СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ РАКА И ПОТЕНЦИАЛЬНОЙ УСТОЙЧИВОСТИ ЗЛОКАЧЕСТВЕННЫХ КЛЕТОК К ГИПОКСИИ Российский патент 2012 года по МПК A61B10/02 G01N33/52 G01N33/483 

Изобретение относится к медицине, в частности к способам физического анализа биологических материалов, и может быть использовано для диагностики рака в цитологических образцах ткани и идентификации единичных злокачественных клеток с высокой устойчивостью к повреждениям в условиях гипоксии.

В настоящее время основным методом диагностики раковых (онкологических) заболеваний является патогистологический анализ архитектуры ткани, полученной при оперативном удалении опухоли, или образца биопсии. Однако такой анализ является длительным и чрезвычайно трудоемким и не всегда обеспечивает 100% надежность. Это может быть обусловлено как малым размером опухоли, так и отсутствием соответствующего оборудования и квалификацией медперсонала.

Известны способы цитологической диагностики заболеваний, основанные на классических методах окраски клеток и их внутриклеточных органелл, тестируемых при визуальном анализе. Определенным недостатком данных подходов является то, что их разрешающая способность не позволяет в ряде случаев дифференцировать ранние предраковые изменения, обусловленные появлением единичных опухолевых клеток, отличающихся повышенной устойчивостью к повреждениям, в частности к гипоксии. В этих случаях на помощь приходят более сложные методы окраски клеток, а также количественный, морфометрический анализ [Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. - М.: Медицина. 1990. - 384 с.; Автандилов Г.Г., Глухов Ю.К. и Шабалова И.П. Плоидометрическая диагностика предраковых процессов и рака шейки матки по цитологическим препаратам // Клиническая лабораторная диагностика. - 2004. - №3. - С.45-47; Новик В.И., Агроскин Л.С., Папаян Г.В. и др. Биометрические исследования в диагностике предопухолевых состояний и эндоцервикального рака // Архив патологии. 1989, №12, с.45-49; Погорелов В.М., Байдурин С.А., Капланская И.Б. и др. Морфометрические параметры злокачественных клеток при нелейкемических гемобластозах с первичным поражением лимфатических узлов // Гематология и трансфузиология. 1992, №3, с.5-10; Bittinger A., von Keitz A., Ruschoff J., Melekos M.D. Silver staining nucleolar organizer region in prostate cytology // Zentralbl Pathol. 1994. Mar. 140 (1): 103-6].

Однако в этих работах даются, как правило, усредненные, групповые морфометрические характеристики клеточных популяций в целом, что делает весьма затруднительным идентификацию единичных злокачественных клеток.

Известна работа В.И.Цыганкова, Н.П.Мельниковой Н.П. и Г.Л.Могилевой [Морфотипы железистого эпителия при добро- и злокачественных заболеваниях молочных желез // Клиническая лабораторная диагностика. 2004, №1. - С.43-45], в которой авторам, анализируя цитологический материал молочной железы, окрашенный 50% раствором азотнокислого серебра, удалось разделить популяцию ядер на 6 морфотипов, увязав их с определенными клинико-морфологическими диагнозами. Показано, что для рака молочной железы характерны морфотипы ядер, не встречающиеся при дисплазиях, и на этом основании высказывается мнение, что их обнаружение может указывать на наличие рака. Данный подход имеет интерес для диагностики, когда среди массива доброкачественных клеток присутствуют единичные злокачественные клетки.

Недостатком же данного способа является то, морфометрические параметры даны для клеток пунктатов молочной железы, что исключает их использование для анализа цитологических препаратов других видов форм онкологических заболеваний.

