СПОСОБ ОТБОРА БАКТЕРИЙ РОДА Lactobacillus ДЛЯ ИХ ВКЛЮЧЕНИЯ В СОСТАВ ПРОБИОТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/02 A61K35/74 

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и может быть использовано для оценки способности бактерий к биохимической детоксикации микотоксинов с целью последующего включения наиболее перспективных видов и штаммов в пробиотические препараты направленного действия - на биотрансформацию микотоксинов.

Специфика применения препаратов из живых бактерий в борьбе против микотоксинов основана на двух принципах: 1) синтез ферментов, биотрансформирующих микотоксины до менее опасных продуктов, 2) сорбция токсинов компонентами клеточной стенки бактерий. Кроме того, полезная микрофлора может синтезировать ряд веществ (антибиотики, органические кислоты, витамины и аминокислоты), выделять ферменты, расщепляющие компоненты корма, что в совокупности улучшает физиологическое состояние и иммунный статус животных, повышает фон питательности обычных рационов и таким образом способствует преодолению негативных последствий.

Однако при использовании пробиотиков в профилактике микотоксикозов имеется проблема, которая заключается в том, что активность ферментных комплексов, являясь внутренней характеристикой конкретного штамма, подвержена существенным колебаниям. Разные штаммы (и изоляты) даже в пределах одного вида (и штамма) значительно отличаются способностью, биотрасформировать ксенобиотики, в нашем случае микотоксины, что в значительной степени определяется их генетическими особенностями. В немалой степени на это влияют и изменяющиеся факторы окружающей среды. Таким образом, выращенные в искусственных условиях бактерии нередко имеют недостаточно высокий уровень ферментной активности, необходимый для инактивации микотоксинов. Поэтому эти формы со сниженной резистентностью к ксенобиотикам массово погибают в агрессивной среде пищеварительного тракта, не успев оказать своего влияния. В результате этого, неэффективность некоторых препаратов отодвигает на задний план перспективы использования симбиотической микрофлоры в профилактике кормовых отравлений и улучшения качественных показателей получаемой продукции животноводства.

Для получения стабильного эффекта в лечении и профилактике микотоксикозов целесообразен предварительный отбор бактерий по их культуральным свойствам. Усовершенствование методов оценки взаимодействия между микробиологическим объектом и некоторыми наиболее распространенным ксенобиотиками, в частности микотоксинами, позволит создавать новые антитоксические препараты или отбирать наиболее действенные препараты из ассортимента имеющихся пробиотических добавок.

В настоящее время существует несколько способов подобных оценок, большинство из которых выполняется по аналогии с определением чувствительности микроорганизмов к антибиотикам - метод диффузии в агар, метод серийных разведений (на жидкой и плотной питательных средах) и ускоренные методы (Костенко Т.С., Радионова В.Б., Скородумов Д.И. Практикум по ветеринарной микробиологии и иммунологии. - М.: Колос, 2001. - С.85-89). О способности микроорганизмов метаболизировать какой-либо компонент среды, либо продуцировать в нее продукты своей жизнедеятельности судят по разности содержания этого вещества в питательной среде за время роста культуры (Бакунина Н.А., Краева Э.Л. Микробиология. - М.: Медицина, 1976. - С.126). Все предложенные способы, наряду с количественным определением, предполагают и визуальное наблюдение за характером роста микрофлоры. Однако эти приемы чрезвычайно трудоемки, требуют создания специальных условий для работы и практических навыков, что затрудняет проведение таких работ в широких масштабах и с необходимой регулярностью. Исходя из этого в основу изобретения поставлена задача: найти информативный и доступный способ отбора бактерий, обладающих способностью деструктировать ксенобиотики, в частности микотоксины.

