СРЕДСТВО ДЛЯ КОРРЕКЦИИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНДРОМА Российский патент 2012 года по МПК C07K5/09 A61K38/06 A61P3/06 A61P3/10 

Изобретение относится к медицине, а именно к пептидным соединениям, и, в частности, к трипептидам, которые могут найти применение для коррекции нарушений липидного и углеводного обмена при метаболическом синдроме.

Метаболический синдром (МС) представляет собой совокупность гормональных и метаболических нарушений, взаимосвязанных факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и сахарного диабета, которые объединяет общий патофизиологический механизм - инсулинорезистентность. Компоненты, составляющие метаболический синдром, суть абдоминально-висцеральное ожирение, инсулинорезистентность и гиперинсулинемия, нарушение толерантности к глюкозе, ранний атеросклероз, дислипидемия, микроальбуминурия, патология пуринового обмена. Практически все компоненты, составляющие метаболический синдром, являются независимыми факторами риска развития сердечно-сосудистых заболеваний, а сочетание нескольких компонентов существенно увеличивает опасность их развития.

Проблема лечения МС остается в центре внимания практических врачей. Основная цель терапии больных с МС - максимальное снижение риска развития сердечно-сосудистых заболеваний и их опасных осложнений. Эффективность фармакотерапии МС оценивается с позиции предотвращения развития заболеваний, связанных с атеросклерозом, и их осложнений. Коррекция инсулинорезистентности, ключевого патофизиологического звена метаболического синдрома, также является важным направлением фармакотерапии [Маколкин В.И. Метаболический синдром. - М.: Медицинское информационное агентство, 2010. - 144 с.].

Возможность коррекции МС могла бы предотвратить развитие указанных заболеваний.

Технический результат, достигаемый в заявляемом изобретении, заключается в коррекции нарушения липидного и углеводного обмена при МС.

Указанный технический результат достигается тем, что в качестве средства для коррекции метаболического синдрома используют трипептид L-лизил-L-глутамил-L-триптофана общей формулы

где Х=ОН или NH₂.

Lys-Glu-Trp-OH(X=ОН) упомянут в СА 2276542, 2000, (п.2 формулы) как средство для модуляции гемопоэза у животных. Использование его для коррекции метаболического синдрома не описано. Трипептид получен известным способом пептидного синтеза в растворе [Якубке Х.-Д., Ешкайт X. Аминокислоты, пептиды, белки: Пер. с нем. - М.: Мир, 1985, 456 с.; Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. - М.: Просвещение, 1987. - 815 с.].

Содержание основного вещества определяли методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на хроматографе "Beckman" на колонке Vydac С18, 218ТР, 4,6×250, подвижная фаза 0,05% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле, градиент 23-48% за 25 мин, скорость потока 1,0 мл/мин. Детекция при 220 нм. Содержание основного вещества 95,9% (Х=NH₂) и 96,9% (Х=ОН). Молекулярная масса расчетная 460,53 (X=NH₂) и 461,51 (Х=ОН), определенная экспериментально - 460,98 и 462,05 соответственно.

Общетоксическое действие заявляемого соединения исследовали в соответствии с требованиями «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005): острой токсичности при однократном введении препарата, а также подострой и хронической токсичности при длительном введении пептида.

Исследование по изучению острой токсичности проведено на 60 белых беспородных мышах-самцах с массой тела 18-20 г. Исследования по изучению подострой токсичности проведено на 50 белых беспородных крысах-самцах с массой тела 180-220 г. До введения препарата, на 30, 60 и 90 сутки после начала введения препарата у животных исследовали морфологический состав и свойства периферической крови. При завершении эксперимента исследовали биохимические и коагулогические показатели крови.

