СПОСОБ ИЗГОТОВЛЕНИЯ ПОДДЕРЖИВАЮЩЕЙ СТРУКТУРЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ КРИСТАЛЛИЧЕСКУЮ ЦЕЛЛЮЛОЗУ, ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ КЛЕТОК Российский патент 2012 года по МПК C12N5/07 C08L1/00 D01F2/00 

Область техники, к которой относится изобретение

Изобретение относится к способу культивирования живых клеток и к применению структуры, содержащей кристаллическую целлюлозу. Изобретение, кроме того, относится к способу приготовления поддерживающей структуры из целлюлозы для культивирования живых клеток согласно пункту 1, к поддерживающим структурам для культивирования живых клеток и к полой форме для изготовления поддерживающей структуры.

Уровень техники

Часто возникает потребность в культивировании живых клеток in vitro, например из клеток, которые были взяты из какого-либо организма, с целью имплантирования культивированных клеток в тот же организм и, таким образом, получения или восстановления функционирования ткани. Культивирование клеток или клеточных тканей in vitro часто называют «клеточной инженерией». Тканями преимущественно является мягкая ткань, например кожа, мышца или жировая ткань, в отличие от твердой ткани или костной ткани.

Известно, что живые ткани культивируют в емкостях для культивирования, например в сосудах или чашках для культивирования, которые, будучи покрыты питательной средой, образуют однослойный (двухмерный) клеточный слой на подложке емкости для культивирования. Однако культивируемые таким образом клетки могут отличаться по своим свойствам от клеток того же типа, которые присутствуют in vivo в какой-либо ткани в организме, что может существенным образом ухудшить их диагностическую или терапевтическую ценность.

Живая ткань состоит обычно из большого числа специализированных клеток, которые влияют одна на другую с помощью сигнальных молекул и, как полагают, клетки ориентируются внутри градиентов концентраций низкомолекулярных веществ и способны вести себя специфическим образом. В данном случае используется также выражение «позиционная информация». Между клетками тканей имеются поддерживающие структуры, называемые межклеточным матриксом, которые состоят из макромолекул, высвобождаемых клетками, и стабилизируют клетки в соответствующих им положениях. Если межклеточный матрикс разрушается и клетки перемешиваются, нормальные дифференцированные клетки более уже не способны переориентироваться и восстановить утраченные структуры. Было, однако, установлено, что такие клетки могут продолжить выполнять свою нормальную функцию, если их вернуть в их исходное пространственное взаимоотношение с помощью подходящих прилегающих к ним клеток.

В одном из известных способов делается попытка воссоздания межклеточного матрикса путем культивирования клеток «трехмерным» образом внутри специальных поддерживающих структур, известных также как каркасы. Каркасы являются, по крайней мере, пенообразными пористыми структурами, имеющими большую внутреннюю площадь поверхности.

Каркасы из биодеградируемых («рассасывающихся») материалов известны. Имеются к тому же сведения, что они позволяют клеткам, растущим в этих каркасах, постепенно замещать каркасы своим собственным межклеточным матриксом.

В опубликованной патентной заявке US 2005/0063939 Al описан пригодный для тканевой инженерии каркас, который включает в себя биодеградируемый эластомерный полимер, содержащий лимонную кислоту. В описании европейского патента ЕР 1053757 В1 описан несущий материал из коллагена (желатины). В международной опубликованной патентной заявке WO 2006/099137 A1 описан каркас для лечения ран, содержащий поперечно-сшитый фибрин и/или альбумин. В международной опубликованной патентной заявке WO 2002/062961 раскрыто получение каркасов из пептидов, которые самоорганизуются в более крупные единицы («самособирающиеся» пептиды) для инкапсулирования клеток.