Известен способ диагностики рака с помощью онкомаркеров, основанный на повышении или снижении синтеза тканеспецифических онкобелков; или экспрессии в опухолевых тканях белков, характерных для эмбрионального периода развития организма [Белохвостов А.С., Румянцев А.Г. Онкомеркеры: Молекулярные, генетические, иммунохимические и биохимические анализы. Пособие для врачей. - М.: МАКС Пресс, 2003, 91 стр.]. Однако этот способ не пригоден для выявления злокачественных опухолей, для которых онкомаркеры еще не выявлены или когда предложенный онкоген не обладает достаточный высокой тканевой онкоспецифичностью. Например, мониторинг альфа-фетопротеина (или фетальной формы альбумина) показан для диагностики и эффективности терапии первичной карциномы печени, но карциномы другой тканевой локализации не могут быть диагностированы с его помощью.

Кроме того, разрабатывается новый способ диагностики онкологических заболеваний, базирующийся на мониторинге генетических или эпигенетических маркеров, часто встречающихся лишь в строго определенных новообразованиях [Система генетических или эпигенетических маркеров в диагностике онкологических заболеваний (под редакцией Пальцева М.А., Залетаева Д.В.). М.: Медицина, 2007, 384 стр.].

Недостаток этого способа состоит в том, что он пока находится на стадии апробации и поиска более информационных маркеров, требуемых для диагностики ранних форм рака и достоверного прогноза течения заболевания в ответ на терапевтические воздействия.

Известен способ диагностики рака путем исследования прижизненной динамики клеток с помощью динамической когерентной фазовой микроскопии (патент РФ 2306868, опубликованный 27.09.2007). Способ заключается в том, что определяют интенсивность и спектральные характеристики флуктуации фазовой толщины ядрышек клеток и при наличии характерных спектральных компонентов в диапазоне 8,0-20,0 Гц диагностируют присутствие в образце клеток рака.

Недостаток этого способа состоит в том, что не показана эффективность его применения для разных форм рака с учетом их тканевой принадлежности и стадии развития.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому способу является способ флуоресцентной диагностики базальноклеточного рака кожи (см. патент РФ 2387376, опубликованный 27.04.2010), заключающийся в том, что больному с подозрением на базальноклеточный рак кожи на область поражения наносят флюорохром акридиновый оранжевый в концентрации 1:5000 с последующим изучением очага контактными объективами лк 25*0,75 в режиме флуоресценции в диапазоне 480-700 нм биомикроскопом ЛЮМАМ-ИЗ. Определяют опухолевые комплексы базальноклеточного рака кожи по участкам скопления интенсивно флуоресцирующих клеток на фоне зеленого свечения межклеточного вещества и коллагеновых волокон и диагностируют базальноклеточный рак кожи. Использование заявляемого способа позволяет: 1) исключить вероятность выставления ложноположительных и ложноотрицательных заключений; 2) провести исследование с минимальной травматичностью для пациента; 3) выявить комплексы опухолевых клеток, характерные для базальноклеточного рака прижизненно; 4) сократить сроки проведения диагностического исследования.

Недостатки этого способа состоят в том, что с его помощью изучаются лишь поверхностно расположенные опухолевые клетки и самому больному вводится краситель, интеркалирующий в ДНК/РНК и потенциально способный вызывать мутации.

Другим близким по технической сущности к предлагаемому способу является флуоресцентный низкотемпературный способ диагностики рака с высоким потенциалом к метастазированию (Xu H.N., Nioka S., Clickon J.D., Chance В., Li L.Z. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. J Biomedical. Optics, 2010, 15(3): 136010). При изучении эндогенной флуоресценции [окисленных флавинов (Ф) и восстановленных никотинамид динуклеотидов (NADH)] в образцах биопсии рака были обнаружены значительные флуоресцентные различия в центральных зонах высокометастазирующих опухолей молочной железы и меланомы в сравнении с образцами биопсии от низкометастазирующих типов опухолей той же тканевой локализации. Обнаруженные различия в спектральных характеристиках флуоресценции флавинов и NADH, позволили авторам во главе с профессором Чансом (Xu H.N., Nioka S., Clickon J.D., Chance В., Li L.Z. Quantitative mitochondrial redox imaging of breast cancer metastatic potential. J Biomedical. Optics, 2010, 15(3): 136010) предложить новый способ прогнозирования метастазов по параметрам флуоресценции в образцах биопсии от первичной опухоли.

