СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЛЕНКИ НА ОСНОВЕ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ ДЛЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НА ПОВРЕЖДЕНИЯХ КОЖИ И ТКАНЕЙ Российский патент 2012 года по МПК C12P19/04 A61L15/28 C12R1/02 

Настоящее изобретение относится к биотехнологическому способу получения пленки на основе целлюлозы, которая применяется для покрытия и регенерирования повреждений кожи и тканей, а также к получаемой таким образом биотехнологической пленке.

В частности, изобретение относится к способу получения, в котором вышеуказанная пленка на основе целлюлозы получается с помощью бактерии Acetobacter xylinum.

В патенте ЕР-А-0114481 описывается получение салфеток, пропитанных жидкостью, применимых в качестве лекарственных препаратов для ран и ожогов, производимых из целлюлозной пленки, которую получают микробиологически с помощью культуры Acetobacter xylinum. Способ получения предусматривает культивирование микроорганизма в статических условиях (среда без перемешивания); при этом бактерия культивируется на поверхности питательной среды с образованием плотной пленки, которая обычно имеет толщину от 0,1 мм до приблизительно 15 мм; полученная таким образом пленка удаляется из питательной среды, обрабатывается гидроксидом натрия для удаления бактерий, нейтрализуется и промывается водой, что приводит к получению пропитанной водой пленки из микробиологически полученной целлюлозы.

В патенте WO 86/02095 также описывается получение пленок из целлюлозы, полученных при культивировании Acetobacter xylinum, используемых при трансплантации искусственной кожи; Acetobacter xylinum засевается в культуральную среду, содержащую в качестве питательных веществ углеводы и источники азота, в специфических примерах среда состоит из экстракта Tea Sinensis с добавлением сахара; способ получения включает инкубирование микроорганизма при 28°С в течение примерно 36 часов, после чего пленку удаляют из культуральной среды и высушивают при комнатной температуре на подложке в разрыхленном состоянии. Этот патент лежит в основе лекарственного препарата, продаваемого под маркой BIOFILL, используемого для лечения различных поражений кожи.

В патенте US 5846213 описывается получение лекарственных препаратов на основе целлюлозы, обладающих механическими свойствами и эластичностью, подобными механическим свойствам и эластичности кожи человека. Полученную культивированием Acetobacter xylinum пленку на основе целлюлозы растворяют в системе растворителей, содержащей диметилацетамид и соль лития, получая раствор, из которого литьем и коагуляцией в гелевой ванне получают целлюлозную мембрану.

Объектом настоящего изобретения является бактериально-получаемая пленка на основе целлюлозы и способ ее получения, пленка эффективна для создания среды, благоприятной для лечения повреждений кожи, и может быть использована в качестве лекарственного препарата для лечения повреждений кожи.

Другим объектом настоящего изобретения является пленка на основе целлюлозы, обладающая подходящими механическими характеристиками, в частности, высокой эластичностью, близкими к механическим характеристикам кожи человека.

Таким образом, объектом изобретения является способ получения и кристаллическая пленка на основе целлюлозы, обладающая характеристиками, определенными в следующих пунктах.

В частности, способ получения по изобретению отличается тем, что биосинтетическую пленку на основе целлюлозы получают культивированием в культуральной среде, содержащей источники азота и углерода, микроорганизмов, принадлежащих к виду Acetobacter xylinum в присутствии, по крайней мере, одного микроорганизма, принадлежащего к роду Leuconostoc.

В предпочтительном воплощении получение сопровождается засеванием дрожжей в культуральную среду, предпочтительно, дрожжи выбираются из: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombae и/или Saccharomyces malidevorans и смесь из двух или трех перечисленных дрожжей.

Acetobacter - это грамотрицательная, строго аэробная палочковидная бактерия. Она характеризуется способностью продуцировать многочисленные цепи поли-бета-1,4-глюкана, химически идентичного целлюлозе. Целлюлозные цепи в виде микрофибрилл синтезируются на поверхности бактерий на сайтах, расположенных вне клеточной мембраны. Изобретение охватывает использование любого штамма Acetobacter xylinum, способного продуцировать целлюлозные микрофибриллы, как в статической среде, так и при условиях перемешивания среды, включая специфические штаммы, описанные в EP 0228779.