Способ отбора бактерий рода Lactobacillus для включения их в состав пробиотических препаратов, характеризующийся тем, что отбор предварительно полученных изолятов указанных бактерий проводят по активности их ферментных систем, ответственных за деструкцию микотоксинов, которые определяют по средней геометрической величине активности общих дегидрогеназ, пероксидаз и цитохром Р-450-зависимых оксидаз. Таким образом, вместо совокупности микробиологических приемов (количественного учета выросших колоний бактерий в присутствии микотоксинов, сопоставления концентрации микотоксинов в питательных средах до и после их культивирования и измерения зон просветления вокруг источника с токсическими агентами) предлагается оценивать активность ферментов, принимающих участие в деструкции микотоксинов микробной клеткой.

Известно, что способность микроорганизмов метаболизировать ксенобиотики зависит от набора и активности энзимов, участвующих в этом процессе. Поскольку микотоксины представляют собой разнородную по химическому строению группу чужеродных веществ, то ферменты, обладающие способностью их трансформировать, должны являться представителями нескольких классов и подклассов, а также обладать определенной специфичностью в отношении различных функциональных групп. Особенно часто детоксикация микотоксинов происходит в результате действия энзимов кишечной флоры с оксидо-редуктазной, гидролитической (эпоксидгидролазы, карбоксилэстеразы, лактондегидрогеназы) и траисферазной (УДФ-гликозилтрансферазы) активностью. В большей мере это характерно для факультативно-анаэробных форм (Lactobacillus, Bacillus, Enterobacteriaceae), которые традиционно используются для получения пробиотических препаратов.

Причем из вышеприведенных классов ферментов особой универсальностью отличается обширная группа оксидо-редуктаз с низкой субстратной специфичностью. Энзимы данной группы - монооксигеназы (Р-450), дегидрогеназы и пероксидазы - катализируют реакции фазы I детоксикации широкого спектра ксенобиотиков в любой живой клетке. Субстратом для этих ферментов служат и простые молекулы, и сложные гетероциклические соединения. Поэтому, установив фон окислительно-восстановительный активности ключевых энзимов, можно сделать заключение о потенциале бактерий к биохимической деструкции ксенобиотиков, в частности микотоксинов, и заложить основу для направленного отбора перспективных форм.

Наиболее близким к заявляемому способу является способ отбора микроорганизмов для их включения в состав пробиотических препаратов, способных предотвращать нарушения минерального обмена у макроорганизма (Патент РФ №2293118). Недостатком данного способа является то, что, несмотря на сравнительное изучение культуральных свойств, с помощью него невозможно оценить способность бактерий к биохимической деструкции ксенобиотиков. Технический результат заявляемого способа заключается в том, что посредством предлагаемого отбора представляется возможным выделить эффективные бактерии-деструкторы микотоксинов. Последние можно использовать для воздействия на токсический процесс при скармливании их животным per os в виде лечебных пробиотических препаратов.

Пример конкретного применения 1.

Работу проводили в лаборатории микотоксикологии ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии в 2009-2010 г. Для исследований отобраны 11 коммерческих молочнокислых препаратов и продуктов, содержащих микрофлору рода Lactobacillus {Lactobacillus acidophilus, L.casei, L.rhamnosu, L.bulgaricus) и два полевых штамма указанного рода, выделенные из помета петухов и цесарок (таблица 1). Все исследуемые популяции бактерий были выбраны в качестве модельных, распределены в случайном порядке и обозначались номерами с первого (№1) по тринадцатый (№13). Перед началом эксперимента в стерильных условиях из всех образцов были сделаны посевы на селективную среду («Лактобакагар» (Среда «С-56», состав (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 20,0; экстракт пекарских дрожжей - 5,0; экстракт мясной - 5,0; глюкоза - 20,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 2,0; натрий уксуснокислый - 5,0; «Твин-80» - 1 мл; аммоний лимоннокислый 1-замешенный - 2,0; магний сернокислый - 0,1; марганец хлористый - 0,05; агар - 13,0±2,0, pH 5,7±0,3.)), типированы и отобраны ее характерные представители, из которых в последующем приготовили на стерильном физиологическом растворе изоляты живых суточных клеток с концентрацией 10⁷-10⁸ КОЕ/мл.

