ШТАММ ВИРУСА ЭФЕМЕРНОЙ ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА EPHEMEROVIRUS BOVINUM ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ЭФЕМЕРНОЙ ЛИХОРАДКИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА Российский патент 2012 года по МПК A61K39/205 C12N7/00 

Изобретение относится к области ветеринарной вирусологии и биотехнологии, в частности к новому штамму вируса эфемерной лихорадки (ВЭЛ) крупного рогатого скота (КРС), который может быть использован при разработке и производстве средств диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Эфемерная лихорадка (трехдневная эпизоотическая лихорадка, болезнь тугоподвижности) - остро протекающая вирусная трансмиссивная болезнь КРС, клинически проявляющаяся внезапным повышением температуры тела до (+41°C)÷(+42°C), непродолжительной (1÷5 сут) лихорадкой, воспалением слизистых оболочек, ригидностью и хромотой (1, 2).

Возбудитель - РНК-содержащий вирус из группы рабдовирусов, в естественных условиях передается различного вида кровососущими насекомыми. Болезнь проявляется в теплое влажное время года, в период биологической активности кровососущих насекомых, быстро распространяется и протекает в виде энзоотии и эпизоотии.

В соответствии с классификацией, установленной Международной комиссией по таксономии вирусов (International Committee on Taxonomy of Viruses - ICTV), ВЭЛ КРС относится к роду 01.062.0.03. Ephemerovirus, принадлежащему к семейству 01.062. Rhabdoviridae (3).

ВЭЛ КРС имеет пулевидную форму, размер 140×70 нм, полый осевой канал и сходен с вирусами везикулярного стоматита, фландерс, бешентсва и Керн Каньон, также относящихся к семейству рабдовирусов. В отличие от них ВЭЛ не имеет поперечной полосатости и внутренняя структура его вирусной частицы представлена 6-гранной белковой массой, а нуклеиновая кислота 2-нитевая. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа). Гликопротеин G может быть удален из вириона при обработке неионными детергентами, что применяется при изготовлении вакцинных препаратов (4÷6).

Эфемерная лихорадка КРС регистрируется ежегодно в основном в тропических и субтропических зонах (Израиле, Иране, Ираке, Сирии, Индии, Пакистане, Бангладеш, Китае, Японии, Австралии, Африке). Имеются сообщения о заболевании ею в Монголии и Средней Азии (4, 7, 8).

Эфемерная лихорадка КРС наносит значительный ущерб животноводству, обусловленный снижением привесов и молочной продуктивности.

Российская Федерация имеет общие границы с некоторыми из вышеуказанных стран, поэтому не исключена опасность возникновения этого заболевания в южных регионах страны. В связи с этим необходимо иметь высокоэффективные диагностические препараты, которые позволили бы идентифицировать возбудителя эфемерной лихорадки КРС и впоследствии быстро купировать распространение инфекции. Это обстоятельство вынуждает вести постоянный поиск новых штаммов ВЭЛ КРС, пригодных для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.

Известен ряд штаммов ВЭЛ КРС, используемых для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС.

Известен штамм YHL ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и HmLu-1 с титром инфекционной активности 5,0÷6,5 Ig ТЦД₅₀/см³ и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки (9).

Известен штамм TLRI ВЭЛ, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).

Известен штамм Liu Yin ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 5,6÷6,5 Ig ТЦД₅₀/см³ и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (9).

Известен штамм ВВ7721 ВЭЛ КРС, выделенный в 1968 г. из крови коровы с клиническими признаками эфемерной лихорадки, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 и Vero и используемый для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки КРС (10-12).

Известен штамм 919 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики и специфической профилактики эфемерной лихорадки КРС, полученный из полевого изолята в 1978 г. в Квинсленде (Австралия) и репродуцированный в культуре клеток Vero с титром инфекционности 5,3÷5,8 Ig ТЦД₅₀/см³ (13).

Известен штамм «Монгольский» ВЭЛ КРС, репродуцированный в культуре клеток ВНК-21 с инфекционной активностью 6,0÷6,5 Ig ТЦД₅₀/см³ и используемый для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС (14).

Известен штамм РТ-1 ВЭЛ КРС для изготовления средств диагностики эфемерной лихорадки, изолированный в 1990 г. из крови инфицированных коров и адаптированный к культурам клеток ВНК-21 и Vero (15).

Задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, заключается в расширении арсенала штаммов ВЭЛ КРС, обладающих высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и пригодных для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Указанная задача решена получением штамма «ВНИИЗЖ-М» (авторское наименование) ВЭЛ КРС, используемого для изготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС.