Исследования по изучению хронической токсичности проводили в течение 6 месяцев, исходя из длительности рекомендуемого клинического назначения препарата, на 76 морских свинках-самцах с массой тела 290-320 г. У животных в периферической крови общепринятыми методами определяли: количество эритроцитов, гемоглобина, ретикулоцитов, тромбоцитов, лейкоцитов, лейкоцитарную формулу, скорость оседания эритроцитов (СОЭ), резистентность эритроцитов. Наряду с этим определяли содержание в сыворотке крови общего белка по методу Лоури, калия и натрия методом плазменной спектрофотометрии. После завершения эксперимента проводили патоморфологическое исследование головного и спинного мозга, спинномозговых ганглиев, щитовидной железы, паращитовидных желез, надпочечников, семенников, гипофиза, сердца, легких, аорты, печени, почки, мочевого пузыря, поджелудочной железы, желудка, тонкой кишки, толстой кишки, тимуса, селезенки, лимфатических узлов, костного мозга.

При изучении острой токсичности установлено, что однократное введение исследуемого пептида животным в дозе, превышающей терапевтическую, рекомендованную для клинического применения, более чем в 5000 раз, не вызывает токсических реакций, что свидетельствует о большой терапевтической широте препарата.

Изучение подострой и хронической токсичности пептида свидетельствует об отсутствии побочных эффектов при длительном применении препарата в дозах, превышающих терапевтическую в 100-1000 раз. При исследовании не отмечено достоверного влияния исследуемого пептида на морфологические, биохимические показатели в периферической крови, а также на СОЭ и резистентность эритроцитов.

При оценке общего состояния животных, морфологических и биохимических показателей периферической крови, морфологического состояния внутренних органов, состояния сердечно-сосудистой и дыхательной систем, функции печени и почек патологические изменения в организме не обнаружены.

Было изучено фармакологическое действие заявляемого вещества на экспериментальных моделях гиперлипидемии, алиментарной атерогенной дислипопротеинемии и аллоксанового диабета, а также в клинике при лечении метаболического синдрома у больных старших возрастных групп.

Результаты исследования фармакологического действия заявляемого вещества приведены в примерах. Для облегчения изложения заявляемое соединение в форме основания (Х=ОН) обозначили как Lys-Glu-Trp, а в форме амида (X=NH₂) как Lys-Glu-Trp-NH₂.

Пример 1. Влияние заявляемых трипептидов на уровень липидов у крыс в экспериментальной модели гиперлипидемии, вызванной твином-80

Эксперименты выполняли на 51 аутбредных крысах-самцах линии Sprague-Dawley с массой тела 220-240 г.

Введение изучаемых пептидов проводили ежедневно в суточной дозе 20 и 200 мкг/кг внутрижелудочно в течение 5 дней до создания гиперлипидемии. В качестве препарата сравнения использовали антигиперлипидемический препарат из группы производных фиброевой кислоты или фибратов-безафибрат (2-(β-парахлорбензоиламиноэтил)фенокси-2-метилпропиновую кислоту) в дозе 50,0 мг/кг.

Гиперлипидемию моделировали у крыс путем внутрибрюшинного введения твина-80 (полисорбат-80, смесь полиэтиленгликолевых эфиров моноолеата ангидросорбитов) в дозе 300 мг/кг. Через 24 часа крыс подвергали эвтаназии. В сыворотке крови животных определяли уровень триглицеридов, общий холестерин и холестерин липопротеидов высокой плотности (ЛПВП).

В результате изучения специфической фармакологической активности установлено, что пептиды оказывают гиполипидемическое действие на фоне гиперлипидемии, вызванной твином-80, что характеризуется уменьшением в крови триглицеридов, общего холестерина и повышением уровня холестерина ЛПВП (табл.1).