Сравнительный пример. В ходе сравнительных исследований каждый изолят лактобактерий был оценен на чувствительность к микотоксинам (Т-2 токсин, афлатоксин В₁ и охратоксин A) методом диффузии в агар. Результат учитывали путем измерения зон подавления роста вокруг лунок с микотоксинами. Вслед за этим была проведена работа по установлению степени деструкции указанных микотоксинов в питательной среде при росте на ней лактобактерий. Исследования проводили в чашках Петри, которые заполняли расплавленной агаровой средой, по 10 мл в каждую чашку. Исходная концентрация микотоксинов в среде составляла 1 ПДК. После этого на поверхность чашки наносили 1 мл инокулята из вышеуказанных образцов микрофлоры и равномерно распределяли его на поверхности путем равномерного покачивания. Для посева использовали концентрацию бактерий 10⁸ КОЕ/мл, которая на поверхность агаровой среды давала сплошной гомогенный рост («газон»). По истечении 10 суток инкубации при t=37°С в среде определяли остаточное содержание микотоксинов методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (Наставления №№13-5-02/0516, 13-5-02/0514 и 13-5-02/0520 по применению тест-системы для иммуноферментного определения микотоксинов: Т-2 токсин, охратоксин А и афлатоксин B₁ / Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г.) и соотносили обнаруженное их содержание к исходной концентрации).

Исследования проводили в трехкратной повторности (n=3), полученные значения (средние результаты) представлены в таблице 1.

Опыт 1. Параллельно с микробиологическими исследованиями у изолятов живых микробных клеток оценивали активность энзимов.

1. Цитохром Р-450-зависимых оксидаз, которые широко распространены в клетках микроорганизмов, растений и млекопитающих. В зависимости от происхождения, цитохромы значительно различаются по субстратной специфичности, однако одной из наиболее широко распространенных реакций, катализируемых этим ферментным комплексом, является окислительное деалкилирование, которое сопровождается окислением алкильной группы, присоединенной к N-, O- или S-атомам. Используя методику O-деметилирования p-нитроанизола (Карузина И.И. и др. Сравнительное исследование действия медь-тирозивного комплекса на реакции гидроксилирования ксенобиотиков и перекисного окисления липидов // Биохимия. - 1979. - т.44, №10. - С.1796-1804), оценивали активность цитохрома P-450 у выделенных штаммов бактерий рода Lactobacillus.

2. Помимо микросом, энзимы, участвующие в окислительной деградации ксенобиотиков, выявляются также и в митохондриях, и в растворимой фазе цитозоля. Процесс дегидрирования лежит в основе превращения подавляющего большинства веществ (в т.ч. питательных) и сопряжен с выделением энергии. Его характерной особенностью является то, что протоны водорода, отщепленные из молекулы субстрата, легко «перехватить» некоторыми редокс-индикаторами, по изменению интенсивности окраски которых легко судить об активности данной разновидности окислительно-восстановительных процессов в клетке (Материкин А.М, Матвеев В.А., Галочкин В.А. Анализ метаболитов и ферментов углеводного обмена / в кн. Под общ. ред. Б.Д.Кальницкого / Методы биохимического анализа (Справочное пособие). - Боровск. - 1997. - С.231-234).

3. Пероксидазы участвуют в разрушение перекиси водорода и других перекисей, образующихся в процессе детоксикации ксенобиотиков, превращая их в воду и спирты. В ходе этих реакций возникают побочные продукты, обладающие окислительными свойствами, способные взаимодействовать с различными ксенобиотиками, окисляя и превращая их в безопасные продукты. Оценивая активность этого фермента (Рогожин В.В., Верхотуров В.В. Механизм совместного окисления аскорбиновой кислоты и гидрохинона в присутствии пероксидазы хрена // Биоорганическая химия. - 1999. - Т.25.- №5. - С.377-382), наряду с двумя вышеуказанными, мы претендовали на комплексность оценки ферментов, участвующих в окислительной деградации ксенобиотиков.

