Штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота для контроля иммуногенности вакцины Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 A61K39/225 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новый штамм вируса эфемерной лихорадки.

Известно несколько штаммов вируса эфемерной лихорадки (ЭЛ) в зарубежных странах: в Южной Африке выделены штам- мы В 57; 73/1 (Theodoridls et al.// Onderstepoort J. Vet. Res. - 1973, 40, 3, 77- 82), в Японии - Ymaguchy (Inaba// Bull. Off. Int. Eplz. - 1973. 79, 627-673).

Эти штаммы вируса ЭЛ вызывают заболевание с характерными для ЭЛ признаками, но не размножаются без предварительной адаптации в культуре клеток. Для адаптации их к культуре клеток требуется предварительное размножение в мозгу односуточных мышей, а затем 2-3- кратное пассирование в культуре клеток. После таких пассажей штаммы вируса теряют патогенность для КРС и становятся непригодными для контроля иммуногенности вакцин. Известен также штамм ВВ7721 (прототип) вируса ЭЛ, выделенный в Австралии (Tzlpori// Austr. Vet. J. - 1975, 51, 5).

Штамм ВВ7721, выбранный в качестве прототипа, патогенен для КРС и используется в качестве контрольного при испытании иммуногенности вакцины против эфемерной лихорадки. Недостатком штамма является то, что он не размножается в культурах клеток, нестабилен, хранится в виде вирулентной крови в жидком азоте и это усложняет его транспортировку.

В нашей стране до настоящего времени не был выделен вирулентный и иммуноген- ный штамм вируса ЭЛ, что затрудняло разработку средств специфической профилактики этого заболевания.

Целью изобретения является получение вирулентного штамма для контроля иммуногенности вакцины против эфемерной лихорадки крупного рогатого скота.

Цель достигнута путем выделения вируса на крупном рогатом скоте от больных животных в период эпизоотии эфемерной лихорадки в Монголии, проведения 5 последовательных пассажей на телятах 8-10-месячного возраста и адаптации к культуре клеток ВНК-21.

Полученный штамм № 80/М имеет преимущества перед известными зарубежными штаммами в том, что обладает более высокой патогенностью для крупного рогатого скота, что проявляется более коротким инкубационным периодом и более длительным течением заболевания, более выраженными клиническими признаками. Кроме того, в отличие от аналогов и прототипа, новый штамм без адаптации размножается в культуре клеток и может храниться

в лиофилизированном состоянии при температуре 4°С.

Штамм N 80/М хранится в коллекции лаборатории Музейные штаммы микроорганизмов Научно-исследовательского сельскохозяйственного института и имеет следующую характеристику.

Морфологические свойства. Вирус штамма № 80/М представлен частицами пулевидной формы. Средний диаметр основания вириона равен 90 нм, средняя длина - 140 нм. Вирус содержит РНК и имеет липид- содержащую мембрану с поверхностными шипиками. Толщина мембраны вириона 12

нм, высота поверхностных шипиков 16 нм, диаметр шипиков 5,5 нм, диаметр внутреннего компонента (РНК) 14 нм. Плавучая плотность в градиенте хлористого цезия равна 1,20 г/мл.

Вирулентные свойства(Рьо1Ь +признак). При внутривенном заражении крупного рогатого скста, буйволов и сайгаков в дозе 10000-20000 ТЦДзо вирус этого штамма вызывает резкий подъем температуры тела (до

40,7-42°С) на третьи-пятые сутки после введения, угнетение с отказом от корма, истечение из глаз, носа, иногда слюнотечение. Через одни-двое суток после подъема температуры тела появляется хромота, больные

животные обычно лежат и неохотно поднимаются. Часто ртмечают дрожание мышц заднебедренной группы или всего тела.

Культуральные свойства. Вирус штамма N5 80/М выращивается в культуре клеток

ВНК-21, вызывает хорошо выраженное ци- топатогенное действие (ЦПД) на 3-6 сут после заражения. В стационарных культурах клеток ВНК-21 вирус накапливается в титрах 103|0-103 5 ТЦДбО/см3, а в роллерных

культурах клеток ВНК-21 в титрах 1040-1045 ТЦДво/см . Размножается без предварительной адаптации, вызывает ЦПД в культурах клеток Vero и CV (TCvero + TCcv + признаки) и способен размножаться при

температуре 41°С (гст.41 + признак).

