СПОСОБ ОТБОРА МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ МИКОТОКСИНОВ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ МИКОТОКСИКОЗОВ Российский патент 2012 года по МПК C12Q1/04 C12N1/20 

Изобретение относится к области микробиологии, а именно - к способу выявления и отбора культур микроорганизмов, способных биохимически разрушать (трансформировать) микотоксины. Поскольку для профилактики микотоксикозов все чаще используют пробиотические препараты, данный способ может быть применен в качестве быстрой оценки эффективности их использования на фоне кормового сырья низкого санитарного качества. Не менее перспективным направлением можно считать и выявление новых, еще более активных, культур для разработки перспективных кормовых добавок, содержащих живые микроорганизмы с заданными свойствами.

Известные способы выявления и отбора можно разделить на две группы: 1) биолого-токсикологические - скармливание подопытным животным тестируемых пробиотических препаратов и установление лечебного эффекта от их применения на фоне кормов, содержащих токсические компоненты; 2) инструментально-микробиологические - выделение микроорганизмов из пробиотических препаратов или из полевых условий с последующей оценкой их культуральных свойств - способности разрушать микотоксины в экспериментальных средах, рассчитанной по убыли ксенобиотика.

Однако существующие методы подчас исключительно сложны, трудоемки и не отвечают запросам массового анализа. Биологические методы не всегда специфичны и требуют большого числа лабораторных животных. Инструментальные методы, при видимой их привлекательности, нуждаются в высококвалифицированном обслуживании и значительных затратах времени на предварительную подготовку. К тому же они очень дорогостоящие. Другие методы качественной оценки, не основанные на специфичности к токсическим метаболитам плесневых грибов, не могут быть использованы для решения указанных задач отбора микроорганизмов-деструкторов микотоксинов.

Наиболее близким по своей технической сущности способом к заявляемому способу является прием выявления микроорганизмов-деструкторов гербицидов и пестицидов (Патент РФ №2051961), взятый в качестве прототипа. В известном способе исследования проводят в чашках Петри, которые заполняют агаровой средой Е-8, содержащей минеральные соли, ксенобиотики (в качестве объекта деструкции), а также индикатор дегидрогеназной активности грибов и бактерий - 2,3,5-трифенилтетразолий хлорид (ТТХ). Агар засевают выделенными культурами и выращивают их в течение 6-18 суток. Результат учитывают по размерам зоны роста, образующейся за счет цветной реакции восстановления ТТХ, связанный с окислением ксенобиотиков, которые используются микрофлорой в качестве источника питательных веществ (N).

Предложенный способ отличается от известного тем, что посев проводят на питательную среду, содержащую микотоксины, а в качестве редоксиндикатора роста микроорганизмов в среду дополнительно вводят резазурин (7-гидрокси-3Н-феноксазин-3-он-10-оксид натриевая соль) в количестве 4-18×10^-6 М/л. О наличии микроорганизмов-деструкторов микотоксинов свидетельствует зона обесцвечивания красного цвета, указывающая на образование восстановленной формы резазурина под действием микробных дегидрогеназ. Микотоксины не используются бактериями в качестве питательных веществ, но они активно подавляют обменные процессы в микробной клетке, способствуя ее гибели (бактерицидный эффект). Таким образом, в данном случае уровень микробной ферментации используется в качестве основного признака жизни (выживания), который выгодно отличает устойчивые формы микроорганизмов от чрезвычайно чувствительных к токсинам культур.

Использование в качестве реагента для индикации оксидоредуктазной активности резазурина известно. Последний обладает некоторыми преимуществами перед аналогичными индикаторами (метиленовым синим, нитросиним тетразолием и др.), поскольку полный процесс его восстановления заканчивается в более высоком потенциале окисления, это позволяет значительно сократить продолжительность времени анализа и с большей точностью проводить лабораторные исследования.

Традиционно для получения пробиотических препаратов используют факультативно-анаэробные симбиотические формы микроорганизмов (Lactobacillus, Bacillus, Enterobacteriaceae), для культивирования которых применяют чашечный метод, допускающий присутствие атмосферного кислорода. В зависимости от вида бактерий для выполнения поставленной задачи можно использовать как селективные, так и неселективные (МПА, ГРМ-агар) питательные среды со слабой специфичной окраской от светло-желтого до бледно-коричневого цвета.