Таблица 1 Влияние трипептидов Lys-Glu-Trp и Lys-Glu-Trp-NH₂ на показатели липидного обмена у крыс при гиперлипидемии, вызванной твином-80 Экспериментальные группы/доза Триглицериды, ммоль/л Общий холестерин, ммоль/л Холестерин ЛПВП, ммоль/л Интактные 0,66±0,03 1,16±0,04 1,01±0,04 Контроль (гиперлипидемия) 1,29±0,05* 2,77±0,20* 0,55±0,04* Трипептид Lys-Glu-Trp, 20 мкг/кг 0,58±0,05** 1,55±0,20** 0,97±0,04** Трипептид Lys-Glu-Trp, 200 мкг/кг 0,67±0,05** 2,10±0,17** 0,60±0,02* Трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂, 20 мкг/кг 0,76±0,14** 1,69±0,15** 1,05±0,02** Трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂, 200 мкг/кг 0,88±0,12** 1,22±0,15** 1,09±0,02** Безафибрат, 50,0 мг/кг 0,55±0,06** 1,34±0,03** 0,98±0,05** * - Р<0,05 по сравнению с интактными животными; ** - Р<0,05 по сравнению с контрольными животными.

Пример 2. Влияние трипептида Lys-Glu-Trp на уровень липидов у крыс в экспериментальной модели алиментарной атерогенной дислипопротеинемии.

Эксперимент проводился на 40 белых крысах-самцах линии Вистар с массой тела 230-250 г. Животные были распределены на 4 группы, 1-я группа контрольная (интактная), 2-4-я группы - экспериментальные.

Экспериментальные животные получали гиперхолестеринемическую (ГХС) диету для моделирования алиментарной атерогенной дислипопротеинемии (ДЛП). ГХС диета включала не менее 7,5% холестерина (ХС), 45% жиров и избыточное (500000 ME) содержание витамина D₂. Одновременно с созданием ДЛП 3-я группа животных получала внутрибрюшинно ежедневно Lys-Glu-Trp в дозе 100 мкг/кг. 4-я группа животных получала 25 мг/кг внутрибрюшинно липантила. Липантил 200М фирмы Lab. Fournier S.A. (Франция), или фенофибрат, применяется для лечения гиперлипопротеинемии, не поддающейся коррекции с помощью диеты. Эксперимент продолжался в течение 24 суток. Во время эксперимента в опытных группах, получавших Lys-Glu-Trp и липантил, животные выглядели в пределах нормы, были упитанными и имели гладкую блестящую шерсть. Во 2-й группе животные имели взъерошенную шерсть и проявляли повышенную возбудимость, что может объясняться избытком витамина D₂.

После выведения из эксперимента декапитацией оценивали содержание в сыворотке крови животных общего уровня холестерина (ХС), триглицеридов (ТГ), холестерина липопротеинов высокой плотности (ХС ЛПВП) и рассчитывали концентрацию холестерина липопротеинов низкой плотности (ХС ЛПНП) и холестериновый индекс атерогенности (ИА). Указанные показатели приведены в табл.2.

Таблица 2 Влияние трипептида Lys-Glu-Trp на показатели липидного обмена в условиях алиментарной ДЛП, вызванной кормлением крыс ГХС диетой в течение 24 дней № пп Группа животных Триглицериды (ммоль/л) ХС (ммоль/л) ХСЛПВП (ммоль/л) ХС ЛПНП (ммоль/л) ИА 1 Интактные 0,64±0,05 0,97±0,10 0,70±0,05 -0,02±0,11 0,40±0,19 2 ГХС диета 1,59±0,18* 3,35±0,22* 0,31±0,07* 2,32+0,20* 11,0±2,7* 3 ГХС диета + трипептид Lys-Glu-Trp 0,96±0,16** 1,70±0,27** 0,55±0,10** 0,71±0,24** 2,21±0,58** 4 ГХС + липантил 0,62±0,08** 2,24±0,21** 0,55±0,08** 1,41±0,22** 3,25±0,75** * - Р<0,05 по сравнению с показателем у интактных животных (1 группа); ** - Р<0,05 по сравнению с показателем у животных с ГХС диетой (2 группа).

Оценивалось состояние и вес печени, селезенки и надпочечников.

