ШТАММ LACTOBACILLUS ACISOPGILUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ЛАКТОБАКТЕРИИ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A61K35/74 A23C9/12 

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

Известно, что нормальная облигатная микрофлора организма человека играет важную роль для благополучного состояния его здоровья: участвует в обменных процессах, синтезирует витамины, утилизирует вредные вещества, является антагонистом по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, способствует формированию резистентности организма человека к воздействию вредных факторов.

В настоящее время в связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. В связи с этим для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, так и пищевым продуктам, содержащим в своем составе нормальную микрофлору человека, в частности лактобактерии.

В организме человека встречаются следующие виды лактобактерии: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus и другие.

Известны патенты на изобретения, основу которых составляют лактобактерии (патент №2259192, Россия, патент №2413761, Россия, патент №2412239, Россия, патент №2376366, Россия, патент №637297, Швейцария; патент №2134179, ФРГ; патент №0430642, Япония; патент №4645667, США).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов лактобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Lactobacillus acidophilus L-KC с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, сквашивающего молоко и размножающегося на искусственных питательных средах различного состава.

Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC получен от ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный № В-10932.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например: квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например: соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC может использоваться также для производства гигиенических и косметических средств, например: кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.

Кроме того, штамм Lactobacillus acidophilus L-KC может быть применен при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других аналогичных средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Lactobacillus acidophilus L-KC, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Lactobacillus acidophilus L-KC обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Культурально-морфологические свойства штамма

Клетки представляют собой гр+прямые палочки с закругленными концами, встречаются поодиночке или образуют цепочки, неподвижные, спор не образуют, каталазу не образуют, желатину не разжижают. На плотных питательных средах образуют мелкие, круглые, с ровными краями матовые колонии. Отдельно выросшие колонии на полужидкой питательной среде имеют удлиненную форму колоний.

Физико-биохимические свойства штамма

Бесспоровый, неподвижный факультативный анаэроб. Температура выращивания варьирует в широком диапазоне 34-40 градусов по Цельсию. Пигмент, каталазу, сероводород не образуют, желатину не разжижает, нитраты не восстанавливает. Образует уксусную и DL - молочную кислоты без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,2-3,4. Ферментирует глюкозу, галактозу, фруктозу, лактозу, манит, маннозу, мелецитозу, рамнозу, целлобиозу, трегалозу, вариабельно мальтозу, сорбит, не ферментирует раффинозу, арабинозу, ксилозу. Штамм сквашивает молоко к 12-14 ч культивирования.

Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (Таблица 1, 2).

Таблица 1 Антагонистическая активность штамма L. acidophilus L-KC Штамм Зона задержки роста тест-культур мм/ М±m Kl. pneumo nia №4 Kl. pneumo nia №142 E. coli M17 E. coli 0:75 Ps. aerugi nosa L. acidophilus L-KC 32±1,2 22±1.8 25±2,4 25±1,6 28±0,8

Таблица 2 Антагонистическая активность L. acidophilus к штаммам S. aureus, выделенным из разных объектов организма человека Штамм Зона подавления роста стафилококков через 24 ч после подсева, мм объекты Носовая полость Горло Кожа Моча Кишечник L. acidophilus L-KC ≥35 ≥35 ≥35 ≥35 ≥35

Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), молоке (М), продуцируя кислоты (табл.3).

Таблица 3 Накопление микробной массы (КОЕ/мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма Lactobacillus acidophilus L-KC в динамике развития ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 12 ч 24 ч 48 ч КОЕ °T КОЕ °T КОЕ °T ГМ 8,8 102 9,2 124 7,6 224 БФ 8,2 84 8,6 108 7,4 138 М 8,2 92 8,8 112 7,8 134

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-14 часам культивирования, достигая в 1 мл не менее lg 8-9 микробных клеток, продуцируя кислоты.

Таким образом, предлагаемый штамм Lactobacillus acidophilus L-KC технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией лактобактерии; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм Lactobacillus acidophilus L-KS, могут найти применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.

Способность штамма Lactobacillus acidophilus L-KC наращивать биомассу в различных питательных средах, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида Lactobacillus acidophilus, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма Lactobacillus acidophilus L-KC в составе биологически активных добавок

1 пассаж: лиофилизированный штамм Lactobacillus acidophilus L-KC в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию в течение 12-14 ч до образования роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-14 ч при 38-40 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁸/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием лактобактерий.

Пример 2. Использование штамма Lactobacillus acidophilus L-KC для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов

1 пассаж: лиофилизированный штамм Lactobacillus acidophilus L-KC в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38-40 градусах по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию в течение 12-14 ч до образования густого роста с хорошо видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-14 ч при 38-40 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерии не менее 10⁸/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых лактобактерии не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма Lactobacillus acidophilus L-KC для приготовления кисломолочного продукта

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38-40 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу лактобактерии вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38-40 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁷/мл.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Lactobacillus acidophilus L-KC из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием лактобактерии не менее 10⁸/мл.

3 пассаж: полученную биомассу штамма Lactobacillus acidophilus L-KC в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей №2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма Lactobacillus acidophilus L-KC для получения бактерийных препаратов

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы лактобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45 градусов по Цельсию и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10 живых клеток лактобактерий. Данное содержание лактобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный препарат с лактобактериями - "Лактобактерин" и является достаточным для использования полученного средства в качестве бактериального препарата.

Пример 5. Использование штамма Lactobacillus acidophilus для получения гигиенических и косметических средств

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°C до получения биомассы лактобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл.

Полученную биомассу лактобактерий штамма Lactobacillus acidophilus вводят в количестве не более 1% в состав мыла или крема.

Клиническая эффективность Lactobacillus acidophilus изучалась в составе жидкой биологически активной добавки - «Нормофлорин Л». Исследования проводились на базе гастроэнтерологического Центра ГОВПО «Мордовский государственный университет им. Н.П.Огарева». Под наблюдением находились 20 больных в возрасте от 32 до 54 лет с обострением хронического билиарнозависимого панкреатита в стадии обострения. Больные получали по 20 мл биодобавки «Нормофлорин Л» утром на фоне основного лечения. Курс лечения составил 30 дней. Результаты оценки клинической эффективности лечения пациентов показали, что включение биодобавки на основе Lactobacillus acidophilus в стандартную терапию хронического панкреатита заметно повышало результативность лечения. Значительно снижались проявления нарушений со стороны желудочно-кишечного тракта: вздутие, урчание в животе, диарея и неустойчивый стул. Наблюдалась стабилизация массы тела, исчезновение признаков трофических расстройств и гиповитаминозов. Биодобавка на основе Lactobacillus acidophilus не вызывала каких-либо побочных эффектов.

Изобретение относится к биохимии. Штамм Lactobacillus acidophilus L-КС выделен от здорового ребенка грудного возраста, активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-14 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией лактобактерии, способен сквашивать молоко. Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Это позволяет использовать штамм Lactobacillus acidophilus L-KC в производстве продукции с лактобактериями - биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, бактериальных препаратов, гигиенических и косметических средств. Штамм Lactobacillus acidophilus L-KC депонирован в ВКПМ под номером ВКПМ В-10932. Изобретение позволяет повысить биологическую активность продукции, содержащей Lactobacillus. 3 табл., 5 пр.

Штамм Lactobacillus acidophilus ВКПМ № В-10932, используемый для получения продукции, содержащей лактобактерии.