ШТАММ БАКТЕРИЙ Lactobacillus acidophilus, ОБЛАДАЮЩИЙ ПОВЫШЕННОЙ УСТОЙЧИВОСТЬЮ К Т-2 ТОКСИНУ Российский патент 2014 года по МПК C12N1/20 C12R1/23 

Изобретение относится к области микробиологии, биотехнологии и сельскому хозяйству, в частности к профилактике микотоксикозов у сельскохозяйственных животных и птицы, и может быть использовано для разработки новых антитоксических препаратов и кормовых добавок.

Одним из способов профилактики микотоксикозов является использование живых пробиотических микроорганизмов, действие которых базируется на способности симбиотических бактерий биохимически разрушать микотоксины в желудочно-кишечном тракте (ЖКТ) и ослаблять их негативное действие, что способствует улучшению физиологического состояния организма. В то же время уровень полезных бактерий в ЖКТ животных, потребляющих загрязненные корма, значительно снижен, что, соответственно, не только уменьшает их способность деградировать поступающие с кормом опасные вещества (микотоксины), но и провоцирует проявление смежных патологий (дисбактериозы), усугубляющих общий токсический эффект. В противоположность этому использование биопрепаратов, способствующих заселению кишечника полезными формами симбионтов, позволяют повысить устойчивость организма к негативному действию кормовых факторов.

Однако при повышенных концентрациях микотоксинов в комбикормах пробиотические препараты не способны в полной мере проявить свои детоксицирующие свойства, что обусловлено индивидуальными свойствами того или иного вида и штамма микроорганизмов, многие из которых погибают в агрессивно-токсичной среде ЖКТ, не успев оказать позитивного действия. Решить данную проблему может использование специально селекционированных штаммов бактерий, устойчивых к действию микотоксинов.

В последнее время отбор активно ведется по различным направлениям. Так, например, известен способ выявления культур микроорганизмов, разлагающих пестициды («Способ выявления микроорганизмов - деструкторов ксенобиотиков» / Патент на изобретение №2051961 - 1996). Также известны штаммы Е. coli, прошедшие селекционный отбор по устойчивости к L-лейцину («Штамм бактерий Escherichia coli продуцент L-лейцина (варианты)» / Патент на изобретение №2140450 - 1999).

Однако по результатам патентного поиска из всего разнообразия бактерий не выявлено штаммов, ориентированных на разрушение микотоксинов и отличающихся высокой способностью к росту в средах с высоким их содержанием. В ряде наиболее близких патентов объектом биодеградации являются пестициды (патент №2051961) или 2,4,5-трихлорфеноксиуксусная кислота (патенты №№2129605 и 2130067), являющиеся источником питательных веществ (азот, энергия) для роста некоторых микроорганизмов. Однако данные синтетические ксенобиотики, полученные путем химического синтеза для борьбы с сорными растениями и фитопатогенной грибной микрофлорой или же являющиеся продуктами промышленных загрязнений, хотя и способны оказывать негативное действие на животных и человека, но по своим свойствам кардинально отличаются от микотоксинов. Так, например, Т-2 токсин не может использоваться бактериями в качестве питательных веществ, но активно подавляет обменные процессы в микробной клетке, способствуя ее гибели (бактерицидный эффект).

С другой стороны, известен способ профилактики микотоксикозов (патент №2297842), основанный на использовании антагонистической активности штаммов бактерий Bacillus subtilis ТНП-3-ДЕП и ТНП-5-ДЕП в отношении токсинообразующих плесневых грибов. Однако в данном патенте речь идет лишь о подавлении роста бактериями потенциально-опасной грибной микрофлоры, но не об их способности разрушать образовавшиеся или уже имеющиеся в кормовом сырье микотоксины.

Вместе с тем определенный интерес вызывают новые штаммы бактерий Brevibacterium flavum, полученные селекционным путем, устойчивые к сульфагуанидину и азасерину («Штамм бактерий Brevibacterium flavum - продуцент L-глутамина (варианты)» / Патент на изобретение №2084520 - 1997). Несмотря на различия в видовом составе бактерий и типу химических соединений, являющихся объектом воздействия микроорганизмов, предложенный в данном патенте принцип выделения новых штаммов бактерий путем накопительной селекции является более близким по своей сущности к предлагаемому и был использован нами в качестве прототипа. Согласно прототипу новые штаммы бактерий были получены из дикого в результате нескольких этапов селекции: в известном способе на питательную среду, содержащую сульфагуанидин или азасерин, засевали выделенные культуры микроорганизмов, культивировали посев, а отобранные в ходе первого этапа селекции микроорганизмы, устойчивые к исследуемым веществам, использовались для следующего.