Возможным недостатком использования рассасывающихся материалов является то, что они разрушаются слишком быстро и это не позволяет им обеспечивать необходимую механическую стабильность. В частности, может возникать опасность того, что сосуды, изготовляемые с помощью рассасывающихся каркасов, не будут надежно переносить кровь. Еще одним возможным недостатком является то, что остается остаточный материал, который инициирует реакции на чужеродное тело или реакции отторжения. По этим и другим причинам были также предложены каркасы из нерассасывающихся материалов.

В описании WO 03/070084 описаны трубчатый каркас для регенерации кровяных сосудов из нерассасывающихся волокон, таких как нейлон, SILASTIC™, силикон, полиуретан и полиэстер. В международной опубликованной патентной заявке WO 2006/096791 раскрыто использование многочисленных доступных в настоящее время рассасывающихся и нерассасывающихся синтетических полимеров с целью получения так называемых нановолокон, из которых должны были быть изготовлены каркасы с покрытием. Недостатком нерассасывающихся материалов является то, что они вызывают, по крайней мере, слабые тканевые реакции. Кроме того, существует возможность того, что материалы подвергнутся какому-либо воздействию и будут разрушены в случае продленного времени имплантации в организме.

При культивировании клеток или тканей in vitro, может оказаться необходимым принять меры для доставки к клеткам питательных веществ и/или кислорода. В европейской опубликованной патентной заявке ЕР 1230939 Al описан первичный васкуляризованный тканевый матрикс, приготовленный из кусков желудочно-кишечного тракта свиньи. При приготовлении следует убедиться в присутствии целого сосудистого ответвления с входящей артерией и отходящей веной. После удаления животных клеток с помощью так называемых способов ацеллюларизации (удаления клеток) полученный матрикс должен быть залит кровью и заселен клетками человека. Как сообщается, этим путем можно доставлять достаточно питательных веществ, минералов и кислорода даже к относительно большому числу клеток и слоям большей толщины. Однако возможным недостатком является то, используемый матрикс содержит значительные количества животного белка и других потенциально иммуногенных молекул. Еще одним возможным недостатком является то, что животное происхождение матрикса затрудняет стандартизацию способа.

В международной опубликованной патентной заявке WO 2006/042287 А2 раскрыты многослойный каркас с микроканалами для применения в тканевой инженерии, который покрыт бактериальной целлюлозой. Однако описанный в заявке каркас оптимизирован главным образом для культивирования хрящевой ткани и имеет лишь ограниченную пригодность для имплантации. В частности, неясна роль покрытия с бактериальной целлюлозой, так как указанная процедура не приводит к равномерному слою и не указано, каким образом слой должен прилипать к подложке.

В международной опубликованной патентной заявке WO 2001/61026 A1 раскрыт способ получения полого тела из микрокристаллической целлюлозы бактериального происхождения, которое (полое тело), как сообщается, может быть имплантировано в сонную артерию крысы без каких-либо неблагоприятных эффектов типа реакции на чужеродное тело или тромбоз. Однако описанный в заявке способ пригоден лишь для получения полого тела длиной порядка 20 мм.

Раскрытие изобретения

Проблема, решающая изобретением

Цель изобретения состоит в создании улучшенного способа культивирования живых клеток. Дополнительной целью, лежащей в основе изобретения, является предложение нового применения структуры, содержащей кристаллическую целлюлозу. Еще одной целью, лежащей в основе изобретения, является создание улучшенного способа получения поддерживающей структуры, содержащей кристаллическую целлюлозу, улучшенной поддерживающей структуры для культивирования живых клеток и улучшенной полой формы для изготовления улучшенной поддерживающей структуры, содержащей кристаллическую целлюлозу.

Решение согласно изобретению

Для достижения цели в изобретении предлагаются способ культивирования живых клеток, использование структуры, содержащей кристаллическую целлюлозу, способ получения поддерживающей структуры, обладающий признаками пункта 1, поддерживающие структуры, и полая форма.

Поддерживающая структура согласно изобретению может быть успешно использована при культивировании клеток в качестве замены межклеточного матрикса.

