ШТАММ LACTOBACILLUS HELVETICUS, ИСПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОДУКЦИИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ЛАКТОБАКТЕРИИ Российский патент 2012 года по МПК C12N1/20 A23C9/12 A23L1/29 A61K8/99 

Изобретение относится к пищевой, косметической, биотехнологической и медицинской промышленности, в частности, используется для приготовления кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов.

Известно, что нормальная индигенная микрофлора организма человека играет важную роль для благополучного состояния его здоровья: участвует в обменных процессах, синтезирует витамины, утилизирует вредные вещества, является антагонистом по отношению к условно-патогенной и патогенной микрофлоре, способствует формированию резистентности организма человека к воздействию вредных факторов.

В настоящее время в связи с неблагоприятными экологическими условиями, стрессами, длительной антибактериальной, лучевой и химиотерапией, дисбиозами, возникающими вследствие перенесенных заболеваний, увеличивается количество людей, страдающих нарушениями нормальной микрофлоры организма. В связи с этим для лечения и профилактики этих нарушений все большее внимание уделяется как препаратам, так и пищевым продуктам, содержащим в своем составе нормальную микрофлору человека, в частности лактобактерии.

В организме человека встречаются следующие виды лактобактерий: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus casei, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus salivarius, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus rhamnosus и другие. Известны изобретения на основе лактобактерий (патент №2259192, Россия, патент №2413761, Россия, патент №2412239, Россия, патент №2376366, Россия, патент №637297, Швейцария; патент №2134179, ФРГ; патент №0430642, Япония; патент №4645667, США).

Качество лечебных продуктов и препаратов во многом обусловлено свойствами штамма-продуцента - его специфической активностью и технологичностью. Большой ассортимент биологически активных и технологичных штаммов лактобактерий делает возможной разработку новых моно- и комплексных продуктов лечебного питания и бакпрепаратов, способных обеспечивать высокую колонизационную резистентность кишечника человека, восстановить его нормальную микрофлору и снизить заболеваемость различными кишечными инфекциями.

Задачей настоящего изобретения является получение штамма микроорганизмов вида Lactobacillus helveticus L-KS с высокой биологической активностью, устойчивостью к условиям внешней среды, обладающего стабилизирующим кислотообразованием во всем температурном диапазоне развития клеток, антагонистической активностью в отношении патогенной и условно-патогенной микрофлоры, сквашивающего молоко и размножающегося на искусственных питательных средах различного состава.

Штамм Lactobacillus helveticus L-KS получен из силоса, депонирован в ВКПМ, ФГУП ГосНИИгенетика, коллекционный № В-10895.

Заявляемый штамм может быть использован при производстве кисломолочной продукции, ферментированных пищевых продуктов, например квас, пиво и т.п., неферментированных пищевых продуктов, например соки, напитки и т.п., заквасок для приготовления кисломолочной продукции и биологически активных добавок к пище. Штамм Lactobacillus helveticus L-KS может использоваться также для производства гигиенических и косметических средств, например кремов, лосьонов, салфеток, мыла, присыпок, тампонов, питательных масок, гелей, женских прокладок, косметического молочка, различных пудр и т.д.

Кроме того, штамм Lactobacillus helveticus L-KS может быть применен при производстве бактериальных препаратов, в виде свечей, пероральных и других аналогичных средств.

Техническим результатом заявленного изобретения является получение штамма Lactobacillus helveticus L-KS, который может быть использован в качестве биологически активного вещества в составе кисломолочных, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, заквасок, гигиенических и косметических средств, биологически активных добавок и бактерийных препаратов. Lactobacillus helveticus L-KS обладает биологически и технологически значимыми свойствами, такими как кислотообразующая активность, способность наращивать микробную биомассу в различных питательных средах. Штамм Lactobacillus helveticus L-KS антагонистически активен по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Культурально-морфологические свойства штамма

Клетки представляют собой гр+ тонкие длинные палочки, с закругленными концами, могут складываться в цепочки, каталазу не образуют. Штамм Lactobacillus helveticus L-KS способен заквашивать молоко в течение 12-14 часов. Отдельно выросшие колонии на полужидкой питательной среде имеют удлиненную форму колоний.