Для получения ВЭЛ КРС, обладающего оптимальными биотехнологическими свойствами, использовали монослойную перевиваемую линию клеток ВНК-21, как высокочувствительную к ВЭЛ КРС. В результате проведения 9 последовательных пассажей изолята на культуре клеток ВНК-21 был получен штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, имеющий стабильные биотехнологические, антигенные и иммуногенные свойства и пригодный для изготовления сывороток и антигенов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.

Накопление вируса штамма «ВНИИЗЖ-М» в культуре клеток ВНК-21 обеспечивалось на уровне от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС депонирован 21 июня 2007 г. во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП ВЭЛ КРС.

Сущность изобретения пояснена на графических материалах, на которых на:

фиг.1 представлена хроматограмма результатов электрофореза продуктов полимеразной цепной реакции (ПЦР) фрагмента генома ВЭЛ КРС в 2% агарозном геле после окрашивания бромистым этидием, на которой:

1, 3 дорожка - маркер pUC 19 DNA/Mspl (Hpall) (стрелками указаны длины фрагментов п.н.);

2 дорожка - штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (специфический фрагмент ДНК длиной 460 п.н.);

фиг.2 - электронная микрофотография вирионов производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС (фото получено д.б.н. А.П.Пономаревым), увеличение ×50000.

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки

При электронной микроскопии штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС были выявлены вирусные частицы, структура и размеры которых характерны для семейства Rabdoviridae, рода Ephemerovirus.

Вирионы эфемерной лихорадки имеют пулевидную и конусовидную формы, диаметром 80÷110 нм, длиной 100÷170 нм и состоят из нуклеокапсида спиральной симметрии, окруженного липопротеиновой оболочкой, на поверхности которой имеются выступы длиной 5÷10 нм и диаметром 3 нм.

Антигенные свойства

По своим антигенным свойствам штамм «ВНИИЗЖ-М» относится к ВЭЛ КРС.

Вирус стабильно нейтрализуется гомологичной антисывороткой в реакции нейтрализации (РН) на культуре клеток Vero.

Введение вацинного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ коровам сопровождается образованием у них вируснейтрализующих антител в крови в титре 1:4÷1:16.

Биотехнологические характеристики

Штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проявляет высокую биологическую, антигенную и иммуногенную активность в лиофилизированном виде и в виде культуральной вируссодержащей суспензии. Штамм предназначен для изготовления диагностических и вакцинных препаратов. Вирус штамма «ВНИИЗЖ-М» репродуцируется в монослойных культурах клеток: Vero и перевиваемой культуре клеток ВНК-21, в которых в течение 2-3 суток инкубирования накапливается в титре не менее 5,5 Ig ТЦД₅₀/см³. Сохраняет исходные характеристики при пассировании в чувствительных биологических системах в течение 14 пассажей.

Генотаксономическая характеристика

Геном ВЭЛ КРС не обладает инфекционностью и представлен молекулой двухнитевой РНК. ВЭЛ содержит в своем составе пять структурных белков: L (180 кДа), G (81 кДа), N (52 кДа), М1 (43 кДа) и М2 (29 кДа).

Физические свойства

Плавучая плотность в CsCl 1,19 г/см³. Наиболее стабилен при рН 7,2÷7,6. При ультрацентрифугировании в течение 2 ч при 4°С большая часть вируса осаждается при 73000 g.

Устойчивость к внешним факторам

ВЭЛ КРС штамм «ВНИИЗЖ-М» не стоек к воздействию высокой температуры, различных химических веществ, например хлороформу (5%), этиловому спирту (20%), трипсину (0,5÷1%). Вирус чувствителен к кислой и щелочной среде, действию ультрафиолетовых лучей. Многократное замораживание и оттаивание не влияют на инфекционный титр вируссодержащего материала.

Дополнительные признаки и свойства

Безвредность - при подкожном введении крупному рогатому скоту 5,0 и 20,0 см³ вируссодержащего материала заболевания не вызывает.

Вирулентность - авирулентен для крупного рогатого скота при подкожном введении.

Стабильность биологических свойств. Сохраняет исходные характеристики при пассировании на культуре клеток ВНК-21 в течение 14 серийных пассажей. Штамм нереверсибелен в течение 3 пассажей на быках.