В одном из аспектов настоящего изобретения при изготовлении поддерживающих структур для культивирования живых клеток используются полезные свойства кристаллической целлюлозы, преимущественно микрокристаллической целлюлозы в природной форме, такой как микрокристаллическая целлюлоза, продуцируемая бактерией Acetobacter xylinum.

Одним из достижимых преимуществ изобретения является то, что поддерживающие структуры являются нетоксичными и неиммуногенными. В частности, имеется возможность того, чтобы поддерживающие структуры не вызывали реакцию чужеродного тела, или иммунную реакцию, или же вызывали лишь ослабленную реакцию чужеродного тела, или иммунную реакцию даже после имплантации в организм, например в организм человека.

Еще одним достижимым преимуществом изобретения является то, что поддерживающие структуры не являются рассасывающимися. Благодаря этому при культивировании клеток или даже в течение продолжительного периода после него обеспечивается, в частности, более высокая механическая устойчивость.

Одним из достижимых преимуществ изобретения является то, что поддерживающая структура, хотя и не являясь рассасывающейся, не влияет или влияет в уменьшенной степени на культивирование клеток как in vitro, так и in vivo, в частности, потому что структура с низким содержанием целлюлозы уже может обеспечить высокую стабильность, а остальная часть поддерживающей структуры может в основном состоять из воды. В частности, это может обеспечить замену сигнальных молекул и/или нарастание градиентов сигнальных молекул, что является важным для культивирования клеток. Это может также способствовать обеспечению того, чтобы поддерживающая структура не представляла или представляла лишь слабое препятствие для образования или присоединения межклеточного матрикса. Дополнительным достижимым преимуществом является то, что поддерживающая структура обладает механическими свойствами, близкими к механическим свойствам ткани-мишени. Изобретение создает возможность того, чтобы культивируемая с поддерживающей структурой ткань не отличалась или отличалась в меньшей степени по своим главным свойствам от ткани, в которой целлюлоза отсутствует.

Одним из достижимых преимуществ изобретения является то, что поддерживающая структура может быть изготовлена с помощью какое-нибудь формы. В частности, та или иная структура, предназначенная для какой-либо специфической цели, может быть спланирована или промоделирована на основе природных примеров.

В одном из аспектов способа согласно изобретению для приготовления поддерживающей структуры и полой формы согласно изобретению используется принцип «разрушаемой формы».

Одной из достижимых целей способа согласно изобретению для приготовления поддерживающей структуры и полой формы согласно изобретению является то, что внутренние выточки более не представляют помех при извлечении изделия из формы. Соответственно, можно использовать без затруднений, в частности, даже полые формы сложного профиля. Достижимым преимуществом, в частности, является то, что даже поддерживающие структуры сложного профиля, имеющие, в частности, внутренние выточки, можно изготавливать более простым путем.

Изобретение можно применять, например, для культивирования клеток разных типов in vitro, по отдельности или вместе, таким образом, чтобы из них образовывалась более крупная тканевая структура, которую можно изучать в течение продолжительных периодов времени. Способ согласно изобретению и поддерживающие структуры согласно изобретению пригодны, в частности, для трехмерного культивирования клеток, например клеток млекопитающих. Способ культивирования и поддерживающие структуры можно также использовать для приготовления и/или регенерации живой ткани, в частности органов или тканей человека. Изобретение может быть использовано для воссоздания внеклеточных структур природной ткани, которые после этого заселяют типами клеток, которые содержатся в этих тканях в естественных условиях.

После культивирования in vitro клетки или ткани можно имплантировать, например, в живой организм, в частности млекопитающему, в частности человеку. Однако допустимо также имплантировать поддерживающую структуру без ее предварительного заселения с целью того, чтобы предоставить ей возможность заселения in vivo. Поддерживающая структура может инициировать самоорганизацию клеток in vivo с образованием определенной структуры. Этим путем изобретение впервые предлагает возможность специфического и стабильного реструктурирования (мягкой) ткани in vivo.