Сравнительный анализ заявляемого решения с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается тем, что качественную оценку способности микроорганизмов метаболизировать содержащиеся в среде микотоксины осуществляют с помощью визуального наблюдения за изменением уровня их дегидрогеназной активности по размерам зоны роста бактерий на плотной питательной среде, окрашенной за счет цветной реакции с резазурином, добавленным в среду и восстанавливающимся из красной соли до бесцветного соединения при окислительно-восстановительных реакциях, в т.ч. микробного разложения (биохимической деструкции) ксенобиотиков.

Предлагаемый способ сокращает время анализа с нескольких недель до нескольких дней, упрощает процедуры выявления и отбора микроорганизмов-деструкторов микотоксинов, снижает расход химических реактивов, удешевляет работу и отличается большей точностью. Тогда как в прототипе качественную оценку способности микроорганизмов разрушать ксенобиотики в результате своей жизнедеятельности проводят в отношении гербицидов и фунгицидов, которые по своим свойствам кардинально отличаются от микотоксинов, являются водорастворимыми химическими веществами узкого профиля - направленными на борьбу с сорными растениями и фитопатогенной грибной микрофлорой.

В заявляемом способе введение дополнительно в агаровую среду чашки Петри резазурина для обнаружения комплекса ферментов, катализирующих окислительно-восстановительное расщепление органических веществ, и обесцвечивание красного окрашивания свидетельствует о деструкции микотоксинов. Максимум обесцвеченной зоны по сравнению с контролем свидетельствует о максимуме ферментной активности микроорганизмов-деструкторов, а следовательно, и о высокой толерантности к ним и о высокой степени деструкции микотоксинов. Таким образом, выявление микроорганизмов деструкторов микотоксинов в заявляемом техническом решении ведется визуально по уровню их окислительной активности. Технический результат также заключается в том, что посредством предлагаемого отбора представляется возможным выделить эффективные микроорганизмы-деструкторы микотоксинов, которые можно использовать для воздействия на токсический процесс при скармливании их животным в виде пробиотических препаратов.

Пример конкретного применения 1. Работу проводили в лаборатории микотоксикологии ГНУ ВНИТИП Россельхозакадемии в 2009-2010 г. Для исследований отбирали несколько коммерческих молочнокислых препаратов, содержащих микрофлору рода Lactobacillus {Lactobacillus acidophilus, L.casei, L.rhamnosu, L.bulgaricus). Все исследуемые препараты (популяции микроорганизмов) были выбраны в качестве модельных, распределены в случайном порядке и обозначались сквозной нумерацией. Перед началом эксперимента в стерильных условиях из всех образцов были сделаны посевы на селективную среду («Лактобакагар»¹) (¹Среда «С-56», состав (г/л): панкреатический гидролизат рыбной муки - 20,0; экстракт пекарских дрожжей - 5,0; экстракт мясной - 5,0; глюкоза - 20,0; калий фосфорнокислый 1-замещенный - 2,0; натрий уксуснокислый - 5,0; «Твин-80» - 2 мл; аммоний лимоннокислый 1-замещенный - 2,0; магний сернокислый - 0,1; марганец хлористый - 0,05; агар - 13,0±2,0, pH 5,7±0,3.), типированы и отобраны ее характерные представители, из которых в последующем готовили на физиологическом растворе суспензию живых суточных клеток с концентрацией 10⁸ КОЕ/мл.

В ходе дальнейших исследований каждый изолят (штамм) лактобактерий был внесен уколом на стерильную питательную среду, содержащую резазурин и смесь микотоксинов (Т-2 токсин, охратоксин A, афлатоксин B₁) суммарной токсичностью 5-6 ПДК. Указанные виды и уровни микотоксинов наиболее часто обнаруживаются в кормовом сырье при диагностировании хронических микотоксикозов в промышленном птицеводстве.