Сущность предложенного изобретения пояснена примерами его использования, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Вирусный изолят, послуживший источником для получения штамма «ВНИИЗЖ-М», был выделен в 1993 г. от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС. Подготовку материала проводили общепринятыми методами.

Биологические и вирусологические методы включали адаптацию вируса, выделенного от больных коров, к культуре клеток ВНК-21. В процессе адаптации было установлено, что перевиваемая линия клеток ВНК-21 высокочувствительна к ВЭЛ и оказалась оптимальной культурой для получения расплодки штамма для изготовления антигена.

В дальнейшем для получения расплодки вирусную суспензию вносили на освобожденный от ростовой среды монослой культуры клеток и экспонировали в течение часа в термостате при температуре 37±0,5°С. После этого вносили поддерживающую среду Игла с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубировали при 37±0,5°С до появления цитопатического действия (ЦПД) вируса, которое характеризовалось округлением клеток, скоплением их в виде групп по 10÷20 клеток и в дальнейшем тотальной деструкцией монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% (округление и появление светопреломляющего эффекта, отслоение от стекла) культуральные матрасы промораживали при минус 30°С и после оттаивания при комнатной температуре производили сбор вируса с последующим отбором проб для исключения микробной контаминации и определения инфекционной активности вируса титрованием в культуре клеток Vero, выращенной во флаконах в виде 2-суточного монослоя. Для этого содержимое 3 ампул растворяли стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см³), тщательно перемешивали и объединяли. Готовили десятикратные разведения вируса на среде ПСП с содержанием 1% сыворотки КРС, начиная с 10^-1 до 10^-7. Затем в четыре флакона с монослоем клеток после удаления ростовой среды вносили по 1 см³ каждого разведения вируса, начиная с 10^-1 по 10^-7. Во флаконах с контрольной культурой клеток проводили только смену среды.

Флаконы инкубировали при 37±0,5°С, ежедневно просматривая их, начиная с 3 суток, под микроскопом на наличие специфической дегенерации клеток (ЦПД). Смену среды проводили через каждые 3 суток. Окончательный учет результатов проводили через 7 суток после заражения культуры клеток. Результаты титрования считали достоверными при сохранении монослоя в контроле. Расчет вели по методу Рида и Менча.

Титр производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС 8 пассажа составил в среднем 4,6 Ig ТЦД₅₀/см³ в трех повторностях (4,5 Ig ТЦД₅₀/см³; 4,66 Ig ТЦД₅₀/см³; 4,66 Ig ТЦД₅₀/см³), 9 пассажа составил в среднем 5,66 Ig ТЦД₅₀/см³ (5,5 Ig ТЦД₅₀/см³; 5,5 Ig ТЦД₅₀/см³; 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³), 14 пассажа - 5,88 Ig ТЦД₅₀/см³ (6,0 Ig ТЦД₅₀/см³; 5,66 Ig ТЦД₅₀/см³; 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³). Данные титрования представлены в таблицах 1, 2 и 3.

Пример 2.

Для проведения испытаний на стерильность использовали 20 ампул лиофилизированного производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.

Контроль на отсутствие контаминации бактериальной и грибковой флорой проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89 «Препараты биологические. Методы контроля стерильности».

Содержимое ампул разводили водой для инъекций и объединяли по три ампулы. Из каждой пробы препарата по 1 см³ вносили в 3 пробирки, содержащие тиогликолевую среду, и пробирки инкубировали в течение 14 суток, при этом пробирки №№1 и 2 при 21±1°С, а пробирку №3 при 37±0,5°С. Затем из пробирки №3 делали пересевы:

1. По 0,5 см³ на следующие среды: скошенный казеиновый питательный агар, казеиновый питательный бульон, среда Сабуро (жидкая).

2. По 1,0 см³ на следующие среды: казеиновый питательный бульон под вазелиновым маслом с кусочками мяса или печени, казеиновый агар, мясопептонный бульон (МПБ), мясопептонный агар (МПА), мясопептонный печеночный бульон под вазелиновым маслом (МППБ), среда Сабуро при 21±1°С.

При испытании производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС проводили контроль стерильности сред: три пробирки с каждой средой выдерживали в течение 14 суток при 37±0,5°С, со средой Сабуро при 21±1°С.