Композиция и дальнейшая разработка решения согласно изобретению

Поддерживающая структура преимущественно содержит кристаллическую целлюлозу. Поддерживающая структура преимущественно состоит из воды и кристаллической целлюлозы, в частности преимущественно из микрокристаллической целлюлозы, так, как она образуется с помощью бактерии Acetobacter xylinum. Предпочтительный материал содержит менее 10% кристаллической целлюлозы. В предпочтительном материале вода частично связана с микрокристаллической целлюлозой с различной степенью прочности. Кристаллическая целлюлоза в экспериментах оказалась в особенности совместимой с тканями. Образующими целлюлозу организмами преимущественно являются бактерии, особенно предпочтительно бактерии штамма Acetobacter xylinum. Допустимо также использование и других образующих целлюлозу организмов, таких, например, как подходящие штаммы Agrobacterium, Rhizobium, Sarcina, Pseudomonas, Achromobacter, Aerobacter и Zooglea. Поскольку гены синтезирующих целлюлозу ферментных комплексов с Acetobacter xylinum известны, их также можно вводить в другие микроорганизмы, такие, например, как Escherichia coli, используя для этого известные молекулярно-биологические способы, с помощью которых названные микроорганизмы также могли бы синтезировать целлюлозу. Допустимы, однако, также и поддерживающие структуры из комбинаций кристаллической целлюлозы с другими материалами, например с синтетическими рассасывающимися и нерассасывающимися полимерами, такими, например, как полимеры, раскрытые в международной опубликованной патентной заявке WO 2006/096791. Все представляющее интерес для настоящей заявки содержание описания указанной заявки включено в настоящее раскрытие в качестве ссылочного материала. Допустимо также, чтобы поддерживающая структура содержала коллаген, как это раскрыто, например, в описании европейского патента ЕР 1053757, фибрин и/или альбумин, как раскрыто в международной опубликованной патентной заявке WO 2006/099137 A1, или ацеллюризованную природную ткань, как, например, раскрыто в описании европейского патента ЕР 1230930 A1. Все представляющее интерес для настоящей заявки содержание описания указанных заявок включено в настоящее раскрытие в качестве ссылочного материала.

Особо предпочтительная поддерживающая структура имеет внутри себя множество отделенных одна от другой пустот. Пустоты могут быть, например, глобулярными и могут образовывать трубчатые каналы, особо предпочтительно спиральные каналы. Особенно предпочтительно, чтобы пустоты были соединены с внешним окружением поддерживающей структуры отверстиями, например трубчатыми каналами. Достижимым преимуществом данного варианта осуществления изобретения является то, что культивируемые клетки или предшественники культивируемых клеток способны проникать в пустоты снаружи через отверстия. Предполагается также, что какая-либо среда, например питательная среда или кровь, может протекать через пустоты, в которых оседают клетки, для доставки клеткам питательных веществ и кислорода или оказывать влияние на развитие клеток при своем протекании. Отверстия могут также использоваться для обеспечения прохода наружу клеточного продукта, например кератина.

Предпочтительная поддерживающая структура содержит в себе, по меньшей мере, одну трубчатую полость, которая разветвляется в, по меньшей мере, одном месте. Особенно предпочтительно, когда, по крайней мере, некоторые из ответвлений воссоединяются в каком-либо другом месте. Особенно предпочтительно, если поддерживающая структура имеет систему ответвляющихся и воссоединяющихся трубок подобно сосудистой системе. Полость преимущественно соединена с окружением поддерживающей структуры в, по меньшей мере, двух местах посредством отверстий. Особенно предпочтительно, если позиции, где полость имеет ответвления, и позиции, где эти ответвления воссоединяются, расположены между двумя позициями, в которых полость соединена с внешним окружением поддерживающей структуры посредством отверстий. Одним из достижимых преимуществ настоящего варианта осуществления изобретения является то, что жидкости, например питательные растворы или кровь, могут пропускаться через ответвления, и при этом жидкость вводится у первой из двух позиций и выводится у второй.