Антигенные свойства. При подкожном и внутривенном введении крупному рогатому скоту вызывает образование вируснейтра- лизующих, комплементсвязывающих и преципитирующих антител (Ад + признак).

Иммуногенные свойства. Штамм в дозе 1000 ТЦДэо создает стойкий иммунитет у телят (Im + признак).

Сохраняемость. В нативном состоянии вирус штамма № 80/М не снижает своей активности в течение 14 дней при 4 ± 2°С в лиофилизированном виде в присутствии 3% пептона, 2% лактозы и 0,1 % поливинилпирррлидона, его активность остается на исходном уровне при 4 ± 2°С в течение 12 месяцев, при минус 40-70°С 3 года.

Заявляемый штамм успешно использовался в межведомственных комиссионных испытаниях по проверке напряженности и длительности иммунитета у крупного рогатого скота, привитого сухой культуральной вирусвакциной против эфемерной лихорадки.

Пример. Для непосредственного использования лиофилизированный вирус заявляемого штамма разводят физраство- ром 1:10 и титрованием в культуре клеток Уегойли ВНК-21 определяют его биологическую активность (она должна быть не менее 10 ТЦДю/см3) и затем вводят его по 2 см3 внутривенно вакцинированным и контрольным животным. В ответ на введение вируса у контрольных (невакцированных) животных развивается на 4-6 сут. заболевание с выраженными, характерными для эфемерной лихорадки клиническими признаками (гипертермия, угнетение с отказом от корма, хромота, дрожание мышц заднебедрен- ной группы или всего тела).

Для получения очередной серии вирулентного вируса берут двух телят 8-12-месячного возраста и заражают их внутривенно вирулентным вирусом предыдущей серии. На высоте температурной PL ;кции от телят берут кровь в раствор ге- пирина из расчета 2 ед его на 1 мл крови, ее быстро охлаждают до 4°С и вносят по 5 см3 в 3-4 матраса с монослойной культурой клеток ВНК-21, в которые после удаления среды роста и ополаскивания раствором

Формула изобретения

40

Штамм вируса эфемерной лихорадки контроля иммуногенности вакцины.

0

5

5

0

5

0

Хенкса вносят по 50 см поддерживающей среды.

После двухчасового контакта при 37 ± 2°Синокулят удаляют, монослой трехкратно промывают раствором Хенкса и заливают 100 см3 поддерживающей среды Игла с 1 % сыворотки крупного рогатого скота. Матрасы продолжают, инкубировать при 37 + 2°С до появления ЦПД на 4-6 сутки. При поражении 60-70% клеток вируссодержащий материал собирают и заражают им сосуды с круговым монослоем. Культуральную вирус- содержащую жидкость, разведенную 1:10 поддерживающей средой, вносят по 300 см3 в трехлитровые сосуды с круговым монослоем культуры клеток ВНК-21, из которых удалена ростовая среда. Сосуды герметически закрывают резиновыми пробками и помещают в роллерный аппарат.

Выращивание вируса проводят при 37 ± 2°С при скорости вращения сосудов 10-12 об/ч. Сбор вируссодержащего материала из сосудов проводят через 3-6 сут. при поражении клеточного монослоя на 80-90%, Полученный вируссодержащий материал смешивают со стабилизирующей средой, состоящей из 3% пептона, 2% лактозы и 0,1% поливинилпирролидона, и лиофилизи- руют.

Вирулентный штамм № 80/М вируса ЭЛ депонирован под № 80 в ВГНКИ. Штамм может быть использован для контроля им- муногенности вакцины против эфемерной лихорадки.

(56) Trlporl S. et al. Studies on the development of a vaccine against bovine ephemeral fever. Austr. Vet. J.- 1975,51, p.5.

крупного рогатого скота ВГНКИ N 80 для

контроля иммуногенности вакцины.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии Целью изобретения яапяется штамм вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота для контроля иммуногенности вакцины Цель достигается использованием штамма вируса эфемерной лихорадки крупного рогатого скота ВГНКИ N 80. Штамм вызывает у крупного рогатого скота буйволов и сайгаков заболевание с характерными для эфемерной лихорадки признаками. Выращивается на перевиваемой линии клеток ВНК-21.