Для исключения контаминации штамма микоплазмами были сделаны высевы по 0,5 см³ в 3 пробирки, содержащие по 4,5 см³ стандартного PPLO-бульона (20% лошадиной сыворотки; 1,47% PPLO-основы; 2,5% аутолизата дрожжей; 0,5% глюкозы; 0,25% аргинина; по 0,01% никотинамида динуклеотида и L-цистеина; 0,05% ацетата таллия; индикатор - феноловый красный). При отсутствии роста микоплазм на жидкой среде в течение 72 ч (сохранение цвета индикатора) проводили два «слепых» пассажа в течение 72 часов каждый, а затем делали высев на среду Каган. Пробирки просматривали визуально в течение 10 дней. При отсутствии специфических для микоплазм колоний, врастающих в толщу агара, делали заключение о чистоте исследуемого материала.

В результате проведенных исследований установлено, что производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС свободен от грибов, анаэробных, аэробных, мезофильных бактерий и микоплазм.

Пример 3.

Определение авирулентности, безвредности, реверсибельности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.

Содержимое 15 ампул растворяли стерильным физиологическим раствором в объеме, равном объему препарата до лиофилизации, и объединяли. Для определения авирулентности, безвредности и реверсибельности вирус вводили подкожно по 5 см³ трем быкам.

Для определения реверсибельности проводили 3 пассажа на КРС. От первого животного через 5 дней после введения вируса отбирали кровь и в объеме 10 см³ ее вводили четвертому. От четвертого еще через 5 дней отбирали кровь и в таком же объеме вводили пятому. Ежедневно за животными вели наблюдение и проводили термометрию.

Через 21 день после введения вируса у животных брали пробы крови для определения наличия антител к ВЭЛ КРС.

Результаты исследований представлены в таблице 4.

Таким образом, производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС не вызывает заболевание и гибель животных, является авирулентным, безвредным и нереверсибельным.

Пример 4.

Определение специфичности, антигенной и иммуногенной активности производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС.

Антигенную активность вакцинного штамма определяли на четырех быках. Вирус вводили подкожно в область шеи в объеме 5 см³ в дозе 5,5 Ig ТЦД₅₀/см³.

До введения вируса (нулевые пробы) и через 21 день после введения вакцинного штамма у животных брали кровь для определения в сыворотке крови титра вируснейтрализующих и комплементсвязывающих антител. За животными вели ежедневное клиническое наблюдение в течение 21 суток с измерением температуры тела.

Вируснейтрализующую активность антител сывороток крови определяли в РН. С этой целью готовили двукратные разведения испытуемых сывороток. К полученным разведениям сывороток добавляли равные объемы вируссодержащего культурального материала с активностью 2,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Смеси вируса с сывороткой выдерживали в течение 1 часа при температуре 37,0°С, после чего ими инфицировали клеточную культуру Vero (по 4 флакона с культурой клеток на каждое разведение сыворотки). Флаконы с культурой клеток инкубировали при температуре 37±1°С в стационарном положении в течение 7 суток со сменой среды через 3-4 суток. За титр антител в сыворотке принимали наибольшее ее разведение, в котором подавлялось развитие ЦПД не менее чем в половине зараженных пробирок с культурой клеток.

При постановке РН использовали контроли на токсичность сывороток, контроли культуры клеток и дозы вируса.

Результаты проведенных исследований представлены в таблице 5. Титр вируснейтрализующих антител находился в пределах 1:8÷1:16.

Комплементсвязывающую активность сывороток крови животных определяли в реакции длительного связывания комплемента (РДСК) общепринятым методом. С этой целью готовили двукратные разведения сыворотки крови КРС на физиологическом растворе рН 7,6.

Специфичность вируса подтвердили в РН и РДСК с типоспецифической сывороткой крови на ВЭЛ КРС, а также с использованием гетерогенных сывороток крови против вируса бешенства, чумы КРС и оспы овец.

Методом контрольного заражения КРС, иммунизированного вакциной из штамма ЭЛ «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС в дозах 1,0; 5,0 и 20,0 подкожно, через 21 день после вакцинации установлено, что вакцина защищала животных от заболевания при введении в дозах 5,0 и 20,0 см³. Титры антител в крови животных были в РН 1:4÷1:16, а в РДСК 1:10, а после заражения 1:20 (таблицы 6 и 7).

Пример 5.

Контроль производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС на специфичность и отсутствие контаминации чужеродными вирусами

Для исследования была использована вируссодержащая суспензия с инфекционным титром 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³.

Специфичность исследуемого вируса подтверждали с помощью метода ПЦР. В работе использовали праймеры F1, 460R (Hsieh Y.-C. 2006), позволяющие амплифицировать фрагмент гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС. Анализ продуктов реакции осуществляли после 40 циклов (денатурация 94°С 30 с, отжиг праймеров 55°С 30 с и элонгация 72°С 1 мин). Результаты исследований представлены на фиг.1.