В способе согласно изобретению для приготовления поддерживающей структуры из целлюлозы последней преимущественно является кристаллическая целлюлоза. Образующими целлюлозу организмами преимущественно являются бактерии, в частности преимущественно бактерии штамма Acetobacter xylinum. Для культивирования Acetobacter xylinum описаны различные питательные среды. Подходящей и часто используемой средой является среда Schramm и Hestrin, которая описана в Biochemical Journal 58 (1954), pp.345-352. Все содержание описания указанной статьи, представляющее интерес для настоящей заявки, включено в настоящее раскрытие в качестве ссылочного материала. Недостатком указанной среды может быть то, что она не определена точно, поскольку она содержит дрожжевой экстракт и пептон.

Для осуществления настоящего изобретения предпочтительна полностью синтетическая среда, как, например, среда, описанная Forng et al. в Applied and Environmental Biology of 1989, Vol.55, No.5, p.1317-1319. Все содержание описания указанной статьи, представляющее интерес для настоящей заявки, включено в настоящее раскрытие в качестве ссылочного материала. Недостатком указанной среды может быть несколько более медленный рост бактерий.

Для осуществления изобретения допустимо также использование так называемого чая гриба комбуча. Наряду с Acetobacter xylinum эта культура содержит много других живущих в симбиозе организмов, таких как дрожжи и бактерии, и ее поддерживающая среда содержит только черный чай и сахарозу (100 г/л).

В способе производства согласно изобретению может иметь место необратимая деформация, например в результате пластической деформации, потери формы при разрушении или в результате, по крайней мере, частичного перехода в жидкое или газообразное агрегативное состояние, преимущественно путем плавления или испарения. Однако допустимы также варианты осуществления, в которых деформация происходит под действием химической обработки, например растворителем, или механической обработки, например ультразвуком. Часть полой формы, которая необратимо деформируется на стадии извлечении из формы, располагается перед деформацией вплотную к целлюлозе, образующейся в полой форме. Стадию извлечения из полой формы преимущественно проводят после полного заполнения полой формы поддерживающей структурой.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления способа производства согласно изобретению полая форма состоит из наружной формы и, по меньшей мере, одной сердцевины формы. Одним из достижимых преимуществ этого варианта осуществления изобретения является то, что при использовании полой формы может быть образована поддерживающая структура с пустотами. Сердцевина формы является преимущественно частью полой формы, которая необратимо деформируется при извлечении из формы. Одним из аспектов данного варианта осуществления изобретения является то, что в нем не используется известная из существующего уровня техники концепция сердцевины формы, которая удаляется при извлечении из формы. Полая форма может также содержать в себе более одной сердцевины формы. В этом случае множество сердцевин формы, преимущественно, по меньшей мере, одна сердцевина формы и, особенно предпочтительно, все сердцевины формы необратимо деформируются на стадии извлечения из формы. При извлечении из формы на сердцевину формы или, по крайней мере, на часть ее преимущественно воздействуют теплом. Стадия извлечения из формы преимущественно включает в себя, по крайней мере, частичное расплавление сердцевины формы. Расплавленной может быть вся сердцевина формы целиком или лишь отдельные ее части. Например, приемлемо, чтобы сердцевина формы включала в себя одно или более неплавких составляющих, которые связаны и преимущественно удерживаются вместе с помощью одного или более плавких составляющих.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения температура плавления той части полой формы, которая плавится на стадии извлечения из формы, выше 28°С, предпочтительнее равна или выше 30°С и, особенно предпочтительно, равна или выше 60°С. Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что сердцевина формы остается устойчивой во время культивирования целлюлозы. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения температура плавления той части полой формы, которая плавится на стадии извлечения из формы, ниже 100°С, предпочтительнее ниже 80°С и, особенно предпочтительно, равна 62°С. Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что целлюлозная поддерживающая структура не повреждается при плавлении сердцевины формы.