Физико-биохимические свойства штамма

Бесспоровый неподвижный факультативный анаэроб. Температура выращивания варьирует в широком диапазоне 34-40 градусов по Цельсию. Каталазу не образует, желатину не разжижает, сероводород не образует, нитраты не восстанавливает. Продуцирует уксусную и L (+) молочную кислоты, без образования газа, закисляя среду выращивания до рН 4,2-3,8. Ферментирует глюкозу, галактозу, фруктозу, лактозу, манит, маннозу, мелецитозу, рамнозу, целлобиозу, трегалозу, не ферментирует раффинозу, арабинозу, ксилозу. Штамм сквашивает молоко к 12-14 ч культивирования.

Штамм Lactobacillus helveticus L-KS обладает антагонистической активностью по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре (таблица 1).

Таблица 1 Антагонистическая активность штамма L. helveticus L-KS Штамм Зона задержки роста тест-культур, мм/М±m Sh.sonnei Sh.flexneri E.coli S.aureus Pr.vulgaris L. helveticus L-KS 20±1,4 22±1.6 18±2,0 25±1,2 20±0,6

Штамм активно наращивает микробную массу при росте на гидролизатно-молочной среде (ГМ), Бифидум-среде (БФ), молоке (М), продуцируя кислоты (таблица 2).

Таблица 2 Накопление микробной массы (КОЕ /мл lg 10) и активность кислотообразования (в градусах Тернера) штамма Lactobacillus helveticus L-KS в динамике развития ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ВРЕМЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ
БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ 12 ч 24 ч 48 ч КОЕ °T КОЕ °T КОЕ °T ГМ 8,2 90 9,0 118 7,4 212 БФ 7,8 84 9,2 102 7,2 158 М 8,4 82 8,6 106 7,6 164

Штамм максимально накапливает микробную массу к 12-24 часам культивирования, достигая в 1 мл lg 8-9 микробных клеток, продуцируя кислоты.

Таким образом, предлагаемый штамм Lactobacillus helveticus L-KS технологичен, поскольку размножается в различных питательных средах с накоплением производственной биомассы с высокой концентрацией бифидобактерий; обладает кислотообразующей активностью, а также антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам.

Кисломолочные, ферментированные, неферментированные пищевые продукты, гигиенические, косметические средства, биологически активные добавки и бактерийные препараты, содержащие штамм Lactobacillus helveticus L-KS, могут найти применение в пищевой, медицинской, биотехнологической и косметической промышленности.

Способность штамма Lactobacillus helveticus L-KS наращивать биомассу в различных питательных средах, кислотообразующая активность, антагонистическая активность по отношению к патогенной и условно-патогенной микрофлоре, а также другие полезные для организма человека свойства, характерные для вида В. helveticus, делают возможным использование штамма в составе различных корригирующих средств лечебно-профилактического назначения.

Пример 1. Использование штамма Lactobacillus helveticus L-KS в составе биологически активных добавок

1 Пассаж: лиофилизированный штамм Lactobacillus helveticus L-KS в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.

2 Пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию в течение 12-14 ч до образования роста с видимой зоной аэробиоза.

3 Пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-14 ч при 38-40 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁸ мл.

В результате получают биологически активную добавку, которая представляет собой жидкий концентрат с высоким, не менее 10⁸/мл, содержанием лактобактерий.

Пример 2. Использование штамма Lactobacillus helveticus L-KS для приготовления ферментированных и неферментированных пищевых продуктов

1 Пассаж: лиофилизированный штамм Lactobacillus helveticus L-KS в количестве 0.1 г сухой биомассы вносят в пробирки с питательной средой и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38-40 градусах по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях.