Однако проведение таких исследований требует дорогостоящей спектральной аппаратуры, оснащенной приставкой для работы с замороженными образцами биопсии, необходимыми для их измерения параметров флуоресцентрии с высокой разрешающей способностью.

Техническая задача, на решение которой направлено предлагаемое изобретение, состоит в расширении арсенала способов, позволяющих диагностировать наличие раковых клеток на живых клетках без их окрашивания, упрощении способа и повышении его чувствительности.

Поставленная задача решена тем, что предложен способ диагностики рака и потенциальной устойчивости злокачественных клеток к гипоксии путем выявления в цитологических образцах, или биоптатах ткани клеток, обладающих способностью к неоднократно повторяющейся репарации пула восстановленных никотинамид динуклеотидов [NAD(P)H] в условиях, сохраняющейся гипоксии, которые обнаруживают по приросту интенсивности NAD(P)H флуоресценции после выдерживания исследуемого образца в темновых условиях, и по количеству циклов репарации NAD(P)H флуоресценции и величине прироста интенсивности NAD(P)H флуоресценции в каждом цикле оценивают потенциальную устойчивость различных опухолевых клеток к выживанию в условиях гипоксии, по которой судят о наличии злокачественных клеток и степени их устойчивости к гипоксии.

При этом условия гипоксии создают, например, путем помещения суспензии клеток или клеточного отпечатка в виде монослоя между двумя стеклами, края которых плотно запечатывают, в частности, расплавленным парафином с целью предотвращения контакта клеток с кислородом воздуха, а затем проводят спектрофлуорометрические исследования в диапазоне 440-470 нм при длине волны возбуждения 365-370 нм.

Сущность изобретения заключается в том, что экспериментальным путем были установлены принципиальные различия в потенциальной устойчивости опухолевых и нормальных клеток к выживанию в условиях гипоксии, оцениваемой в динамике по изменению интенсивности NAD(P)H флуоресценции и способности, присущей только раковым клеткам, частично восстанавливать пул NAD(P)H в темновых условиях.

Сущность изобретения поясняется графическими материалами, где на фиг.1 показана типичная кривая изменения суммарной интенсивности флуоресценции при λ=460 нм (I₄₆₀); характерная для перевиваемых мышам опухолевых клеток асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ), находящихся в условиях гипоксии при действии на них УФ-света (заштрихованные участки) и в темновых условиях (после выключения УФ-света; незаштрихованные участки).

Суммарная интенсивность эндогенной флуоресценции живых клеток (в полосе 440-470 нм) обусловлена флуоресценцией двух основных флуоресцентных компонентов: 1) флуоресцирующими продуктами перекисного окисления липидов (ФППОЛ), которые высокочувствительны к УФ-индуцируемой фотодеструкции [после 0,5-1 мин действия УФ-света (λ-365 нм), флуоресценция от ФППОЛ не обнаруживается] и 2) пулом восстановленных никотинамид динуклеотидов [NAD(P)H], интенсивность флуоресценции которых достигает максимальной в условиях гипоксии. Доля каждого из этих компонентов (в процентах) в общей полосе флуоресценции (с максимумом I₄₆₀), характерная для большинства опухолевых АКЭ клеток, указана на шкале ординат.

А - кинетика фотодеструкции флуоресценции (I₄₆₀) опухолевых АКЭ клеток при постоянном действии УФ-света (λ-365 нм).

В - репарация пула NAD(P)H, измеряемая по приросту интенсивности NAD(P)H-флуоресценции после нахождения гипоксических опухолевых АКЭ клеток в темновых условиях [т.е. без повреждающего действия УФ-света (λ-365 nm)]. Величина прироста I₄₆₀ (в процентах) после каждого цикла восстановления NAD(P)H флуоресценции обозначена величиной стрелок, направленных вверх.

