Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммуннорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии.
В практической медицине широко известны в качестве регуляторов иммунных процессов тимусные экстракты, в частности тимозин фракция 5 (Coldstein A.L., Guna A., Latz M.M., Hardy H.A., White A.) тималин (CH, N 659586). Эти экстракты состоят из комплекса веществ полипептидной природы и получение их из природных источников ограничено сложностью производства, малым выходом активных веществ и значительной вариабельностью их физико-химических характеристик и биологических свойств. Кроме того, из-за присутствия в природных препаратах тимуса балластных компонентов при их использовании у больных иногда возникают побочные явления. Последнее обстоятельство явилось стимулом для создания синтетических пептидов, обладающих иммунорегуляторными свойствами: SU N 1582393, EP N 230052, US N 5008246, US N 5013723. Каждый из полученных синтетических пептидов с ограниченным комплексом необходимых свойств обладает высокой активностью, низкой токсичностью, отсутствием побочных эффектов, которые определяют их возможное применение в медицине.
В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы:
X-Glu-Тrp-Y,
где
H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомасляная кислота, ξ - аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-VaL, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомасляная кислота, ξ - аминокапроновая кислота, - OH, моно- или дизамещенный амид (C1 -C3)/
Целью изобретения было также создание принципиально нового технологического процесса получения вещества пептидной природы, который позволил бы при минимальном количестве и простоте стадий получать с высоким выходом продукт вышеприведенной формулы.
Сущность нового способа состоит в синтезе пептида в растворе путем последовательного наращивания цепи с C-конца молекул, используя стратегию максимального блокирования функциональных групп, исходя из алкилового эфира аминокислоты с помощью метода активирования эфиров и метода смешанных ангидридов, используя третбутоксикарбониламинокислоты.
Способ иллюстрируется следующим примером.
Пример.
H-Ile-Glu-Trp-OH
1. Получение Boc-Ile-OPFP.
Смесь 46,0 г (0,2 моль) Boc-Ile-ОН и 40,5 г (0,22 моль) пентафторфенола в 100 мл этилацетата охлаждали до -5oC и добавляли 45,3 г (0,22 моль) N,N-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре, дициклогексилмочевину отфильтровывали, растворители упаривали в вакууме, остаток кристаллизовали в смеси этилацетат-гексан. Выпавший осадок отфильтровывали. Выход: 71,3 г (90%).
2. Получение Boc-Ile-Glu-Trp-OH.
19,8 г (0,05 моль) Boc-Ile-OPFP растворяли в 100 мл диметилформамида и при перемешивании добавляли раствор 20 г (0,06 моль) Glu-Trp и 5,0 г (0,06 моль) NaHCO3 в воде. Раствор перемешивали в течение 20 ч при комнатной температуре, затем упаривали растворители в вакууме. К остатку добавляли 200 мл этилацетата и 200 мл 2%-ного раствора серной кислоты, перемешивали. Органический слой промывали раствором серной кислоты (2•100 мл), насыщенным раствором NaCl до pH 7, сушили над безводным сульфатом натрия, растворитель отгоняли в вакууме. Остаток кристаллизовали в системе этилацетат-гексан, осадок отфильтровывали и сушили в вакууме. Выход 20,5 г (75%).
3. Получение H-Ile-Glu-Trp-OH.
20,5 г Boc-Ile-Glu-Trp-OH растворяли в 150 мл муравьиной кислоты, перемешивали 3, 5 ч при t 45oC и растворитель упаривали в вакууме. К остатку добавляли 200 мл воды и упаривали в вакууме еще раз. Остаток заливали смесью 300 мл изопропанола, 200 мл эфира и выдерживали 10 ч. Осадок фильтровали и сушили в вакууме. Выход: 15,3 г (75%).
Очистку пептида проводили с помощью обращенно-фазной хроматографии в системе ацетонитрил- 0,1%-ным раствором трифторуксусной кислоты. Выход 13 г (85%).
В результате изучения физико-химических свойств пептида были получены следующие его характеристики:
Первичная структура - H-Ile-Glu-Trp-OH
Брутто формула - C24H30N4O4
Молекулярный вес - 446,5 Da
Внешний вид - белый с желтоватым оттенком или серый порошок.
Растворимость - растворим в воде, практически нерастворим в хлороформе.
УФ-спектр в области 250 - 300 мм несет максимум 280+ 2 мм, плечо 287+ 2 мм.
Для ряда соединений нового пептида в табл. 1 приведены значения Rf1 в системе (хлороформ-метанол - 32% уксусная кислота = 60:45:20) и Rf2 в системе (бутанол-пиридин-вода-уксусная кислота = 5:5:4:1).
Биологическая активность нового пептида изучалась на морских свинках с помощью общепринятого теста E-розеткообразования. В табл. 2 приведены сравнительные данные воздействия препаратов тимуса и заявленного пептида на процесс E-розеткообразования лимфоцитов морских свинок после обработки их трипсином.
Установлено, что в in vitro заявляемый пептид активнее известных препаратов в 103 раза.