Как видно из таблицы 2, Lys-Glu-Trp достоверно снижает уровень всех показателей, свидетельствующих о развитии алиментарной ДЛП.

Липантил также снижает показатели, свидетельствующие о развитии алиментарной ДЛП, однако уменьшение величины индекса атерогенности меньше, чем при лечении Lys-Glu-Trp.

Исследования внутренних органов животных показало, что Lys-Glu-Trp не оказывал неблагоприятного действия на конечную массу тела и относительную массу печени, селезенки и надпочечников в отличие от гиполипидемического препарата липантила, под влиянием которого была увеличенной не только абсолютная, но и относительная масса печени.

Таким образом, на экспериментальной модели алиментарной ДЛП показано гиполипидемическое действие трипептида, сопоставимое и превышающее эффект известного препарата из группы фибратов. При этом прием трипептида не вызывал побочных эффектов и осложнений.

Пример 3. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом после применения трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂.

Как известно, аллоксановый диабет характеризуется поражением β-клеток поджелудочной железы и сопровождается выраженной гипергликемией, вследствие дефицита инсулина и активации глюконеогенеза.

Эксперимент проведен на 18 белых беспородных крысах-самцах со средней массой тела 349±19 г. После определения концентрации глюкозы в крови все животные были разделены на 2 группы. Затем всем животным однократно внутривенно ввели по 1 мл раствора аллоксана («Spofa») в дозе 35 мг/кг. Через 15 сут животным контрольной группы начали вводить внутрибрюшинно ежедневно однократно по 0,3 мл 0,9% раствора NaCl, а крысам основной группы - трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂ в дозе 3 мкг (в 0,3 мл 0,9% раствора NaCl) на крысу в течение 11 суток. Отдельную группу составили 7 здоровых крыс с аналогичной массой тела.

Установлено, что введение трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ способствовало достоверному снижению уровня глюкозы в крови у животных на 28 сутки исследования в среднем на 34,8%. Снижение уровня глюкозы при введении трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ коррелировало со снижением летальности среди животных основной группы.

Затем всем животным внутривенно вводили инсулин (0,3 МЕ) и определяли концентрацию глюкозы в крови.

Результаты эксперимента приведены в таблице 3. У здоровых животных отмечено физиологическое резкое снижение уровня глюкозы, в то время как в контроле (аллоксановый диабет) этот показатель был в 2,7 раза ниже. У животных с аллоксановым диабетом, получивших трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂, отмечено после введения инсулина достоверное снижение уровня глюкозы почти в 2 раза по сравнению с контролем. Эти данные указывают на способность трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ в значительной степени сохранять чувствительность тканей к инсулину.

Таблица 3. Влияние инсулина на содержание глюкозы в крови крыс с аллоксановым диабетом после применения трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ Группа животных Концентрация глюкозы в крови (мг %) Снижение уровня глюкозы относительно исходного уровня(%) Исходный уровень Через 30 мин после введения инсулина Здоровые 83,5±3,2 29,4±2,2 64,8 Контроль (аллоксановый диабет + NaCl) 375,7±11,2* 287,8±12,5* 23,4 Аллоксановый диабет + трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂ 221,5±11,2* 123±8,3^# 44,2 * - Р<0,001 по сравнению со здоровыми; ^# - Р<0,05 по сравнению с контролем.

Трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂ не вызывает побочных эффектов, осложнений и лекарственной зависимости.

Пример 4. Эффективность применения трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ при лечении метаболического синдрома у больных старших возрастных групп

В исследование вошли больные с верифицированным диагнозом: метаболический синдром. Диагноз ставился при наличии следующих критериев: артериальная гипертензия, нарушение толерантности к глюкозе, ожирение, дислипидемия. Обследовано 85 пациентов с метаболическим синдромом (женщин - 50, мужчин 35). Средний возраст мужчин составил 54,6±12 лет, средний возраст женщин 55,6±13,0 лет.