Активность ферментов выражали в расчете на единицу нуклеиновых кислот (НК), содержащихся в микробной взвеси (по В.П.Симакову, 1980 / в кн. Васильевой Е.А. Краткий справочник лаборанта-химика. - М.: Россельхозиздат, 1980. - С.115-117), что не требует проведения микробиологических манипуляций и является стабильной величиной по сравнению микробиологической размерностью, определяемой численностью колониеобразующих единиц (КОЕ).

Результаты исследования (табл.1) показали, что по комплексу изучаемых свойств все тестируемые в опыте штаммы бактерий имели достаточно широкие колебания. В частности, различия по скорости деструкции микотоксинов у контрастных форм №8 (min) и №12 (max) отличалась более чем в 6 раз, а различия по уровню летальности у них же, выраженные диаметром зоны задержки роста (ЗЗР), превышали величину 37 раз.

Стоит отметить, что при попарном анализе результатов микробиологических исследований была обнаружена тесная положительная зависимость (r=+0.76, p≤0,05) между ЗЗР (физическая устойчивость бактерий к микотоксинам) и значениями убыли микотоксина в среде (биохимической способностью микрофлоры преобразовывать микотоксины). Эти данные в полной мере согласуются с современным видением механизмов биологической защиты живых объектов от губительного для себя влияния различных химических веществ. Учитывая это, а также с целью более наглядного представления материала, мы посчитали возможным математически «объединить» оба этих параметра в одну среднюю геометрическую величину, возрастающие значения которой характеризуют снижающуюся способность микрофлоры противостоять микотоксинам (табл.1).

1. Культуральные свойства молочнокислых бактерий, оцененные по способности противостоять микотоксинам, и активность их ферментов, ответственных за биохимическую деструкцию (n=3) № препарата Зона задержки роста бактерий (ЗЗР), мм Остаточное количество микотоксинов в среде, % к исходному их количеству Значение средней геометрической величины, у.ед.* Активность ферментов, Е/г нуклеиновых кислот Значение средней геометрической величины, у.ед.** суммарные дегидрогеназы суммарные пероксидазы цитохром P-450 1 1,3 45,5 7,7 5.43 1342,2 10,29 42,2 2 23,4 59,4 37,3 1,27 233,2 6,29 12,3 3 27,8 84,7 48,5 0,74 100,0 3,91 6,6 4 35,4 87,0 55,5 0,92 42,1 3,29 5,0 5 28,4 91,1 50,9 1.21 118,6 4,38 8,6 6 30,0 76,4 47,9 2,27 166,9 4,44 11,9 7 20,3 75,9 39,3 1,43 300,1 5,85 13,6 8 37,7 82,8 55,9 0,98 33,3 1,66 3,8 9 26,3 72,2 43,6 1,55 255,4 6,19 3,5 10 22.6 56,0 35,6 1,30 907,9 6,06 19,3 11 7,6 58,5 21,1 2,40 439,7 6,39 18,9 12 1,0 64,6 8,0 3,16 277,9 4,78 16,1 13 29,0 76,0 47,0 1,61 173,2 7,54 12,8 Примечание: * - значение средней геометрической величины взято по культуральным свойствам препарата - по величине зоны задержки роста и остаточному количеству микотоксинов в среде. ** - значение средней геометрической величины взято по активности трех окислительно-восстановительных ферментов.

В ходе дальнейшей работы данные по культуральным свойствам у всех изолятов бактерий были сопоставлены с активностью ферментов, отвечающих за деструкцию ксенобиотиков. Анализ их активности во второй части исследования (опыт 2) позволил выявить вполне стабильный тип связи с физической устойчивостью бактерий к микотоксинам (опыт 1).

