ШТАММ LACTOBACILLUS RHAMNOSUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ЛАКТОБАКТЕРИИ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A23L1/29 A61K8/99 

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности, используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

Известно, что нормальная облигатная микрофлора организма человека играет важную роль для благополучного состояния его здоровья: участвует в обменных процессах, синтезирует витамины, утилизирует вредные вещества, является антагонистом по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, способствует формированию резистентности организма человека к воздействию вредных факторов.

В настоящее время в связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. В связи с этим для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, так и пищевым продуктам, содержащим в своем составе нормальную микрофлору человека, в частности лактобактерии.

В кишечнике человека встречаются следующие виды лактобактерий:

Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus reuteri, Lactobacillus rhamnosus и другие. Известны патенты на изобретения, основу которых составляют лактобактерии (патент №2259192, Россия, патент №2270855, Россия, патент №2170023, Россия, патент №2413761, Россия, патент №2376366, Россия, патент №2141521, Россия, патент №2108999, Россия, патент №7846711, США, патент №7354757, США, патент №6004551, США, патент №6093394, США, патент №637297, Швейцария; патент №2134179, ФРГ; патент №0430642, Япония).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов лактобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Lactobacillus rhamnosus LK-25 с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, сквашивающего молоко и размножающегося на искусственных питательных средах различного состава.

Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 получен от ребенка грудного возраста, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный №В-10984.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 может использоваться также для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.

Кроме того, штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 может быть применен при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других аналогичных средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Lactobacillus rhamnosus LK-25 обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Культурально-морфологические свойства штамма.

Клетки представляют собой гр+ средней длины палочки с закругленными концами, могут складываться в длинные цепочки, сквашивают молоко. На поверхности плотных питательных сред образуют круглые колонии с ровными краями. Отдельно выросшие колонии на полужидкой питательной среде имеют удлиненную форму.

Физико-биохимические свойства штамма.

Бесспоровый, неподвижный факультативный анаэроб. Температура выращивания варьирует в широком диапазоне 34-40 градусов по Цельсию. Каталазу не образует, желатину не разжижает, сероводород не образует, нитраты не восстанавливает. Синтезирует L (+) - молочную кислоту без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,2-3,6. Ферментирует рамнозу, арабинозу, сорбит, манит, лактозу, мальтозу, сахарозу, не ферментирует раффинозу, мелибиозу.

Штамм сквашивает молоко к 12-14 ч культивирования.

Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (Таблица 1).

Таблица 1. Антагонистическая активность штамма L. rhamnosus LK-25 Штамм Зона задержки роста тест-культур мм/М±m Sh. sonnei Sh. flexneri E. coli S. aureus Pr. vulgaris L. rhamnosus LK-25 25±1,4 20±1.6 18±2,4 20±1,2 22±0,8

Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), молоке (М), продуцируя кислоты (табл.2).

Таблица 2 Накопление микробной массы (КОЕ /мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 в динамике развития ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 12 ч 24 ч 48 ч КОЕ °T КОЕ °T КОЕ °T ГМ 8,2 96 9,4 110 7,6 172 БФ 8,0 84 9,2 98 7,4 126 М 8,2 78 8,6 108 8,4 136

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-14 часам культивирования, достигая в 1 мл не менее lg 8-9 микробных клеток, продуцируя кислоты.

Таким образом, предлагаемый штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией лактобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25, могут найти применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.

Способность штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 наращивать биомассу в различных питательных средах, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида Lactobacillus acidophilus, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 в составе биологически активных добавок.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию в течение 12-14 ч до образования роста с видимой зоной аэробиоза.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-14 ч при 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁸/мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием лактобактерий.

Пример 2. Использование штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов.

1 пассаж: лиофилизированный штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38-40 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.

2 пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию в течение 12-14 ч до образования густого роста.

3 пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-14 ч при 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁸/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых лактобактерий не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 для приготовления кисломолочного продукта.

1 пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38-40 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу лактобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁷/мл.

2 пассаж: выросшую культуру штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием лактобактерий не менее 10⁸/мл.

3 пассаж: полученную биомассу штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей №2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 для получения бактерийных препаратов.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы лактобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45 градусов по Цельсию и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁷ живых клеток лактобактерий. Данное содержание лактобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный препарат с лактобактериями - "Лактобактерин" и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата - эубиотика.

Пример 5. Использование штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 для получения гигиенических и косметических средств.

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°С до получения биомассы лактобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл. Полученную биомассу лактобактерий штамма Lactobacillus rhamnosus LK-25 вводят в количестве не более 1% в состав мыла или крема.

Клиническая эффективность Lactobacillus rhamnosus изучалась в составе жидкой биологически активной добавки «Нормофлорин » на базе Научного Центра здоровья детей Российской Академии медицинских наук (НЦЗД РАМН). Под наблюдением находились 46 детей в возрасте от 3 до 12 месяцев с диагнозом - атопический дерматит легкой и средней степени. «Нормофлорин » получали на протяжении 30 дней в дозах соответствующих Инструкции к биодобавке. Контрольная группа детей «Нормофлорин » не получала. В результате проведенных исследований на фоне применения биодобавки с Lactobacillus rhamnosus по сравнению с контролем отмечалось значительное улучшение процессов пищеварения, купирование проявлений атопического дерматита, улучшение структуры кожи. Отмечалась хорошая переносимость. Нежелательных явлений зарегистрировано не было.

Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 выделен от здорового ребенка грудного возраста, активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-14 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией лактобактерий, способен сквашивать молоко. Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 депонирован в ВКПМ под номером В-10984. Это позволяет использовать штамм Lactobacillus rhamnosus LK-25 в производстве продукции с лактобактериями - бактерийных препаратов, биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, что обеспечивает нормализацию микробиоценозов организма человека, в т.ч. желудочно-кишечного и урогенитального трактов, кожных и слизистых покровов и расширяет арсенал средств коррекции микрофлоры человеческого организма. 2 табл., 5 пр.

Штамм Lactobacillus rhamnosus ВКПМ В-10984, используемый для получения продукции, содержащей лактобактерии.