В результате проведения ПЦР с праймерами F1, 460R фрагмента гена поверхностного гликопротеина G (1÷460 п.н.) ВЭЛ КРС получен фрагмент размером около 460 п.н., что соответствует расчетному размеру.

С использованием метода ПЦР были проведены исследования по выявлению в исследуемом материале вируса инфекционного ринотрахеита, вируса парагриппа-3, вируса диареи и ротавируса КРС.

Последовательностей, специфичных для указанных вирусов, не обнаружено.

Сыворотки крови КРС, зараженного ВЭЛ КРС, были исследованы с помощью метода иммуноферментного анализа (набор для выявления антител к вирусу болезни Ауески фирмы IDEXX Pseudorabies Virus gB Antibody Test Kit) на наличие антител к вирусу болезни Ауески до и через 21 день после заражения. Сыворотки крови КРС не содержали антител к гетерологичному вирусу.

ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М», негативно контрастированный при помощи 4% фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) с рН=6,8, представлен вирионами сложного строения, состоящими из нуклеокапсида, окруженного гликопротеиновой оболочкой пулевидной и конусовидной формы диаметром 80÷110 нм и длиной 100÷170 нм. Кроме указанных форм частиц в препарате содержались частицы неправильной формы.

Электронно-микроскопическим методом подтверждена принадлежность штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС к семейству Rabdoviridae, роду Ephemerovirus. Наличие контаминации штамма вируса ЭЛ КРС чужеродными агентами (вирусами, микоплазмами и др. микроорганизмами) не установлено. Результаты исследований представлены на фиг.2.

Полученный штамм депонирован 21 июня 2007 года во Всероссийскую государственную коллекцию штаммов микроорганизмов, используемых в ветеринарии и животноводстве, ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером (ссылкой) - производственный штамм «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП ВЭЛ КРС.

Пример 6

Получение антигена ВЭЛ КРС.

Для приготовления антигена для диагностических целей содержимое 3-х ампул ВЭЛ штамма «ВНИИЗЖ-М» растворяют стерильной средой ПСП до исходного объема (1 см³), тщательно перемешивают и объединяют. Трехсуточную культуру клеток ВНК-21 монослойной (шведской) линии, выращенную в 1,5-литровых клинских матрасах, предварительно слив с них ростовую среду, заражают в дозе 0,1÷1,0 Ig ТЦД₅₀/см³. Матрасы помещают на 1 час в термостат для контакта клеток культуры с вирусом. После этого вносят поддерживающую среду ПСП с добавлением 1÷2% сыворотки крови КРС. Инфицированную культуру инкубируют при 37±0,5°С до появления ЦПД вируса, которое характеризуется округлением клеток, их скоплением и в дальнейшем разрушением монослоя клеток. При поражении площади монослоя не менее 70÷80% культуральные матрасы подвергают двукратному промораживанию при температуре минус 20°С и оттаиванию.

Полученную вирусную суспензию используют в качестве матровой расплодки, которой заражают клинские матрасы с культурой клеток ВНК-21, и, как описано выше, получают 11÷12 пассаж вируса. При появлении ЦПД на 70÷80% площади монослоя, сливают ростовую среду, оставляя около 20 см³, и стерильным резиновым шпателем отделяют инфицированный слой клеток от стекла в культуральную жидкость.

Концентрирование антигена ВЭЛ осуществляют отделением клеточной фракции путем центрифугирования при 2000 об/мин в течение 20 мин. Осадок ресуспендируют физиологическим раствором из расчета 1 см³ на каждый матрас, что соответствует двухсоткратной концентрации вируса. Полученный концентрат подвергают двукратному промораживанию при минус 20°С и оттаиванию.

Полученный данным способом антиген используют в серологических реакциях для определения уровня антител к ВЭЛ, а также для изготовления диагностических сывороток.

Результаты исследований, приведенные в таблице 8, свидетельствуют о том, что способом, описанным в примере 6, получен антиген, который является специфичным, что подтверждено их тестированием с гомологичными и гетерологичными сыворотками.

Пример 7

Получение гипериммунной сыворотки.

Для приготовления диагностических сывороток крови используют очищенный и концентрированный препарат антигена ВЭЛ КРС из штамма «ВНИИЗЖ-М».