Задачей настоящего изобретения является выделение штамма бактерий Lactobacillus acidophilus, обладающего полезными свойствами - устойчивостью и способностью к окислительной деструкции Т-2 токсина до менее опасных продуктов. Новый штамм Lactobacillus acidophilus депонирован во Всероссийскую коллекцию микроорганизмов с присвоенным авторами опознавательным символом «ГЕ3-294» и имеет регистрационный номер ВКМ В-2794D.

Новый штамм получен из полевого Lactobacillus acidophilus, выделенного из содержимого ЖКТ цыплят-бройлеров, страдающих умеренной формой хронического Т-2-микотоксикоза, вызванного экспериментальным путем в условиях вивария.

На начальном этапе исходные лактобактерии были типированы и высеяны на питательную среду «Лактобакагар» (среда «С-56», состав (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 20,0; экстракт пекарских дрожжей - 5,0; экстракт мясной - 5,0; глюкоза - 20,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 2,0; натрий уксуснокислый - 5,0; «Твин-80» - 1 мл; аммоний лимоннокислый 1-замещенный - 2,0; магний сернокислый - 0,1; марганец хлористый - 0,05; агар - 13,0±2,0, рН 5,7±0,3; ФГУП ГНЦ ПМ), предназначенную для выделения и культивирования лактобацилл. В дальнейшем несколько (1-5) колоний L. acidophilus были изолированы, размножены и выращивались в лабораторных условиях на аналогичных средах с искусственным внесением в них Т-2 токсина в возрастающих концентрациях (0,1-0,5 мкг/мл) путем многократного пассирования (4-8 раз в месяц). Периодически (1-2 раз в месяц с экспозицией 1-3 суток) в среду добавляли ряд мутагенных факторов (арсенит натрия [5-65 мкг/л], нитрозосоединения [100-380 мкг/л]) и подвергали УФ-облучению в средне - (270-310 нм) и коротковолновом (120-250 нм) спектре с экспозицией 10-40 мин для увеличения частоты рекомбинационных и мутационных изменений, позволяющих впоследствии получить колонии (формы) с более высокой (на 20-30% выше, чем у предыдущей генерации) толерантностью к Т-2 токсину.

В течение последующих 1,5 лет с периодичностью до 2-3 недели производили учет выросших колоний молочнокислых бактерий и отбор наиболее устойчивых к микотоксину микроорганизмов. В последующем отобранные бактерии пересевали на аналогичные чашки, но с большей концентрацией Т-2 токсина. При достижении концентрации микотоксина в питательной среде на уровне 0,5 мкг/мл производили культивирование на средах с данной концентрацией токсина с целью закрепления признака у высокоактивных штаммов.

Известно, что микотоксины - чрезвычайно опасный класс органических соединений, оказывающий негативное влияние на здоровье человека и продуктивность с.-х. животных. Высокая распространенность проблемы микотоксикозов позволяет предположить несколько возможных путей использования данного штамма с профилактической целью: 1) включение в состав антитоксических кормовых добавок (препаратов) при вынужденном скармливании загрязненных микотоксинами кормов; 2) использование в качестве заквасок при производстве кисломолочных продуктов, которые будут отличаться повышенными лечебно-профилактическими свойствами в отношении Т-2 токсина; 3) включение в состав кормового сырья (силос, сенаж) для предотвращения накопления в нем микотоксинов или их обезвреживания в процессе хранения. Таким образом, окончательный технический результат может заключаться в применении заявляемого штамма в животноводстве и кормопроизводстве для профилактики острых и хронических Т-2 токсикозов.

Описание культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков штамма.

Морфология клеток: грамположительные неподвижные палочки с закругленными концами 0,7×1,0 мкм, спор не образуют.