С целью изучения безопасности пептида проводили изучение его острой токсичности. Изучение острой токсичности проводили в соответствии с Методическими рекомендациями Фармакологического комитета РФ "Требования к доклиническому изучению общетоксичного действия новых фармакологических веществ", М., 1985.
Результаты исследований показали, что при внутрибрюшинном введении 1000-кратной дозы пептид не оказывал острого токсичного действия и при этих дозах оказалось невозможным достигнуть их ЛД50.
Таким образом, новый пептид, не являясь токсичным, обладает ярко выраженными иммунорегулирующими свойствами.
| название | год | авторы | номер документа |
|---|---|---|---|
| ПЕПТИД И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1995 |
|
RU2107692C1 |
| ПЕПТИД И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ | 1994 |
|
RU2067000C1 |
| СТИМУЛЯТОР РОСТА ВОЛОС НА ОСНОВЕ ПРОИЗВОДНЫХ ПАНТОТЕНОВОЙ КИСЛОТЫ | 2005 |
|
RU2295949C1 |
| ПРОЛЕКАРСТВЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ С ВЫСОКОЙ СТЕПЕНЬЮ ПРОНИКНОВЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПЕПТИДОВ И РОДСТВЕННЫХ ПЕПТИДАМ СОЕДИНЕНИЙ | 2010 |
|
RU2627065C2 |
| Способ определения антител к Н @ V - 1 | 1988 |
|
SU1802871A3 |
| КОНЪЮГАТЫ АНТИТЕЛА И ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ДЛЯ РАЗРУШЕНИЯ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК | 2017 |
|
RU2781444C2 |
| ПРОЛЕКАРСТВЕННЫЕ КОМПОЗИЦИИ С ВЫСОКОЙ СТЕПЕНЬЮ ПРОНИКНОВЕНИЯ НА ОСНОВЕ ПЕПТИДОВ И РОДСТВЕННЫХ ПЕПТИДАМ СОЕДИНЕНИЙ | 2010 |
|
RU2767051C2 |
| IL-17A-СВЯЗЫВАЮЩИЕ ПЕПТИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В МЕДИЦИНЕ | 2019 |
|
RU2798229C2 |
| СПОСОБ ВВЕДЕНИЯ МОЛЕКУЛ GLP-1 | 2003 |
|
RU2332229C2 |
| АНАЛОГИ ИНСУЛИНОПОДОБНОГО ФАКТОРА РОСТА-1 (IGF-1), СОДЕРЖАЩИЕ АМИНОКИСЛОТНУЮ ЗАМЕНУ В ПОЛОЖЕНИИ 59 | 2010 |
|
RU2511577C2 |
Изобретение относится к медицине, а именно к способам получения биологически активных веществ, обладающих иммуннорегулирующими свойствами, и может найти применение в медицине, ветеринарии, а также в экспериментальной биохимии. В основу изобретения положена задача создания нового синтетического биологически активного пептида, обладающего иммунорегулирующим свойством, формулы:
Х - G1u-Тrp - Y
где Х - Н или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, D-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомаслянная кислота ξ - аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tyr, Phe, Trp, D-Ala, p-Leu, D-Ile, D-Val, D-NVal, D-Pro, D-Tyr, D-Phe, D-Trp, γ - аминомаслянная кислота, ξ - аминокапроновая кислота, ОН, моно- или дизамещенный амид (C1 - C3). Синтез пептида производится в растворе путем последовательного наращивания цепи с С-конца молекул, используя стратегию максимального блокирования функциональных групп, исходя из алкилового эфира аминокислоты с помощью метода активированных эфиров и метода смешанных ангидридов, используя третбутилоксикарбониламинокислоты. 2 с.п. ф-лы, 2 табл.
X - Glu - Trp - Y,
где X - H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tуr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tуr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота, -OH, моно- или дизамещенный С1 - С3-амид.
X - Glu - Trр - Y,
где X - H или Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVl, Pro, Tyr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомаслянная кислота, ξ -аминокапроновая кислота;
Y - Gly, Ala, Leu, Ile, Val, NVal, Pro, Tуr, Phe, Trр, D - Ala, D - Leu, D - Ile, D - Val, D - NVal, D - Pro, D - Tуr, D - Phe, D - Trр, γ -аминомасляная кислота, ξ -аминокапроновая кислота, -OH, моно- или дизамещенный С1 - С3-амид,
отличающийся тем, что вводят во взаимодействие в растворе алкиловый эфир аминокислоты с третбутилоксикарбонил аминокислотой, затем последовательно наращивают пептидную цепь методом активированных эфиров и методом смешанных ангидридов, последовательно присоединяют третбутилоксикарбонил аминокислоты с предварительным отщеплением на каждой стадии третбутилокси карбонильной группы путем обработки реакционной смеси муравьиной кислотой и с последующей очисткой промежуточных продуктов кристаллизацией, получают продукт формулы X - Glu - Trр - Y, который очищают обращенно-фазной хроматографией.