На фиг.2 показаны кинетические особенности I₄₆₀ фотодеструкции лимфоцитов, выделенных из лимфоузла здоровых мышей и помещенных в условия гипоксии. Для нормальных лимфоцитов характерна перманентная фотодеструкция флуоресценции (при I₄₆₀), которая наблюдалась как при действии УФ-света (λ-365 нм) (заштрихованные участки), так и в темновых условиях (при выключении УФ-света; незаштрихованные участки). Величина I₄₆₀ фотодеструкции обозначена величиной стрелок, направленных вниз, что указывает на низкую устойчивость нормальных лимфоидных клеток в условиях гипоксии. Противоположный эффект характерен для опухолевых АКЭ клеток (Фиг.1), обладающих повышенной потенциальной устойчивостью в аналогичных условиях гипоксии. Обнаруженные различия между опухолевыми и нормальными клетками по потенциальной устойчивости к гипоксии могут быть использованы как для идентификации единичных опухолевых клеток с целью их диагностирования, так и для прогнозирования выживаемости опухолевых клеток в гипоксических зонах опухоли.

На фиг.3 - аналогичные исследования представлены для другого типа высокоагрессивных опухолевых клеток - асцитной гепатомы Зайделя (АГЗ), перевиваемой крысам [изучались АГЗ клетки, находящиеся в асцитной жидкости и при их метастазировании в селезенку, а также нормальные спленоциты, окружающие метастаз (фиг.4)]. Асцитные АГЗ клетки, а также АГЗ клетки метастаза (фиг.3) отличались высокой потенциальной устойчивостью к повреждающему действию гипоксии, так как они были способны в 3-5-кратному восстановлению пула NAD(P)H, оцениваемому по приросту интенсивности I₄₆₀ [величина прироста обозначена цифрами (в %) и отмечена стрелками, направленными вверх]. Время действия УФ-света на АГЗ клетки и их нахождение в темновых условиях обозначено в секундах на шкале абсцисс.

На фиг.4 - аналогичные спектрофлуоресцентные исследования клеток от тканевого отпечатка селезенки крысы-опухоленосителя (фиг.3), проведены в условиях гипоксии для спленоцитов, т.е. нетрансформированных клеток селезенки, окружающих клетки АГЗ метастаза. Такие спленоциты характеризовались низкой потенциальной устойчивостью к повреждающему действию УФ-света, так как для них обнаружена характерная перманентная фотодеструкция интенсивности флуоресценции NAD(P)H при λ=460 нм (I₄₆₀), выявляемая как при действии УФ-света, так и в его отсутствие (фотодеструкция интенсивности флуоресценции NAD(P)H при λ=460 нм на фиг.4 оказана в % по оси ординат).

На фиг.5 представлены результаты спектрофлуоресцентных исследований клеток [из биопсии подмышечного лимфатического узла пациентки (46 лет)], которые были диагностированы как раковые. В условиях гипоксии эти клетки проявляли способность восстанавливать NAD(P)H флуоресценцию в темновых условиях [при выключении УФ-света (незаштрихованные участки)], интенсивность которой измерялась по приросту I₄₆₀ (в %). Величина прироста I₄₆₀ обозначена стрелкой, направленной вверх. Количество циклов NAD(P)H флуоресценции в таких клетках было ограничено (1-2 цикла не более), что указывало на невысокую устойчивость этих клеток к гипоксии в сравнении с АГЗ клетками (фиг.3).

На фиг.6 представлены результаты спектрофлуоресцентных исследования той же суспензии клеток (из биопсийного материала пациентки), которые были диагностированы как нетрансформированные. Для этих клеток была характерна перманентная УФ-индуцируемая фотодеструкция I₄₆₀ как при действии УФ-света (заштрихованные участки), так и в отсутствие УФ-света (незаштрихованные участки). Для этих клеток также было обнаружено типичное увеличение содержания ФППОЛ (в %) и снижение доли базальной NAD(P)H флуоресценции I₄₆₀, шкала ординат).

Сущность изобретения поясняется также примером конкретного осуществления.

ПРИМЕР.

У больной К. (46 лет) с подозрением на развитие процессов метастазирования рака молочной железы в близлежащий лимфоузел был взят биопсийный материал (в виде клеточной суспензии) для цитологического и гистологического исследования.

