантами лечения).

ПРИМЕР 6

Присоединение PEG к NRG и активность NRG при соединении с PEG

A. Соединение с PEG и выделение NRG, соединенного с PEG

Полиэтиленгликоль (mPEG-SPA-5000, NEKTAR) добавляли в 10 мл 20 мМ PBS (pH 8,0), содержащего 1 мг/мл NRG (молярное соотношение PEG:NRG=1:1), и быстро перемешивали, после чего смесь осторожно встряхивали при комнатной температуре в течение 30 минут, а затем добавляли определенное количество ледяной уксусной кислоты для остановки реакции соединения двух веществ. Затем смесь загружали в колонку для гель-хроматографии (S100, Pharmacia), чтобы разделить компоненты. Каждую пиковую фракцию собирали, а ее образец готовили для SDS-PAGE. После электрофореза гель последовательно окрашивали BaI₂ и кумасси бриллиантовым голубым для раздельного выявления PEG и NRG.

Как показано на фиг.2 для геля, окрашенного BaI₂, смесь содержит мономер PEG, NRG-моноPEG, NRG-диPEG и NRG-полиPEG. После загрузки смеси в колонку S100 для гель-хроматографии компоненты были хорошо разделены на NRG-полиPEG и NRG-диPEG (пик 1), а также NRG-моноPEG и PEG (пик 2).

Гель, окрашенный кумасси (фиг.3) дополнительно подтвердил, что пик 1 и пик 2 содержат NRG, соединенный с PEG, а пик 3 содержит только NRG.

B. Измерение активности NRG, соединенного с PEG

Клетки MCF-7 собирали, подсчитывали, осаждали и ресуспендировали в DMEM (с 10% сыворотки и 9 мкг/мл инсулина), доводя содержание клеток до 5×10⁴ на миллилитр. Затем 100 мкл клеточной суспензии добавляли в каждую лунку 96-луночного планшета, а планшет инкубировали при температуре 37°C в течение ночи. После инкубации клетки троекратно отмывали PBS и выращивали в среде DMEM без сыворотки еще 24 часа.

Антитела H4 к ErbB2 (моноклональные антитела anti-ErbB2, Zensun) разводили до концентрации 6 мкг/мл покрывающим буфером (50 мМ Na₂CO₃-NaHCO₃, pH 9,6) и добавляли в 96-луночные планшеты 50 мкл на лунку. Планшеты оставляли на ночь при температуре 40°C для покрытия антителами.

Из истощенных клеток MCF-7 отсасывали среду DMEM, после чего в каждую лунку по отдельности добавляли серийные разведения NRG, NRG-моноPEG или NRG-диPEG в DMEM. В две лунки в качестве болванки добавляли чистую среду DMEM. Планшет инкубировали при 37°C в течение 20 минут. Клетки однократно отмывали PBS, после чего добавляли 100 мкл на лунку лизисного буфера (50 мМ Hepes, pH 8,0, 150 мМ NaCl, 2 мМ ортованадата натрия, 0,01% тимеросала, 1% Triton X-100 и одну таблетку коктейля ингибитора протеаз на 25 мл раствора) и проводили лизис при 4°C в течение 30 минут. Затем планшет осторожно встряхивали, чтобы полностью лизировать и удалить клетки из планшета, и центрифугировали материал 15 минут на скорости 15000 оборотов в минуту.

Планшет с покрывающими антителами пятикратно отмывали отмывочным буфером (10 мМ PBS, pH 7,4, 0,05% Tween 20), после чего в каждую лунку добавляли 200 мкл 5% обезжиренного молока в отмывочном буфере. Планшет инкубировали при 37°C в течение 2 часов, а затем снова троекратно отмывали отмывочным буфером.

Из каждой лунки культурального планшета извлекали 90 мкл раствора лизированных клеток, перенося их в соответствующую лунку покрытого планшета. После инкубации при 37°C в течение 1 часа покрытый планшет с лизированными клетками снова пятикратно отмывали отмывочным буфером и обрабатывали при 37°C в течение 1 часа 100 мкл подходящей концентрации пероксидазы хрена (HRP), конъюгированной с моноклональными антителами против фосфотирозина (Santa Cruz Biotechnology). Затем планшет еще пять раз отмывали отмывочным буфером, после чего в каждую лунку добавляли 100 мкл свежеприготовленного раствора субстрата HRP [50 мМ лимонной кислоты, 100 мМ Na₂PO₄, pH 5,0, 0,2 мг/мл 3,3',5,5'-тетраметилбензидина (TMB), 0,003% H₂O₂] и проводили инкубацию планшета при 37°C в течение 10 минут. Наконец, в каждую лунку добавляли 50 мкл 2Н H₂SO₄ для элиминации активности HRP. Величину OD при 450 нм в каждой лунке оценивали при помощи считывающего устройства для микропланшетов (модель BIO-RAD 550), а показатель EC₅₀ соответствовал концентрации NRG, при которой достигалось 50% максимальной величины OD. Чем ниже EC₅₀, тем выше активность.