Так, в ходе опыта активность всех трех ферментов тесно коррелировала между собой (r=+0,70-0,77) и изменялась однонаправленно в зависимости от культуральных свойств того или иного препарата. Вместе с тем, различия между максимальной и минимальной величиной массива для каждого изучаемого фермента составили: по цитохрому P-450 и дегидрогеназам - 6-7 раз, пероксидазам - 40 раз, указывая на высокую вариабельность и информативность, достаточную для проведения сравнительного анализа. Это также дало основание представить значения активности всех трех окислительно-восстановительных ферментов в виде одной средней геометрической величины для каждого изолята (таблица 1).

Таким образом, анализируя характер зависимости между двумя средними геометрическими величинами, полученными в результате изучения культуральных и биохимических свойств тестируемых бактерий, можно обнаружить тесную зависимость, подтвержденную статистическими методами - r=-0,80(p≤0,01). Отрицательный характер связи в данном случае подтверждает лишь то, что с повышением активности соответствующих ферментных систем увеличивается толерантность бактерий к микотоксинам, поэтому зона задержки роста и остаточное количество микотоксинов в среде культивирования микробов снижаются. Полученный результат подтверждает адекватность выбора ферментных систем в качестве критерия оценки способности бактерий к деструкции микотоксинов. Штаммы бактерий рода Lactobacillus, имеющие активно развитую ферментную систему, которая характеризуется средней геометрической величиной активности ферментов свыше 30 у.ед./1 г НК, способны активно противостоять негативному действию микотоксинов - выживать большему количеству клеток в среде и биохимически разрушать ксенобиотик. Активность ферментов в данном случае можно использовать как вполне специфический и информативный тест для оценки способности бактерий противостоять токсическим метаболитам грибной микрофлоры.

Пример конкретного применения 2.

В ходе эксперимента было выявлено, что наиболее приспособленным к выживанию в среде с микотоксинами оказался штамм лактобактерий под №1, который отличался к тому же ярко выраженной способностью их метаболизировать до соединений, которые невозможно определить существующими методами анализа микотоксинов. Прямым антиподом этого препарата, оказавшимся худшим по результатам как оценки культуральных свойств, так и по активности ферментных систем, стал препарат №8. Для доказательства действенности данного метода отбора была проведена работа, в которой данные штаммы бактерий использовались в качестве препаратов лечебно-профилактического действия на фоне хронического сочетанного микотоксикозы птицы.

Работу проводили в виварии ГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП» на цыплятах-бройлерах кросса «Cobb-avian-48», из которых было сформировано 4 группы - 2 контрольные и 2 опытные. Бройлеров выращивали до 37-дневного возраста в типовых клеточных батареях, по 35 голов цыплят в каждой, условия содержания птицы соответствовали принятым зоогигиеническим параметрам и отвечали нормативным требованиям для данного кросса.

Цыплята контрольной группы 1 получали свободный от микотоксинов основной рацион кукурузного типа (ОР) с параметрами питательности, соответствующими рекомендуемым нормам кормления сельскохозяйственной птицы (ВНИТИП, 2006 г.). Комбикорма для бройлеров отрицательной контрольной группы 2 имели аналогичную питательность, но содержали в своем составе смесь трех микотоксинов (Т-2 токсин, охратоксин А, афлатоксин B₁), на уровне суммарной токсичности 10-12 ПДК. Схема опыта представлена в таблице 2.

2. Схема опыта по профилактике микотоксикозов на птице Группа Особенности кормления 1. Контрольная Основной рацион (OP) - комбикорм кукурузного типа с питательностью, соответствующей нормам кормления птицы ВНИТИП (2006 г.) 2. Контрольная OP, содержащий смесь микотоксинов (Т-2 токсин, охратоксин А, афлатоксин B₁) на уровне 10-12 ПДК (OP₁) 3. Опытная OP₁+препарат 1 (10⁸ КОЕ/г корма) 4. Опытная OP₁+препарат 8 (10⁸ КОЕ/г корма)

Подопытные цыплята из двух групп 3-4 получали контаминированные микотоксинами корма (OP₁), но в состав их рационов были дополнительно включены два пробиотических препарата - препарат 1 (группа 3) и препарат 8 (группа 4) на основе нанесенных на органический носитель живых бактерий рода Lactobacillus, из расчета 10⁸ КОЕ/г корма.