Часть изъятого биопсийного образца была помещена во влажную охлаждаемую камеру с целью сохранения клеток во время их транспортировки в лабораторию. Исследования предлагаемым способом были проведены через 1,5 часа после изъятия клеточного материала. С этой целью изучаемую суспензию клеток помещали между предметным и покровными стеклами, края которых плотно запечатывали жидким парафином для создания условий гипоксии в изучаемых клетках. Далее на люминесцентном микроскопе МЛД-2, используя ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ-250-2 (источник УФ-света, λ-365 нм), проводили спектрофлуоресцентные исследования кинетики фотодеструкции I₄₆₀ в анализируемых клетках, находящихся в условиях гипоксии при действии на них УФ-света и при его выключении (темновые условия). Проводили поиск клеток, которые обладали способностью к репарации интенсивности NAD(P)H флуоресценции (I₄₆₀) в темновых условиях. Такие клетки диагностировались авторами как раковые [(фиг.5), эффект указан стрелкой, направленной вверх)]. Другие же клетки, для которых была характерна перманентная УФ-индуцируемая фотодеструкция как при действии УФ-света, так и в его отсутствие диагностировались как нетрансформированные (фиг.6). Полученные результаты представлены на фиг.5 и фиг.6. Как видно из фиг.5 и фиг.6, в условиях сохраняющейся гипоксии среди анализируемых клеток были обнаружены клетки (фиг.5), способные к приросту интенсивности NAD(P)H флуоресценции (I₄₆₀) в темновых условиях, что позволяло идентифицировать их как злокачественные опухолевые клетки. Эти клетки обнаруживали единичные циклы репарации NAD(P)H флуоресценции в темновых условиях (единичная стрелка вверх), что позволяло их идентифицировать как раковые клетки, хотя они и не обладали столь высокой потенциальной устойчивостью к гипоксии как высокозлокачественные АГЗ клетки (фиг.3).

Большинство анализируемых клеток в биопсийном образце пациентки не проявляло способность к репарации NAD(P)H флуоресценции в темновых условиях (фиг.6), что позволяло их отнести к нетрансформированным клеткам.

Диагноз затем был подтвержден гистологически.

Таким образом, проведенные исследования, результаты которых отражены на фиг.1-6, подтверждают возможность выявления даже единичных злокачественных клеток по их потенциальной устойчивости к гипоксии (выживаемости) в темновых условиях.

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкологии. Для диагностики рака и потенциальной устойчивости злокачественных клеток к гипоксии из образца биопсии готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, которым создают условия гипоксии, и проводят спектрофлуорометрическое исследование этих клеток в динамике развития процесса фотодеструкции NAD(P)H флуоресценции. По приросту интенсивности флуоресценции NAD(P)H в темновых условиях судят о наличии опухолевых клеток и их потенциальной устойчивости к гипоксии. Условия гипоксии создают путем помещения суспензии клеток или клеточного отпечатка между двумя стеклами для цитологических исследований. Спектрофлуорометрическое исследование проводят в диапазоне 440-470 нм при длине волны возбуждения 365-370 нм. Способ позволяет диагностировать рак и потенциальную устойчивость злокачественных клеток к гипоксии. 2 з.п. ф-лы, 6 ил., 1 пр.

1. Способ диагностики рака и потенциальной устойчивости злокачественных клеток к гипоксии, заключающийся в том, что из образца биопсии готовят клеточный отпечаток или суспензию клеток, которым создают условия гипоксии и проводят спектрофлуорометрическое исследование этих клеток в динамике развития процесса фотодеструкции NAD(P)H флуоресценции, и по приросту интенсивности флуоресценции NAD(P)H в темновых условиях судят о наличии опухолевых клеток и их потенциальной устойчивости к гипоксии.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что условия гипоксии создают путем помещения суспензии клеток или клеточного отпечатка между двумя стеклами для цитологических исследований.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что спектрофлуорометрическое исследование проводят в диапазоне 440-470 нм при длине волны возбуждения 365-370 нм.