Критерии включения пациентов в исследование:

1. Возраст старше 45 лет для мужчин и женщин.

2. Наличие клинических признаков метаболического синдрома.

3. Наличие верифицированной патологии желудочно-кишечного тракта (запоры, синдром раздраженной кишки, холецистит, панкреатит, гепатозы).

4. Согласие пациента.

Критериями исключения больных из исследования были наличие семейной дислипидемии, острой патологии ЖКТ, признаков глистной инвазии, онкологической и системной патологии.

Комбинация используемой патогенетической терапии с использованием таких средств, как ингибиторы АПФ, блокаторы Ca2⁺-каналов, диуретики, β-блокаторы и их дозирование определялось клиническими показаниями. В исследование не включались больные, находящиеся на терапии нитропрепаратами, статинами. Все больные находились на гипохолестеринемической диете, включающей прием отрубей.

Трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂ применяли у 47 пациентов перорально в дозе 500 мкг на прием 2 раза в сутки в течение 30 дней. Перерыв между курсами лечения составлял 2 месяца.

Больные наблюдались в течение 12 месяцев. Обследование производилось в 3 этапа: исходно (на момент верификации диагноза), через 6 месяцев и через год.

У всех больных анализировались следующие параметры: пол, возраст на момент исследования, длительность заболевания, длительность артериальной гипертензии, ожирения, дислипидемии. Обследование больных включало оценку факторов риска, таких как наследственность, ожирение, сахарный диабет, ИБС. Анализировался социальный анамнез - особенности образа жизни, пищевые привычки. Проводились антропометрические измерения: рост, вес, индекс массы тела. У всех больных проводилось плановое лабораторное обследование: клинический анализ крови и исследование биохимических показателей крови. Определялись уровень гемоглобина, число эритроцитов, лейкоцитов, лимфоцитов. Среди биохимических показателей сыворотки определялись общий белок, альбумины, уровень триглицеридов, холестерина, ЛПНП, ЛПВП, коэффициента атерогенности. Из инструментальных исследований проводился глюкозотолерантный тест, УЗИ органов брюшной полости, исследования копрограммы, исследование функции щитовидной железы (гормональный статус).

На фиг.1-3 представлены результаты применения Lys-Glu-Trp-NH₂ при лечении проявлений МС.

В результате проведенного исследования при динамическом наблюдении было установлено, что применение трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ способствовало снижению концентрации холестерина (см. фиг.1).

Под воздействием трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ наблюдалось максимальное снижение концентрации триглицеридов на период третьего обследования по прошествии года (см. фиг.2).

На фоне применения трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ наблюдалось также выраженное снижение коэффициента атерогенности (см. фиг.3).

Было выявлено значимое влияние трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂, применяемого в комплексной терапии, на увеличение концентрации липопротеинов высокой плотности.

Использование трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ в комплексной терапии метаболического синдрома приводило к более быстрому и стабильному гипотензивному эффекту.

Трипептид Lys-Glu-Trp-NH₂ не вызывает побочных эффектов, осложнений и лекарственной зависимости.

Таким образом, применение трипептида Lys-Glu-Trp-NH₂ в сочетании с базисной терапией приводило к улучшению липидного спектра, потенцированию гипотензивного эффекта, а также к улучшению нутриционного статуса больных метаболическим синдромом, что предопределяет целесообразность его широкого применения в терапевтической и особенно в гериатрической практике.

Изобретение относится к медицине, а именно к пептидам, которые могут найти применение для коррекции метаболического синдрома. Предложено средство для коррекции метаболического синдрома, представляющее собой трипептид L-лизил-L-глутамил-L-триптофан. 3 ил., 3 табл., 4 пр.

Средство для коррекции метаболического синдрома, представляющее собой трипептид L-лизил-L-глутамил-L-триптофан общей формулы

где Х=ОН или NH₂.