3. Зоотехнические показатели выращивания цыплят-бройлеров, получавших пробиотические препараты с разными культуралытыми свойствами Показатель Группа 1 (К₁) 2 (К₂) 3 4 Сохранность поголовья в группе, % 97,1 80,0 94,3 85,7 Средняя живая масса в группе, г 2064,3 1674,2 1925,7 1761,5 Валовой прирост живой массы в группе, кг 68,72 45,41 62,08 51,38 Затраты корма на 1 кг прироста живой массы, кг 1,76 2,21 1,90 1,92 Европейский индекс продуктивности, ед. 325,4 173,2 273,0 224,7

Результаты проведенного исследования показали (табл.3), что наличие микотоксинов в корме (группа 2) сопровождалось угнетением всех показателей выращивания птицы. Таким образом, на фоне экспериментального микотоксикоза сочетанного типа оказалось возможным установить влияние контрастных пробиотических препаратов №1 и №8.

Анализируя данные, необходимо отметить, что в опытных группах, получавших пробиотические препараты на фоне микотоксикоза, сохранность птицы повысилась на 14,3% и 5,7%, а расход корма снизился в среднем на 16,3% и 15,1% соответственно. Максимальное влияние культуральных свойств бактерий, отобранных по способности биохимически разрушать микотоксины, отразилось на скорости роста птицы и эффективности использования корма. Так, в группе 3, получавшей наиболее предпочтительный препарат 1, живая масса бройлеров и валовой прирост оказались на 8,7 и 17,2% выше, чем у сверстников, которым скармливали менее предпочтительный для профилактики микотоксикозов препарат 8. Таким образом, компенсация издержек, выраженная европейским индексом продуктивности, в 3 группе, получавшей препарат 1, составила 65,6% против 33,8% группы, получавшей препарат 8.

Таким образом, данные исследований: 1) по оценке культуральных свойств бактерий и 2) по выращиванию животных на фоне токсических комбикормов с включением в них в качестве пробиотиков перспективных штаммов симбиотической микрофлоры, подтверждают возможность отбора эффективных бактерий-деструкторов микотоксинов. Исходя из этого сводный показатель на основе средней геометрической величины активности общих дегидрогеназ, пероксидаз и цитохром P-450 - зависимых оксидаз, ответственных за окислительную деструкцию большинства чужеродных веществ, является доступным и информативным критерием отбора (выявления) перспективных культур, использование которого в народном хозяйстве имеет широкие перспективы.

Способ отбора бактерий рода Lactobacillus для включения их в состав пробиотических препаратов предусматривает получение изолятов указанных бактерий. Отбор бактерий проводят по активности их ферментных систем, ответственных за деструкцию микотоксинов, которые определяют по средней геометрической величине активности общих дегидрогеназ, пероксидаз и цитохром Р-450-зависимых оксидаз. Причем отбирают бактерии, имеющие среднюю геометрическую величину активности ферментов свыше 30 у.ед./1 г нуклеиновых кислот. Пробиотические препараты на основе бактерий рода Lactobacillus, отобранных предложенным способом, при кормлении птицы указанными препаратами в сочетании с контаминированными микотоксинами кормами повышают сохранность птицы на 14,3%, живую массу бройлеров - на 8,7%, валовой прирост - на 17%. 3 табл., 2 пр.

Способ отбора бактерий рода Lactobacillus для включения их в состав пробиотических препаратов, характеризующийся тем, что отбор предварительно полученных изолятов указанных бактерий проводят по активности их ферментных систем, ответственных за деструкцию микотоксинов, которые определяют по средней геометрической величине активности общих дегидрогеназ, пероксидаз и цитохром Р-450-зависимых оксидаз, причем отбирают бактерии, имеющие среднюю геометрическую величину активности ферментов свыше 30 у.ед./1 г нуклеиновых кислот.