Род Leuconostoc включает бактерии сферической формы, отличающиеся от рода Lactococcus продуцированием газа. Все виды рода Leuconostoc обладают гетероферментативным метаболизмом; бактерии широко распространены в природе, особенно в образцах растительного происхождения. Для этих бактерий оптимальная для роста температура находится в диапазоне от 20°С до 30°С, они являются менее ацидофильными по сравнению с лактобактериями, предпочитая слабокислые или нейтральные субстраты, за исключением Leucocostoc oenos (недавно заново классифицированную как Oenoscoccus oenos), адаптированной к низким значениям рН вина и известной как агент молочнокислого брожения вина.

Основываясь на тестах, проведенных заявителем, установлено, что присутствие бактерий рода Leuconostoc в среде Acetobacter xylinum, значительно влияет на продукцию и рост биомассы.

Пленка, полученная способом по изобретению, построена главным образом из кристаллической целлюлозы, и характеризуется относительно низкой степенью полимеризации, находящейся в диапазоне от 250 до 400. Важной особенностью такой пленки, отличающей ее от классической кристаллической целлюлозы, является ее нерастворимость в концентрированной серной кислоте. Эта особенность позволяет сделать предположение о наличии связей между одиночными цепочками целлюлозы, что делает продукт нерастворимым в концентрированной серной кислоте и затрудняет гидролиз.

В способе получения по изобретению культивирование вышеупомянутых микроорганизмов проводят при температуре, находящейся в диапазоне от 20°С до 36°С, и при значениях рН, находящихся в диапазоне от 1 до 6, предпочтительно, при температуре, находящейся в диапазоне от 26°С до 30°С, и при значениях рН, находящихся в диапазоне от 2 до 4.

Предпочтительная культуральная среда для симбиотического роста содержит тростниковый сахар, и/или жидкий экстракт тростникового сахара в качестве источников углерода и азота. Дополнительно культуральная среда может содержать сахар и уксусную кислоту.

Культивирование осуществляют главным образом в статических условиях.

Образующуюся пленку отделяют от культуральной среды известными из уровня техники способами и дегидратируют высушиванием.

Когда пленку смачивают физиологическим раствором, она приобретает прозрачность, эластичность и плотность, близкие к таковым для неповрежденной кожи человека; более того, пленка обладает селективной проницаемостью для газа и паров воды и, в тоже время, она непроницаема для воды и бактерий. Пленка обладает превосходной адгезивной способностью по отношению к поврежденному участку; образовавшаяся окклюзия (преграда) защищает рану, предотвращая загрязнения, уменьшая боль и создавая идеальную микросреду для грануляции и реэпителизации.

Такая пленка особенно рекомендуется для ожогов, язв и ран от I до глубокой II степени без повышенной экссудации; пленка превосходно приклеивается на поврежденный участок, является инертной, нетоксичной, неаллергенной и не содержит латекса.

Пример 1

В 500-литровый нержавеющий стальной сосуд вносят: 250 кг экстракта тростникового сахара, 20 кг тростникового сахара и уксус, в количестве, необходимом для достижения значения pH смеси 3,5. В культуральную среду при комнатной температуре засевают микроорганизмы Acetobacter xylinum и Leuconostoc, в частности, Leucocostoc oenos, в общем количестве 30 мл. Используется штамм Acetobacter xylinum, выбранный из группы, включающей АТСС 23769, АТСС 23770; и штамм Leucocostoc oenos, выбранный из группы, включающей АТСС 23277, АТСС 23278, АТСС 23279.

Во время этого процесса поддерживают значение pH 2,5 добавлением тростникового сахара и уксуса. После завершения биомассу промывают и с использованием промышленного пульверизатора доводят до жидкого состояния; полученную таким образом жидкость выливают на хлопковую подложку и помещают в нержавеющие стальные контейнеры, соединенные друг с другом и затем с вакуумной системой, которая, высушивая жидкую часть, определяет образование гладкой и однородной пленки на хлопковой подложке.