Очистку антигена проводят в два этапа: на первом этапе используют 20%-ный раствор сахарозы, на втором - градиент плотности сахарозы (5%, 10%, 15%, 20% и 25% растворы). В обоих случаях соотношение вирусного материала и сахарозы должно составлять 3:1 соответственно. Первоначально вирусный материал очищают центрифугированием через 20% раствор сахарозы в течение 1,5 часов при 20000 об/мин. Полученный осадок растворяют в физиологическом растворе до первоначального объема исходного материала и центрифугируют в градиенте плотности сахарозы при 20000 об/мин в течение 2 ч. Образовавшийся осадок ресуспендируют в минимальном объеме физиологического раствора и используют в дальнейшем в качестве антигена для иммунизации животных.

Получение гипериммунной сыворотки КРС.

Иммунизируют животных четырехкратно. После первого введения антигена иммунизацию проводят на 21, 28 и 35 дни с интервалом в 7 дней между инъекциями. Для иммунизации используют 2 см³ антигена с адъювантом Фрейнда в соотношении 1:1 внутримышечно либо 1 см³ антигена с содержанием 0,25 мг сапонина подкожно. Через 7 дней после последней иммунизации отбирают кровь для получения сыворотки. Проверку проб сыворотки крови проводят на активность и специфичность в РДСК с набором специфических и гетерологичных антигенов. Результаты исследований приведены в таблице 9. Для составления серийного перпарата используют сыворотки крови, активность которых со специфическим антигеном в РДСК не ниже 1:20, а с гетерологичным антигеном они должны быть неактивны. Сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.

Получение гипериммунной сыворотки на кроликах.

Для получения специфической сыворотки ВЭЛ КРС на кроликах используют клинически здоровых животных средней упитанности массой 2,5-3,0 кг. Животных иммунизируют четырехкратно с интервалом в 7 дней.

При первой иммунизации очищенный и концентрированный антиген вводят в объеме 1,0 см³ в подушечки задних лап, при второй - 2,0 см³ в область подколенных лимфоузлов, при третьей - внутримышечно в бедро задней ноги 0,5 см³ антигена и 0,5 см³ полного адъюванта Фрейнда, при четвертой - 0,5 см³ антигена и 0,5 см³ неполного адъюванта Фрейнда подкожно в область спины в несколько точек.

Возможна и следующая схема иммунизации: кроликам аналогичным способом вводят при первой иммунизации 0,5 см³ антигена и 0,5 см³ полного адъюванта Фрейнда, при второй - 1,0 см³ антигена и 1,0 см³ неполного адъюванта Фрейнда, при третьей и четвертой - 0,5 см³ антигена и 0,5 см³ неполного адъюванта Фрейнда.

Через 7 дней после последней иммунизации кроликов тотально обескровливают и получают сыворотку крови. Сыворотки крови фасуют в ампулы по 1,0 см³, лиофильно высушивают. Препараты сыворотки, проверенные на специфичность и активность, фасуют в стерильные флаконы, этикетируют и хранят до использования при минус 20÷40°С.

Данные, представленные в таблицах 9, 10 и 11, свидетельствуют, что способом, описанным в примере 7, получены диагностические сыворотки со специфической активностью.

Полученные гипериммунные сыворотки крови КРС и кроликов были использованы для определения в РДСК специфической активности культурального производственного штамма ВЭЛ «ВНИИЗЖ-М» и для ретроспективной диагностики: определения уровня антител в крови животных, переболевших эфемерной лихорадкой, титр антител в крови которых был в пределах 1:5÷1:40.

При гипериммунизации крупного рогатого скота и кроликов концентрированным и очищенным антигеном вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота с адъювантом Фрейнда получена специфическая сыворотка крови с активностью 1:80 и 1:160 соответственно, которая может быть использована в РДСК для определения активности специфического антигена и ретроспективной диагностики заболевания КРС эфемерной лихорадкой.

Источники информации

1. Курченко Ф.П., Гононов Ю.М., Хлыбова Т.В., Зайцев В.Л., Кекух И.Г., Пасечников Л.Н., Алехин А.Ф. и Вяткина Н.В. Выделение и идентификация вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота. Ветеринария, 1991, 2,26÷28.

2. OIE. Bovine ephemeral fever. Ames. Jowa State Univ., 2005.

3. http://www.ictvdb.org/lctv/fs rhabd.htm.

4. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В. и Фомина Н.В. Вирусные болезни животных. - М.: ВНИТИБП, 1998. - с.319÷323.