В таблице 5 показаны величины EC₅₀ для NRG, NRG-моноPEG и NRG-диPEG.

Таблица 5.
Значения EC₅₀ NRG, NRG-моноPEG и NRG-диPEG образец EC₅₀(мкг/мл) NRG 0,070 NRG-моноPEG 0,070 NRG-диPEG 0,098

Из таблицы 5 ясно видно, что EC₅₀ NRG-моноPEG не отличается от NRG, тогда как EC₅₀ NRG-диPEG на 40% выше. Это означает, что NRG-моноPEG обладает такой же активностью in vitro, как NRG, на активность NRG-диPEG на 40% ниже.

ПРИМЕР 7

Длительное высвобождение нейрегулина уменьшает побочные эффекты, связанные с введением нейрегулина

Этот пример показывает, что по сравнению с традиционным введением нейрегулина продолжительное время или в высоких дозах длительное высвобождение нейрегулина позволяет уменьшить такие побочные эффекты, как желудочно-кишечное расстройство или перикардиальный выпот, связанные с введением нейрегулина.

Препарат NRG-1β вводили внутривенно шприцевым насосом обезьянам в двух группах, каждая из которых состояла из двадцати четырех здоровых обезьян вида макак-резус (по двенадцать самцов и самок весом около 5-7 кг). В группе I животным проводили вливания NRG-1β по двенадцать часов в день на протяжении четырнадцати дней со скоростью 1 мкг/кг/час. В этой группе не наблюдалось никаких побочных эффектов. В группе II животным проводили вливания NRG-1β по двадцать четыре часа в день на протяжении четырнадцати дней со скоростью 1 мкг/кг/час. В группе II у обезьян наблюдался перикардиальный выпот в объеме приблизительно 3-5 мл.

Две группы здоровых добровольцев получали такое же количество NRG-1β ежедневно в течение 10 дней. Восьми участникам эксперимента в группе I проводили вливания NRG-1β по четыре часа в день на протяжении десяти дней со скоростью 0,3 мкг/кг/час. В этой группе за десятидневный период введения препарата каждый участник испытывал желудочно-кишечное расстройство в среднем приблизительно по два раза. Шести участникам эксперимента в группе II проводили вливания NRG-1β по два часа в день на протяжении десяти дней со скоростью 0,6 мкг/кг/час. В группе II за десятидневный период введения препарата каждый участник испытывал желудочно-кишечное расстройство в среднем приблизительно по пять раз.

Эти результаты показывают, что длительное высвобождение нейрегулина способствует уменьшению неблагоприятных побочных эффектов, связанных с обычным введением нейрегулина продолжительное время или в высоких дозах. Эти результаты позволяют предположить, что внутривенные или подкожные вливания нейрегулина в течение короткого времени или в сниженной ежедневной дозе могут уменьшить побочные эффекты, наблюдаемые при 24-часовом вливании нейрегулина.

ПРИМЕР 8

Генная экспрессия в левом желудочке у крыс с инфарктом миокарда при длительном высвобождение NRG

В этом примере крысам с инфарктом миокарда проводили вливания NRG-1β, после чего у них при помощи биологического микрочипа анализировали характер генной экспрессии в левом желудочке. По сравнению с теми пораженными инфарктом миокарда крысами, которым проводили вливания носителя (контроль), крысы, получавшие вливания NRG, демонстрировали иной характер генной экспрессии. После длительного высвобождения NRG уровень мРНК бета-тимозин-подобного белка возрастал в 3,10 раза, уровень мРНК бета-дефензина 1 возрастал в 2,87 раза, уровень мРНК белка, ассоциированного с ростом, увеличивался в 2,16 раза, уровень мРНК бета-тимозина 4, гамма-ламинина 1, миокардина, регуляторной субъединицы гамма-PI3K почти удваивался, тогда как уровень мРНК эластина и гамма-PI3K оставался почти таким же, как и до этого. Это показывает, что нейрегулин изменяет уровень экспрессии различных белков в сердце.

Объем и сфера применения изобретения не ограничиваются описаниями, приведенными в примерах. Модификации и видоизменения настоящего изобретения будут очевидны компетентному специалисту и могут быть осуществлены без отклонений от духа и сферы применения этого изобретения. Таким образом, надо принять во внимание, что объем и сфера применения этого изобретения будут определены скорее в прилагаемых пунктах формулы изобретения, чем в конкретных примерах, которые были представлены в качестве иллюстраций.