Ввиду того, что по своим физико-химическим свойствам токсические метаболиты плесневых грибов являются нерастворимыми в воде гидрофобными соединениями, с целью обеспечения условий для равномерного их распределения в среде, в нее добавляли ПАВ «Твин 60» (полиоксиэтилен(20)сорбитан моноолеат) - из расчета 8-30×10^-4 М/л среды. Данная концентрация эмульгатора не оказывала негативного влияния ни на рост микрофлоры, ни на точность последующего выполнения анализа. Контрольный вариант содержал аналогичную среду без микотоксинов. Все посевы инкубировали при температуре при 37°C и через 72 часа производили учет цветной реакции исследуемого штамма, измеряя диаметр обесцвеченной зоны (зона роста).

Исследования проводили в трехкратной повторности (n=3), за результат брали среднее между тремя параллельными определениями.

Результаты исследования (табл.1) показали, что из нескольких видов лактобактерий некоторые формы оказались чрезвычайно толерантны к токсическим продуцентам грибов и имели максимальную (>15 мм) зону обесцвечивания резазурина (препарат 1), приближающуюся к значениям контрольной пробы (среда без микотоксинов). Другие штаммы, напротив, чрезвычайно плохо переносили аналогичную концентрацию смеси микотоксинов и имели практически незаметную зону (~1 мм) роста на чашках Петри (препарат 8). Таким образом, исследуемые культуры микроорганизмов при наличии в среде микотоксинов проявляют различные уровни дегидрогеназной активности, что свидетельствует о различной способности этих культур биохимически разлагать микотоксины.

Для проверки достоверности предложенного способа провели исследования по установлению убыли микотоксинов при росте на среде указанных культур. Исследования проводили в чашках Петри (диаметром 90 мм), которые заполняли расплавленной агаровой средой (по 10 мл в каждую чашку) с указанными микотоксинами. Чашки устанавливали на горизонтальную поверхность, после застывания агара его подсушивали инкубацией при 37°C с приоткрытой крышкой в течение 20 минут. После этого на поверхность чашки стерильно вносили 1 мл инокулята и равномерно распределяли его по поверхности путем покачивания. В качестве инокулята использовали культуру молочнокислых бактерий, разведенных физиологическим раствором до концентрации 10⁸ КОЕ/мл, что через 20 часов инкубации дает на поверхности агаровой среды сплошной гомогенный рост. По истечении 10 суток в среде определяли остаточное содержание микотоксинов методом твердофазного конкурентного иммуноферментного анализа (Наставления №№13-5-02/0516, 13-5-02/0514 и 13-5-02/0520 по применению тест-системы для иммуноферментного определения микотоксинов: T-2 токсин, охратоксин A и афлатоксин B₁ / Утв. Департаментом ветеринарии МСХ РФ 11.07.2002 г.) и соотносили обнаруженное их содержание к исходной концентрации), соотнося обнаруженное их содержание к исходной концентрации.

Таблица 1 Сравнительная оценка культуральных свойств микроорганизмов на дегидрогеназную активность и способность метаболизировать микотоксины (n=3) № препарата (культура бактерий) Вариант Диаметр зоны обесцвечивания резазурина через 3-е суток, мм Убыль микотоксинов в среде, % к исходному их количеству (в среднем по трем микотоксинам) 1 Контроль 16,0 --- 1 Среда+микотоксины 14,8 54,5 8 Контроль 16,5 --- 8 Среда+микотоксины 1,2 12,7

Из таблицы 1 видно, что в процессе выращивания на питательном агаре микрофлора, выделенная из препарата 1, обладала максимальной способностью (до 54,5%) превращать микотоксины в соединения, которые по своей химической природе уже таковыми не являлись и не обнаруживались доступными методами анализа. У препарата 8 способность биохимически преобразовывать токсические метаболиты плесневых грибов у этой группы микроорганизмов была минимальной (12,7%) из всего массива и находилась в пределах статистической погрешности.

Таким образом, по совокупности культуральных свойств - по чувствительности и способности биотрасформировать микотоксины в безвредные вещества - оба штамма, используемые для приготовления пробиотических препаратов 1 и 8, имели диаметрально противоположные свойства (самый активный и самый уязвимый), и были оценены в опыте со скармливанием их птице на фоне модельного микотоксикоза в качестве наглядного примера, отражающего потенциальные различия в эффективности профилактики.