5. Nandi S., Negi B.S. Bovine ephemeral fever: a review // Comparative Immunol., Microbiol. and Infectious Diseases. - 1999. - N 22. - P.81÷91.

6. Walker P.J. Bovine ephemeral fever virus // Encyclopedia of Virology, Third ed. - 2008. - P.354÷362.

7. Диев В.И., Назаров А.С. и Соколов Л.Н. Клинические признаки эфемерной лихорадки крупного рогатого скота при экспериментальном заражении // Тез. докл. 4-ой Межгосуд. конф. по научн. и приклад. проблемам 21÷23.10.1993 г., Киев, 1993.

8. George T.D. Studies on the pathogenesis of bovine ephemeral fever in sentinel cattle. Vet Microbiol., 1985, 10, 6, 493÷504.

9. Chiu S.Y., Lu Y.S. The serological study on bovine ephemeral fever in Taiwan in 1984 // Journal of the Chinese Society Veterinary Science. - 1986. - Vol.12. - P.289÷296.

10. Walker P.J. et al. Proteins of bovine ephemeral fever virus // J. Gen. Virol. - 1991. N 72. - P.67÷74.

11. Walker P.J. et al. The genome of ephemeral fever Rhabdovirus contains two related Glycoprotein genes // J. Virol. - 1992. - N 191. - P.49÷61.

12. Zakrzewsky H., Cybinski D.H., Walker P.J. A blocking ELISA for the detection of specific antibodies to bovine ephemeral fever virus // J. Immunol. Methodes. - 1992. - N 151. - P.289÷297.

13. Vanselow B.A., Walthall J.C., Abetz I. Field trials of ephemeral fever vaccines//Vet. Microbiol. - 1995. - N 46. - P.117÷130.

14. Диев В.И., Назаров А.С., Захаров В.М. и соавт. Экспериментальные исследования по изучению клиники эфемерной лихорадки крупного рогатого скота и получению диагностических препаратов // Вирусные и микробные болезни сельскохозяйственных животных: сб. научн. труд. - Владимир, 1995. - С.128÷131.

15. Chang C.J. et al. Apoptosis induced by bovine ephemeral fever virus // J. Virol. Methodes. - 2004. - Vol.122, №2. - P.165÷170.

Таблица 1 Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 8 пассаж от 03.1993 г. Повтор
ность титрова
ния Разведение вируса Титр вируса, Ig ТЦД₅₀/см³ 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 №1 ++++ ++++ ++++ ++++ ---- ---- ---- 4,5 №2 ++++ ++++ ++++ ++++ +--- +--- ---- 4,66 №3 ++++ ++++ ++++ ++++ +--- +--- ---- 4,66 Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе.

Таблица 2 Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 9 пассаж от 03.2007 г. Повторность титрования Разведение вируса Титр вируса, Ig ТЦД₅₀/см³ 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 №1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ---- ---- 5,5 №2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ---- ---- 5,5 №3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++-- ---- 6,0 Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе.

Таблица 3 Титрование производственного штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС, 14 пассаж от 04.2007 Повторность титрования Разведение вируса Титр вируса, Ig ТЦД₅₀/см³ 10^-1 10^-2 10^-3 10^-4 10^-5 10^-6 10^-7 №1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++-- ---- 6,0 №2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +--- ---- 5,66 №3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++-- ---- 6,0 Примечания: + наличие ЦПД во флаконе; - отсутствие ЦПД во флаконе.

Таблица 4 Результаты исследования авирулентности, безвредности и реверсибельности штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС № п/п Возраст быков (мес.) Хар-ка материала Клинические признаки 1 18 Культуральный вирус в объеме 5 см³ Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. 2 14 Культуральный вирус в объеме 5 см³ Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. 3 14 Культуральный вирус в объеме 5 см³ Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. 4 18 Гепаринизированная кровь в объеме 10 см³ Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. 5 18 Гепаринизированная кровь в объеме 10 см³ Температура в пределах нормы; клинические признаки болезни отсутствовали. Примечание: титр культурального вируса - 5,5 Ig ТЦД_50/см ³

Таблица 5 Результаты исследования антигенной активности штамма «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС № животного Вид и возраст Титр вируснейтрализующих антител (дни) До имунизации 7 14 21 1 бык 18 мес. н/а н/а 1:4 1:8 2 бык 14 мес. н/а н/а 1:4 1:8 3 бык 14 мес. н/а 1:2 1:4 1:16

Таблица 6 Результаты контроля напряженности иммунитета КРС после иммунизации вакцинным штаммом «ВНИИЗЖ-М» ВЭЛ КРС №№ КРС Иммунизация в дозе (см³) Титр антител в крови в РН на 21 день после вакцинации Температура тела (дни после заражения) 0 день 5 6 7 8 1 20 внутривенно 1:16 N N N N 2 5,0 подкожно 1:8 N N N N 3 5,0 подкожно 1:8 N N N N 4 1,0 подкожно 1:4 41,2* 41,0* 40,5* N 5 контроль - 41,6* 41,2* 40,2* N N - показатели в пределах физиологической нормы;
* - наличие клинических признаков;
- - отсутствие антител.