Настоящая группа изобретений относится к медицине, а именно, к кардиологии, и касается улучшения сердечной функции путем длительного высвобождения нейрегулина. Для этого используют композицию с длительным высвобождением, обеспечивающую высвобождение нейрегулина в течение 1-24 часов в день. Такое продолжительное введение нейрегулина уменьшает ремоделирование желудочков сердца и улучшает функции миокарда за счет экспрессии генов, детерминирующих рост и дифференцировку кардиомиоцитов. 2 н. и 24 з.п. ф-лы, 3 ил., 5 табл., 8 пр.

1. Способ предупреждения, лечения или задержки развития сердечно-сосудистого заболевания у млекопитающего, предусматривающий длительное высвобождение терапевтически эффективного количества нейрегулина в организм млекопитающего, где нейрегулин в композиции высвобождается в организм млекопитающего на протяжении промежутка времени от 1 ч до 24 ч в день.

2. Способ по п.1, где сердечно-сосудистое заболевание представляет собой сердечную недостаточность или гипертрофию сердца.

3. Способ по п.2, в котором длительное высвобождение нейрегулина в организме млекопитающего индуцирует рост или дифференцировку кардиомиоцитов.

4. Способ по п.2, в котором длительное высвобождение нейрегулина в организме млекопитающего индуцирует стабильную активацию сигнального пути ERK или АКТ в клетках сердца.

5. Способ по п.2, в котором длительное высвобождение нейрегулина в организме млекопитающего улучшает показатель FS или EF у млекопитающего.

6. Способ по п.5, в котором показатель FS или EF у млекопитающего улучшается в процентном измерении на величину, выбранную из группы, которая состоит из приблизительно более 20%, приблизительно более 30%, приблизительно более 40%, приблизительно более 50% и приблизительно более 60%.

7. Способ по п.2, в котором длительное высвобождение нейрегулина в организме млекопитающего уменьшает внутренний диаметр левого желудочка (LVEDD или LVESD).

8. Способ по п.7, в котором показатель LVEDD или LVESD уменьшается в процентном измерении на величину, выбранную из группы, которая состоит из приблизительно более 2%, приблизительно более 5%, приблизительно более 10% и приблизительно более 15%.

9. Способ по п.1, в котором длительное высвобождение нейрегулина включает непрерывную внутривенную инъекцию или вливание нейрегулина в течение 4 и более часов в день.

10. Способ по п.1, в котором длительное высвобождение нейрегулина включает непрерывную подкожную инъекцию или подкожное вливание нейрегулина в течение 6 и более часов в день.

11. Способ по любому из пп.1-10, в котором нейрегулин выбран из группы, включающей NRG1, NRG2, NRG3 и NRG4.

12. Способ по любому из пп.1-10, в котором нейрегулин включает домен, подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный), причем EGF-подобный домен содержит последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотным остаткам 177-226 нейрегулина 1.

13. Способ по п.1, где длительное высвобождение нейрегулина в организм млекопитающего осуществляют при помощи осмотического насоса, шприцевого насоса, полимера, липосомы или микросферы.

14. Способ по п.13, где нейрегулин присоединен к полимеру.

15. Способ по п.14, где полимер представляет собой полиэтиленгликоль или его производное.

16. Способ по п.13, где нейрегулин упакован в липосому или в микросферу.

17. Способ уменьшения побочных эффектов у млекопитающего, которое получает лечение нейрегулином, предусматривающий длительное высвобождение нейрегулина в организм млекопитающего, где нейрегулин высвобождается в организм млекопитающего на протяжении промежутка времени от 1 ч до 12 ч в день.

18. Способ по п.17, в котором побочный эффект предусматривает собой желудочно-кишечное расстройство или перикардиальный выпот.

19. Способ по п.17, в котором длительное высвобождение нейрегулина в организм млекопитающего осуществляется при помощи осмотического насоса, шприцевого насоса, полимера, липосомы или микросферы.

20. Способ по п.19, в котором нейрегулин присоединен к полимеру.

21. Способ по п.20, в котором полимер представляет собой полиэтиленгликоль или его производное.

22. Способ по п.19, в котором нейрегулин упакован в липосому или в микросферу.

23. Способ по любому из пп.17-22, в котором нейрегулин выбран из группы, включающей NRG1, NRG2, NRG3 и NRG4.

24. Способ по любому из пп.17-22, в котором нейрегулин включает домен, подобный эпидермальному фактору роста (EGF-подобный), причем EGF-подобный домен содержит последовательность аминокислот, соответствующую аминокислотным остаткам 177-226 нейрегулина 1.

25. Способ по п.17, в котором длительное высвобождение нейрегулина включает непрерывную внутривенную инъекцию или вливание нейрегулина в течение 4 и более часов в день.

26. Способ по п.17, в котором длительное высвобождение нейрегулина включает непрерывную подкожную инъекцию или подкожное вливание нейрегулина в течение 6 и более часов в день.