Культуральные признаки: через 48 часов роста при 37°С в атмосфере обычного воздуха на питательной среде «Лактобакагар» образуются белые колонии диаметром 1-3 мм, поверхность колоний гладкая, форма выпуклая, края ровные, непрозрачные, непигментированные, структура однородная, консистенция пастообразная.

Физиолого-биохимические признаки: микроорганизм является факультативным анаэробом. Желатину не разжижает. Для роста необходимы ацетат, рибофлавин, пантотенат кальция, ниацин, фолиевая кислота. Растет при 45°С, нет роста при 15°С, оптимальная температура культивирования 35-39°С.

Выделение штамма бактерий L. acidophilus «ГЕ3-294», обладающего заранее заданными ему свойствами: устойчивостью и способностью к деструкции Т-2 микотоксина, производили следующим образом.

Пример. Перед посевом питательную среду разливали в стерильные чашки Петри слоем 4-5 мм и подсушивали в термостате при 37°С течение 40 мин. В состав среды вносили Т-2 токсин в количестве 0,1 мкг/мл среды и засевали выделенными культурами микроорганизмов L. acidophilus. Ввиду того что по своим физико-химическим свойствам микотоксины в целом (и Т-2 токсин в частности) являются нерастворимыми в воде гидрофобными соединениями с целью обеспечения условий для равномерного их распределения в среду добавляли ПАВ «Твин 80» (полиоксиэтилен(20)сорбитан моноолеат) - из расчета 8-30×10^-4 М/л среды. Указанная концентрация эмульгатора не оказывала негативного влияния на рост микрофлоры.

Посевы инкубировали в термостате при 37°С. Через 48 часов фиксировали выросшие колонии, оценивая тем самым устойчивость микроорганизмов к данному микотоксину. Дополнительным критерием отбора явилась способность лактобацилл разрушать микотоксин, который оценивали по изменению абсолютной концентрации Т-2 токсина в среде до и после инкубации, выраженной в расчете на 1 выросшую колонию. Таким образом, основными критериями отбора были рост колоний и способность микроорганизмов деструктировать Т-2 токсин в питательной среде.

Отобранные наиболее перспективные микроорганизмы, полученные в результате первого пассажа, суспензировали в физиологическом растворе хлористого натрия в концентрации 1-5 млрд. микробных клеток в 1 мл. Суспензию использовали в качестве посевного материала для второго пассажа, где концентрация микотоксина в среде была увеличена до 0,2 мкг/мл. При этом лактобациллы на чашках Петри или в суспензии периодически (1-2 раза в месяц) подвергали воздействию мутагенных факторов, увеличивающих частоту появления более устойчивых форм. Далее, аналогичным образом пересев и последующий отбор устойчивых к микотоксину микроорганизмов был осуществлен на питательные среды с концентрацией Т-2 токсина 0,3; 0,4 и 0,5 мкг/мл.

Выполнение цикла перечисленных манипуляций позволило выделить новый штамм Lactobacillus acidophilus «ГЕЗ-294», устойчивый к высоким концентрациям микотоксина в среде. В результате многоэтапной накопительной селекции представилось возможным повысить устойчивость лактобактерий к Т-2 токсину: резистентность микроорганизмов, полученных в первом пассаже, составляла 12-16%, у нового штамма она значительно возросла - до 77% (или в 6-7 раз); способность деструктировать Т-2 токсин у микроорганизмов первого пассажа составляла 5,2×10^-12, а у нового штамма - Lactobacillus acidophilus «ГЕ3-294» она увеличилась до 1,8×10^-9 нмоль / КОЕ соответственно (или в 346 раз). Устойчивость признака - 98-99%.

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано для разработки антитоксических препаратов и кормовых добавок для профилактики микотоксикозов у сельскохозяйственных животных и птицы. Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus депонирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ В-2794D. Штамм обладает устойчивостью к Т-2 токсину и способностью метаболически разрушать его в среде обитания бактерий. Резистентность штамма к Т-2 токсину составляет до 77%, а способность деструктировать Т-2 токсин - до 1,8×10^-12 нмоль/КОЕ. 1 пр.

Штамм бактерий Lactobacillus acidophilus, депонированный во Всероссийской коллекции микроорганизмов под регистрационным номером ВКМ B-2794D, обладающий повышенной устойчивостью к T-2 токсину и способностью метаболически разрушать его в среде обитания бактерий.