Пример конкретного применения 2. Дальнейшую работу проводили в виварии ГУП «Загорское ЭПХ ВНИТИП» на цыплятах-бройлерах кросса «Cobbavian-48», из которых было сформировано 4 группы - 2 контрольные и 2 опытные, по 35 голов цыплят в каждой. Продолжительность эксперимента составила 5 недель, бройлеров выращивали в типовых клеточных батареях; условия содержания птицы соответствовали принятым зоогигиеническим параметрам и отвечали нормативным требованиям для данного кросса.

Цыплята контрольной группы 1 получали свободный от микотоксинов основной рацион кукурузного типа (ОР) с параметрами питательности, соответствующими рекомендуемым нормам кормления сельскохозяйственной птицы (ВНИТИП, 2006 г.). Комбикорма для бройлеров отрицательной контрольной группы 2 имели аналогичную питательность, но содержали в своем составе смесь трех микотоксинов (T-2 токсин, охратоксин A, афлатоксин B₁), на уровне суммарной токсичности 10-12 ПДК, что достигалось введением в рацион инактивированной фунгально-мицелиальной биомассы на основе зерна кукурузы с токсигенными штаммами плесневых грибов рода Fusarium и Aspergillus. Схема опыта представлена в таблице 2.

Таблица 2 Схема опыта по профилактике микотоксикозов на птице Группа Особенности кормления 1. Контрольная Основной рацион (ОР) - комбикорм кукурузного типа с питательностью, соответствующей нормам кормления птицы ВНИТИП (2006 г.) 2. Контрольная ОР, содержащий смесь микотоксинов (T-2 токсин, охратоксин A, афлатоксин B₁) на уровне 10-12 ПДК (OP₁) 3. Опытная OP₁ + препарат 1 (10⁸ КОЕ/г корма) 4. Опытная OP₁ + препарат 8 (10⁸ КОЕ/г корма)

Подопытные цыплята из двух групп 3-4 получали контаминированные микотоксинами корма (OP₁), но в состав их рационов были дополнительно включены два пробиотических препарата - препарат 1 (группа 3) и препарат 8 (группа 4) на основе живых микроорганизмов рода Lactobacillus. Для технологичного использования в кормах обе формы микроорганизмов были предварительно размножены и нанесены на органический носитель (отруби), включение которого в рационы птицы осуществляли на стадии приготовления комбикормов методом ступенчатого смешивания, из расчета 10⁸ КОЕ/г корма (согласно схемы опыта).

Результаты проведенного исследования показали (табл.3), что наличие микотоксинов в корме (группа 2) сопровождалось угнетением всех показателей выращивания птицы. Бройлеры этой группы отличались низкими темпами роста (на 18,9%), более высоким падежом (на 17,1%) и крайне неэффективным использованием корма на 1 кг прироста (на 25,6%), чего не наблюдалось при скармливании комбикормов, свободных от микотоксинов (группа 1). Таким образом, на фоне экспериментального микотоксикоза сочетанного типа оказалось удобно установить влияние обоих пробиотических препаратов, контрастных по своим культуральным свойствам.

Таблица 3 Зоотехнические показатели выращивания цыплят-бройлеров, получавших пробиотические препараты с разными культуральными свойствами Показатель Группа 1 (K₁) 2 (K₂) 3 4 Сохранность поголовья в группе, % 97,1 80,0 94,3 85,7 Средняя живая масса в группе, г 2064,3 1674,2 1925,7 1761,5 Валовой прирост живой массы в группе, кг 68,72 45,41 62,08 51,38 Затраты корма на 1 кг прироста живой массы, кг 1,76 2,21 1,90 1,92 Европейский индекс продуктивности, ед. 325,4 173,2 273,0 224,7