В процессе операции извлечения из полой формы сердцевина формы в значительной степени удаляется, в частности преимущественно в количественном смысле, т.е. без остатка.

Часть сердцевины формы, которая плавится при извлечении из формы, является в основном гидрофобной. Одним из аспектов данного варианта осуществления изобретения является использование в нем того факта, что гидрофобный материал отталкивается гидрофильной поверхностью целлюлозной подложки. Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что полая форма может извлекаться в существенной степени количественно.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения часть сердцевины формы, которая плавится при извлечении из формы, содержит термопластичный материал, особенно предпочтительно термопластичный воск и/или полимерный материал. Одним из достижимых преимуществ сердцевин форм из термопластичных материалов является то, что они могут изготовляться путем отливки.

Еще одним преимуществом воска и/или полимерных материалов является то, что с целью облегчения прилипания синтетической целлюлозы их поверхности могут быть выровнены простой полировкой.

Один из предпочтительных восковых и/или полимерных материалов содержит поливиниловый спирт (PVA), предпочтительно в количестве более 1% и, особенно предпочтительно, более 50%. В одном из особо предпочтительных вариантов осуществления изобретения восковый и/или полимерный материал в значительной степени полностью состоит из поливинилового спирта. Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что имеется возможность исключить токсичные остатки после выемки из полой формы, поскольку поливиниловый спирт нетоксичен.

Другим предпочтительным восковым и/или полимерным материалом является известный в стоматологии так называемый «летний воск». Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что этот материал настолько механически стоек, что сохраняются даже филигранные структуры. Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что имеется возможность исключить токсичные остатки после выемки из полой формы, поскольку летний воск нетоксичен.

В одном из предпочтительных способов производства сердцевина формы имеет, по меньшей мере, одну жилу, которая имеет ответвление в, по меньшей мере, одном месте. По крайней мере некоторые из ответвлений преимущественно воссоединяются в каком-либо другом месте. Одним из достижимых преимуществ данного варианта осуществления изобретения является то, что в поддерживающей структуре может создаваться система ответвления и воссоединяются трубки подобно сосудистой системе. Сердцевина формы состоит преимущественно из известных в стоматологии восковых волокон, предпочтительно из летнего воска. Волокна преимущественно сплавлены одна с другой.

Предпочтительная поддерживающая структура, приготовленная с помощью способа производства, имеет, по меньшей мере, одно отверстие, через которое деформированная, преимущественно расплавленная сердцевина или ее остатки могут выйти из поддерживающей структуры наружу. Предпочтительная поддерживающая структура имеет внутри себя, по меньшей мере, одну выточку, преимущественно такую, при наличии которой жесткая сердцевина формы, которая полностью заполняет внутреннюю часть полой формы, не может быть удалена из полого тела без деформирования сердцевины формы. Поддерживающая структура преимущественно имеет внутри себя, по меньшей мере, одну полость, которая доступна снаружи только при прохождении через узкий участок, поперечное сечение которого уже поперечного сечения полости.

Краткое описание чертежей

Далее изобретение описывается более детально со ссылками на диаграммные чертежи и варианты осуществления. Из этих чертежей:

фиг.1 - первый вид в перспективе в диаграммной форме первого варианта осуществления сердцевины формы для способа производства согласно изобретению;

фиг.2 - второй вид в перспективе в диаграммной форме первого варианта осуществления сердцевины формы для способа производства согласно изобретению;

фиг.3 - вид в перспективе в диаграммной форме второго варианта осуществления сердцевины формы для способа производства согласно изобретению;

фиг.4 - вид в поперечном сечении в диаграммной форме одной из компоновок для осуществления способа производства согласно изобретению;

фиг.5 - вид в перспективе в диаграммной форме одного из вариантов осуществления поддерживающей структуры согласно изобретению.