Хлопковую подложку с приклеенной пленкой затем помещают в печь и, после завершения процесса высушивания, пленку удаляют с подложки и пересылают на хранение. В зависимости от количества жидкой биомассы и размера используемых контейнеров, могут быть получены пленки различного размера и толщины: например, из 750 мл биомассы в жидком состоянии, помещенной в контейнер размером 23×30 см, получается пленка размером 21×27 см толщиной примерно 0,05 мм.

Пример 2

Процедуру, описанную в примере 1, осуществляют в вышеприведенных условиях, используя в качестве посевного материала в дополнении к вышеуказанным бактериям Saccharomyces cerevisiae и Schizosaccharomyces pombae.

Пленку, полученную, как описано в примере 2, подвергали анализу для подтверждения структуры и определения содержания целлюлозы.

Проводили следующие анализы.

Записывали ИК-Фурье спектр (прибор ASI React I 1000 с алмазной ячейкой, анализ непосредственно образца, разрешение 4 см^-1).

Регистрировали следующие полосы ИК-поглощения:

3340 см^-1 растяжение OH

2984 см^-1 растяжение алифатических CH

1460-1200 см^-1 деформационные колебания CH₂, вращательные колебания CH и CH₂, деформационные колебания OH в плоскости

1100-1000 см^-1 растяжение CН₂O и СOС

897 и 663 см^-1 колебания, типичные для целлюлозы.

Таким образом, ИК-Фурье спектр соответствует ИК-Фурье спектру целлюлозы.

Общий анализ на углеводы методом ВЭЖХ с использованием детектора-рефрактометра.

Использованные методы являются стандартными для определения содержания целлюлозы и гемицеллюлозы.

Содержание целлюлозы определяли методом, принятым на Stazione Spermentale carta Cartoni e Pasta per carta, (SSCCPC; Экспериментальная станция Бумаги, Картона и Бумажной массы), Милан, применяя полный гидролиз полисахаридов в концентрированной серной кислоте с последующим измерением общего количества восстанавливающих Сахаров (методом Somogyi-Nelson) и определением глюкозы ферментативным методом.

Содержание гемицеллюлозы определяли методом, принятым на SSCCPC, заключающимся в селективном гидролизе гемицеллюлозы в разбавленной серной кислоте с последующим измерением общего количества восстанавливающих сахаров (методом Somogyi-Nelson).

Полученные результаты (выраженные в весовых процентах по отношению к весу сухого анализируемого образца) свидетельствуют, что полученная пленка не растворима в принятых условиях, которые обычно ведут к гидролизу целлюлозы и гемицеллюлозы.

При анализе образца были получены следующие результаты:

1,7% смолистых веществ, экстрагируемых циклогексаном/этанолом,

75% остатка, нерастворимого после гидролиза концентрированной (72%) серной кислотой с последующим гидролизом разбавленной (3%) серной кислотой, или в условиях экспериментов, которые обычно позволяют гидролизовать и целлюлозу, и гемицеллюлозу до соответствующих моносахаридов,

4,6% восстанавливающих сахаров, определяемых в растворе после гидролиза,

1,8% глюкозы (как считается, из целлюлозы),

2,8% восстанавливающих сахаров (как считается, из гемицеллюлозы),

85% остатка, нерастворимого после гидролиза в 1М серной кислоте остатка, нерастворимого после гидролиза 72% и 3% серной кислотой (условия эксперимента, которые обычно позволяют селективно гидролизовать гемицеллюлозу до соответствующих моносахаридов),

2,5% восстанавливающих сахаров в остатке после гидролиза 1М серной кислотой (как считается, из гемицеллюлозы).

Для того чтобы лучше определить химическую структуру пленки, регистрировали спектр ядерного резонанса для твердого образца. ¹³С ЯМР спектр регистрировали с использованием метода DD CP-MAS (Dipolar Decoupling Cross-Polarization Magic Angle Spinning, биполярная декаплинг кросс-поляризация при вращении под магическим углом).