2 Пассаж: выросшую культуру из 10^-7-9 разведений в объеме до 10% вносят в питательную среду и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию в течение 12-14 ч до образования густого роста.

3 Пассаж: полученную биомассу в количестве до 10% объема вносят в среду накопления и культивируют 12-14 ч при 38-40 градусах по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁸/мл.

Получение ферментированного или неферментированного пищевого продукта: выросшую биомассу вносят в пищевое сырье (молоко, соки, пиво, квас и пр.) в количестве до 10% от объема, перемешивают и разливают в емкости. В результате получают продукт с концентрацией живых лактобактерий не менее 10⁶/мл.

Пример 3. Использование штамма Lactobacillus helveticus L-KS для приготовления кисломолочного продукта

1 Пассаж: лиофилизированный штамм вносят в среду культивирования и титруют методом десятикратных разведений до 10^-9. Инкубируют при 38-40 градусах по Цельсию до образования видимого роста в последних разведениях. Или сухую лиофилизированную биомассу лактобактерий вносят в количестве 1-2 дозы в пробирку с 30 мл питательной среды. Культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием живых лактобактерий не менее 10⁷/мл.

2 Пассаж: выросшую культуру штамма Lactobacillus helveticus L-KS из последних разведений или из пробирки с выросшей биомассой вносят в среду накопления объемом до 10% и культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы с содержанием лактобактерий не менее 10⁸/мл.

3 Пассаж: полученную биомассу штамма Lactobacillus helveticus L-KS в объеме до 10% вносят в стерильное молоко, культивируют до образования сгустка (кисломолочный продукт). Количество пассажей №2 может быть увеличено в зависимости от объема производства.

Пример 4. Использование штамма Lactobacillus helveticus L-KS для получения бактерийных препаратов

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38-40 градусов по Цельсию до получения биомассы лактобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл. К полученной биомассе добавляют защитные среды высушивания (сахарозо-желатиновая среда, обезжиренное молоко). Полученную суспензию разливают в ампулы, флаконы и другие емкости, замораживают при температуре минус 35-45 градусов по Цельсию и лиофилизируют из замороженного состояния в вакуум-сушильных аппаратах. Полученный препарат содержит не менее 10⁷ живых клеток лактобактерий. Данное содержание лактобактерий согласуется с научно-технической документацией на аналогичный препарат с лактобактериями - "Лактобактерин" - и является достаточным для использования полученного средства в качестве препарата-пробиотика.

Пример 5. Использование штамма Lactobacillus helveticus для получения гигиенических и косметических средств

Культуру штамма 1-го или 2-го пассажа (пример 1) вносят в питательную среду, культивируют при температуре 38±1°С до получения биомассы лактобактерий с содержанием живых клеток не менее 10⁸ в 1 мл.

Полученную биомассу лактобактерий штамма Lactobacillus helveticus вводят в количестве не более 1% в состав мыла или крема.

Штамм Lactobacillus helveticus L-KS выделен из силоса, активно размножается в питательной среде с накоплением производственной биомассы в короткие, 12-14 ч, сроки культивирования с высокой концентрацией лактобактерий, способен сквашивать молоко. Штамм Lactobacillus helveticus L-KS обладает кислотообразующей активностью, антагонистической активностью в отношении к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам. Штамм Lactobacillus helveticus L-KS депонирован в ВКПМ под номером В-10895. Это позволяет использовать штамм Lactobacillus helveticus L-KS в производстве продукции с лактобактериями - биологически активных добавок к пище, ферментированных и неферментированных пищевых продуктов, бактериальных препаратов, гигиенических и косметических средств, благодаря высоким биологически и технологически значимым свойствам штамма. 2 табл., 5 пр.

Штамм Lactobacillus helveticus ВКПМ В-10895, используемый для получения продукции, содержащей лактобактерии.