Осуществление изобретения

Описание со ссылкой на один из вариантов осуществления

Фиг.1 и 2 показывают одно из расположений (1) для изготовления целлюлозной поддерживающей структуры из подходящих сердцевин 2 и 3 формы, выполненных из спирально закрученных восковых волокон, например из летнего воска. Волокна расположены в двух плоскостях, и при этом в каждой плоскости волокна ориентированы, по существу, параллельно одна другой. Восковые волокна 2 в первой плоскости ориентированы под углом, например, 90° относительно волокон 3 во второй плоскости. Две плоскости лежат непосредственно одна над другой и изображены со сдвигом на фиг.1 только с целью ясности. Волокна 2 первой плоскости соприкасаются в некоторых местах с волокнами 3 второй плоскости. Спиральные восковые волокна могут быть изготовлены, например, с помощью экструзии. Расположение 1 является подходящим для изготовления поддерживающей структуры из целлюлозы, которая имеет сферические пустоты и при этом некоторые из сферических пустот соединены с другими через отверстия.

Второй вариант осуществления сердцевины формы для способа согласно изобретению для изготовления поддерживающей структуры показан на фиг.3. Глобулярные восковые капли 4, например, с диаметром приблизительно от 50 до 100 µм, подвешены на тонких нитях, например на восковых нитях или стальных проволоках 5, которые закреплены на подложке 6, например на пластине 6. Такое расположение является подходящим для изготовления поддерживающей структуры, имеющей множество глобулярных пустот, которые образуют восковые капли 4, и при этом пустоты соединены с внешним окружением поддерживающей структуры узкими каналами, которые образуются проволоками 5.

Один из вариантов осуществления способа согласно изобретению для приготовления поддерживающей структуры показан в диаграммной форме на фиг.4. Стерильную емкость 7 заполняют стерильным питательным раствором 8, состоящим из 5 г глюкозы, 5 г дрожжевого экстракта, 5 г бактопептона, 2,7 г фосфата натрия и 1,15 г моногидрата лимонной кислоты, рН 6,0, и засевают трехдневной предварительной культурой Acetobacter xylinum (например, Gluconacetobacter xylinus, DSM No. 2325, DSZM Brunswick). После того как через 7 суток на поверхности жидкости образуется слой целлюлозы толщиной примерно 3 мм, слой 9 покрывают служащей в качестве подложки сеткой 10 из тефлона (расширенный политетрафторэтилен (ePTFE), например, зубная нить GLIDE, W.L. Gore and Associates Inc.), которая закреплена в стеклянной раме, удерживаемой стеклянными опорами. На поверхность 9 целлюлозы, поддерживаемой сеткой 10, помещают полую форму, имеющую несколько плоскостей с сердцевинами 11, 12, 13 формы из летнего воска, и проводят культивирование при 28°С в инкубаторе.

Чтобы заселить полую форму бактериями и полностью заполнить ее целлюлозой, культивирование обычно продолжают от 2 до 3 недель. В течение этого времени в случае необходимости, связанной с расходом или испарением среды 8, следует обеспечивать пополнение этой среды. После завершения заполнения полой формы целлюлозой поддерживающую структуру вынимают и нагревают до примерно 65°С для того, чтобы сердцевины формы расплавилась, и остались пустоты в поддерживающей структуре. Одновременно нагрев служит для стерилизации поддерживающей структуры.