Этот метод, необходимый для уменьшения биполярных расщеплений, и, как следствие, для уменьшения ширины сигнала, заключается в декаплинге при высокой мощности и вращении образца вокруг оси, расположенной под углом в 54°7' (называемый «магическим углом») к фиксированной оси. Вращение под магическим углом позволяет исключить биполярные и гомоядерные взаимодействия, а также анизотропию химического сдвига. В частности, метод DD CP-MAS был использован для увеличения интенсивности сигналов редко встречающихся ядер и для того, чтобы исключить проблемы, связанные с чрезмерно продолжительными временами релаксации этих самых ядер.

В этом эксперименте использовали спин-поляризацию часто встречающихся атомов, таких как, например, протоны, которая является относительно сильной для того, чтобы увеличить спин-поляризацию редко встречающихся ядер, таких как, например, ¹³C.

Измерения проводили на приборе As×300 Bruker, оснащенным 4 мм датчиком, вращая образец со скоростью 8 кГц.

В ЯМР спектрах содержится набор сигналов, типичных для повторяющейся гликозидной субъединицы целлюлозы, спектр которой аналогичен спектру целлюлозы I, полученной из Acetobacter.

Более того, что касается общего количества кристаллического С₄ и аморфного С₄, было установлено, что содержание кристаллического С₄ составляет 75%, что является достаточно высоким показателем, позволяющим говорить о высоком индексе кристалличности; в дальнейшей серии тестов, процентное содержание кристаллического C₄ находилось в диапазоне от 65% до 90%.

Среднюю степень полимеризации определяли вискозометрическим методом UNI 8282/94. Образец был полностью растворим в использованном растворителе (куприэтилендиамин) со средней степенью полимеризации 290.

Пленку на основе целлюлозы для покрытия, регенерации, восстановления и заживления повреждений кожи и тканей, таких повреждений как, язвы, ожоги, раны и тому подобные, получают культивированием в культуральной среде, содержащей источники азота и углерода, микроорганизмов, включая виды Acetobacter xylinum и, по крайней мере, один микроорганизм, принадлежащий к роду Leuconostoc oenos. Культивирование проводят при температуре от 20°C до 36°C и при значении pH от 1 до 6. Полученная пленка включает кристаллическую целлюлозу в форме микрофибрилл, имеющую среднюю степень полимеризации от 250 до 400, степень кристалличности от 65% до 90%, при этом пленка нерастворима в концентрированной кислоте. Изобретение обеспечивает получение пленки на основе целлюлозы, обладающей характеристиками, близкими к механическим характеристикам кожи человека, высокой эластичностью. 2 н. и 6 з.п. ф-лы, 2 пр.

1. Способ получения пленки на основе целлюлозы для покрытия, регенерации, восстановления и заживления повреждений кожи и тканей, таких как язвы, ожоги, раны и тому подобные, предусматривающий культивирование в культуральной среде, содержащей источники азота и углерода, микроорганизмов вида Acetobacter xylinum, промывку и доведение полученной биомассы до жидкого состояния, нанесение ее на подложку и высушивание с получением таким образом целлюлозной пленки, отличающийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит микроорганизм, принадлежащий к виду Leuconostoc oenos.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанная культуральная среда дополнительно содержит дрожжи, выбираемые из: Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombae и/или Saccharomyces malidevorans.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что культивирование проводят при температуре от 20 до 36°C и при значениях pH от 1 до 6.

4. Способ по любому из пп.1-3, характеризующийся тем, что культивирование проводят при температуре от 26 до 30°C и при значениях pH от 2 до 4.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что культуральная среда содержит тростниковый сахар и/или жидкий экстракт тростникового сахара.

6. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что культуральная среда содержит уксусную кислоту в качестве регулятора pH.

7. Кристаллическая биологическая пленка на основе целлюлозы, используемая для покрытия кожи и тканей, регенерации, репарации и заживления, отличающаяся тем, что она получена способом по п.1 и включает кристаллическую целлюлозу в форме микрофибрилл, имеющую среднюю степень полимеризации от 250 до 400, при этом пленка не растворима в концентрированной серной кислоте.

8. Биологическая пленка по п.8, отличающаяся тем, что она обладает степенью кристалличности от 65 до 90%.