Анализируя данные, необходимо отметить, что в опытных группах, получавших пробиотические препараты 1 и 8, сохранность птицы повысилась на 14,3% и 5,7% соответственно. Однако максимальное влияние культуральных свойств лактобактерий, отобранных по способности биохимически разрушать микотоксины, отразилось на скорости роста птицы и эффективности использования корма. Так, в группе 3, получавшей наиболее предпочтительный препарат 1, живая масса бройлеров и валовой прирост в группе оказались в среднем на 8,7-17,2% выше, чем у сверстников, которым скармливали менее действенную для профилактики микотоксикозов культуру лактобацилл (препарат 8). В результате активной деструкции ксенобиотиков в пищеварительном тракте птицы и снижения их алиментарной нагрузки на организм представилось возможным получить существенные преимущества при выращивании птицы на загрязненных кормах. При этом фактическое уменьшение поступления токсических метаболитов и снижение их депонирования в печени (на 24-38%) позволило снизить негативное влиянием микотоксинов и компенсировать утраченную продуктивность в группе 3 более чем на 55%. Слабые же культуральные свойства микрофлоры (препарат 8), используемой в качестве пробиотического средства, обусловили проявление лишь незначительных преимуществ по комплексу рассматриваемых показателей. Следовательно, использование молочнокислых бактерий, изначально приспособленных для интенсивной деструкции микотоксинов, оправдано для профилактики микотоксикозов, т.е. для этих целей можно использовать тех микроорганизмов, которые обеспечивают большую зону просветления, при культивировании на среде с резазурином и микотоксинами.

Таким образом, данные двух вспомогательных опытов (2. Деструкция микотоксинов в питательных средах. и 3. Выращивание птицы на токсических комбикормах) подтверждают достоверность результатов, полученных по предлагаемому способу, представленному в таблице 1. Таким образом, показатель величины зоны обесцвечивания, определяемой интенсивностью функционирования ферментных систем микроорганизмов, также можно использовать для выявления культур-деструкторов микотоксинов.

Использование предлагаемого способа выявления микроорганизмов-деструкторов микотоксинов обеспечивает следующие преимущества: позволяет выявить штаммы и изоляты симбиотической микрофлоры, обладающие способностью метаболически разрушать микотоксины, представляющие опасность для здоровья человека и животных и являются причиной снижения экономической эффективности при промышленном ведении животноводства. Успешное решение этих вопросов позволит сформировать микробиологическую базу для создания пробиотических препаратов, способных смягчать негативные последствия от вынужденного скармливания недоброкачественных (токсичных) кормов. Не менее важным является и то обстоятельство, что значительно сокращается время выявления и отбора перспективных форм микроорганизмов, способных активно биотрансформировать микотоксины в безопасные вещества, а за счет сокращения объема аналитических манипуляций отпадает необходимость использовать для анализа дорогостоящее оборудование, реагенты и лабораторных животных. Среди существующих методов выявления и отбора активных культур микроорганизмов-деструкторов микотоксинов, являющихся одними из основных источников снижения рентабельности сельскохозяйственного производства и ухудшения качества получаемой продукции, предлагаемый способ является более дешевым и простым в техническом исполнении.

Для отбора микроорганизмов-деструкторов микотоксинов для профилактики микотоксикозов осуществляют посев исследуемой культуры на селективную питательную среду Лактобакагар, содержащую смесь микотоксинов и резазурин, и контрольную среду без микотоксинов, и культивирование. По окончании культивирования проводят оценку их способности метаболизировать токсические метаболиты по обесцвечиванию интенсивно красного цвета до бесцветного и выявляют микроорганизмы-деструкторы микотоксинов по диаметру зоны обесцвечивания, максимально приближающемуся к значению контроля. Изобретение обеспечивает возможность выделения эффективных микроорганизмов-деструкторов микотоксинов, которые можно использовать для воздействия на токсический процесс при скармливании их животным в виде пробиотических препаратов. 3 табл., 2 пр.

Способ отбора микроорганизмов-деструкторов микотоксинов для профилактики микотоксикозов, включающий приготовление плотной питательной среды с микотоксинами, посев на нее исследуемой культуры и культивирование с последующей оценкой их способности метаболизировать токсические метаболиты микромицетов по обесцвечиванию видимой в присутствие индикатора зоны, отличающийся тем, что посев осуществляют на селективную питательную среду Лактобакагар, содержащую смесь микотоксинов, и контрольную среду без микотоксинов, а в качестве редокс-индикатора используют резазурин, который предварительно вводят в среду, причем оценку проводят по обесцвечиванию интенсивно красного цвета до бесцветного и выявляют микроорганизмы-деструкторы микотоксинов по диаметру зоны обесцвечивания, максимально приближающемуся к значению контроля.