На фиг.5 приведен пример поддерживающей структуры 14, которая была приготовлена с помощью сердцевины формы, образованной восковыми волокнами, которые были сплавлены между собой с образованием сети 15 ответвляющихся и воссоединяющихся нитей. Использованными восковыми волокнами являются волокна из летнего воска, которые имеются в продаже в области стоматологии. После того как целлюлоза полностью заполнила полую форму с переплетенными между собой восковыми волокнами 15, поддерживающую структуру вынимают и нагревают до 65°С для того, чтобы расплавить переплетенные восковые волокна. Воск, таким образом, может быть удален из поддерживающей структуры 14, по существу, полностью. При этом остается полость из ответвляющихся и воссоединяющихся трубок, подобная сосудистой системе. Полость соединена с наружным окружением поддерживающей структуры в двух местах с помощью отверстий. Положения, в которых полость разветвляется, и положения, в которых ответвления воссоединяются, расположены между положениями, в которых полость соединена с внешним окружением поддерживающей структуры 14 отверстиями.

Изобретение относится к области биотехнологии, конкретно к поддерживающим структурам, содержащим кристаллическую целлюлозу, для культивирования клеток, и может быть использовано в медицине. Способ изготовления поддерживающей структуры (14) включает изготовление полой формы, культивирование образующих целлюлозу организмов во внутреннем пространстве, образованном полой формой, с целью обеспечения роста поддерживающей структуры во внутреннем пространстве, и извлечение из полой формы. Полая форма включает в себя внешнюю форму и, по меньшей мере, одну сердцевину (2, 3, 4, 5) и, по крайней мере, часть (2, 3, 4) полой формы необратимо деформируется на стадии извлечения из полой формы. Изобретение позволяет упростить способ получения поддерживающей структуры из целлюлозы. 11 з.п. ф-лы, 5 ил.

1. Способ изготовления поддерживающей структуры (14), содержащей кристаллическую целлюлозу, для культивирования клеток, где способ включает следующие стадии:
- изготовление полой формы,
- культивирование образующих целлюлозу организмов во внутреннем пространстве, образованном полой формой, с целью обеспечения роста поддерживающей структуры во внутреннем пространстве,
- извлечение из полой формы;
где полая форма включает в себя внешнюю форму и, по меньшей мере, одну сердцевину (2, 3, 4, 5) и
по крайней мере, часть (2, 3, 4) полой формы необратимо деформируется на стадии извлечения из полой формы.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что, по крайней мере, часть сердцевины (2, 3, 4, 5) формы на стадии извлечения из формы необратимо деформируется.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что сердцевину (2, 3, 4, 5) формы, по существу, удаляют на стадии извлечения из полой формы.

4. Способ по п.2, отличающийся тем, что стадии извлечения из формы включает, по крайней мере, частичное расплавление сердцевины (2, 3, 4, 5) формы.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что температура плавления части (2, 3, 4) сердцевины (2, 3, 4, 5) формы, которую расплавляют на стадии извлечения из формы, превышает 28°С.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что часть (2, 3, 4) сердцевины (2, 3, 4, 5) формы, которую расплавляют на стадии извлечения из формы, является, по существу, гидрофобной.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что часть (2, 3, 4) сердцевины (2, 3, 4, 5) формы, которую расплавляют на стадии извлечения из формы, содержит термопластичный воск и/или полимерный материал.

8. Способ по п.1, отличающийся тем, что сердцевина (2, 3, 4, 5) формы имеет, по меньшей мере, одну нить, которая разветвляется в, по меньшей мере, одном месте.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что поддерживающая структура имеет:
по меньшей мере, одну трубчатую полость (15), которая разветвляется, по меньшей мере, в одном месте, причем, по крайней мере, некоторые из ответвлений воссоединяются вновь в каком-либо другом месте;
и/или по меньшей мере одну выточку;
и/или по меньшей мере одну полость, которая доступна снаружи только при прохождении через узкий участок.

10. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что поддерживающая структура (14) имеет внутри себя множество полостей, которые отделены одна от другой.

11. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что образующими целлюлозу организмами являются бактерии вида Acetobacter xylinum.

12. Способ по любому из пп.1-8, отличающийся тем, что сердцевина (2, 3, 4, 5) формы, по крайней мере, частично образована из поливинилового спирта и/или летнего воска.