Таблица 7 Динамика антител в крови КРС после иммунизации и контрольного заражения вирулентной кровью КРС №№ КРС Титры антител в РДСК дни после вакцинации 14 дней после заражения 14 21 1 1:10 1:10 1:20 2 1:10 1:10 1:20 3 - - 1:10 4 - - 1:20 5 - - 1:10

Таблица 8 Активность антигена ВЭЛ КРС Материал Титр инфекционной активности, Ig ТДЦ₅₀/см³ в РДСК Исходный вирус 5,5±0,14 1:4 Нативный вирус 6,0±0,03 1:8 Антиген 8,5±0,15 1:320

Таблица 9 Специфическая активность сыворотки крови после иммунизации крупного рогатого скота ВЭЛ КРС штамма «ВНИИЗЖ-М» Метод иммунизации Титры антител после иммунизации в РДСК 1-ой 2-ой 3-ей 4-ой 1,0 см³ антигена + 0,25 мг сапонина подкожно 1:30 1:30 1:40 1:60 1,0 см³ антигена + 1,0 см³ адъюванта Фрейнда* внутримышечно 1:30 1:40 1:80 1:80 * - при первой иммунизации использовали полный адъювант Фрейнда, а при следующих - неполный

Таблица 10 Специфическая активность сыворотки крови после гипериммунизации кроликов антигеном ВЭЛ КРС №№ группы животных Метод иммунизации Титр антител в РДСК в подушечки задних лап в область подколенных лимфоузлов в бедро задней лапы внутримышечно в область спины подкожно 1 1,0 см³ Аг* 2,0 см³ Аг* 0,5 см³ Аг* + 0,5 см³ полного адъюванта Фрейнда 0,5 см³ Аг* + 0,5 см³ неполного адъюванта Фрейнда 1:160 2 0,5 см³ Аг*+0,5 см³ полного адъюванта Фрейнда 1,0 см³ Аг*+1,0 см³ неполного адъюванта Фрейнда 0,5 см³ Аг* + 0,5 см³ неполного адъюванта Фрейнда 0,5 см³ Аг* + 0,5 см³ неполного адъюванта Фрейнда 1:80 * Аг - специфический антиген ВЭЛ КРС

Таблица 11 Активность гипериммунной сыворотки крови против ЭЛ с гетерологичными антигенами Антиген Активность в РДСК сывороток КРС сывороток кроликов Гомологичный ВЭЛ 1:60 1:80 1:80 1:160 Антигены ящурные штаммоспецифические сухие для серологических реакций ТУ 9388-006-00495527-99 н/а н/а н/а н/а Набор препаратов для диагностики чумы КРС методами РСК и РДП ТУ 9388-073-00495527-01 н/а н/а н/а н/а н/а - сыворотка крови неактивна

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и биотехнологии и касается штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС). Описанный штамм выделен от коров, больных эфемерной лихорадкой КРС, и депонирован в коллекцию микроорганизмов ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером - «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП. Штамм репродуцируется в культуре клеток ВНК-21 в течение 2-3 суток и накапливается в титре от 5,5 до 6,0 Ig ТЦД₅₀/см³, сохраняет исходные характеристики при пассировании в культуре клеток ВНК-21 в течение 14 пассажей, на его основе получен антиген для серологических реакций и гипериммунные сыворотки крови к ВЭЛ КРС с активностью в реакции нейтрализации 1:8-1:16. Представленный штамм обладает высокой биологической и антигенной активностью в нативном виде и может быть использован для изготовления чувствительных и высокоспецифичных биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС. 2 ил., 11 табл., 7 пр.

Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота (ВЭЛ КРС) Ephemerovirus bovinum сем. Rabdoviridae, депонированный в коллекцию ФГУ «ВГНКИ» под регистрационным номером «ВНИИЗЖ-М» - ДЕП, для приготовления биопрепаратов для диагностики эфемерной лихорадки КРС.